In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

Summary

O protocolo para a imagem latente longitudinal dinâmico e lesão seletiva a laser de terminações nervosas em repórter camundongos transgênicos é apresentado.

Abstract

Terminações nervosas na pele estão envolvidas em processos fisiológicos, tais como detecção de ^1, bem como em processos patológicos tais como a dor neuropática ^2. Seu posicionamento close-to-superfície facilita a imagem microscópica de terminações nervosas da pele na vida animal intacto. Utilizando microscopia multifóton, é possível obter imagens finas superando o problema de dispersão de luz forte do tecido da pele. Repórter ratinhos transgénicos que expressam EYFP sob o controlo do promotor Thy-1 (incluindo os neurónios na periferia neurónios sensoriais) são bem adequados para os estudos longitudinais de terminações nervosas individuais durante longos períodos de tempo até vários meses ou até mesmo ao longo da vida. Além disso, utilizando-se o mesmo laser femtosecond como para a criação de imagens, é possível produzir lesões altamente selectivos de fibras nervosas para os estudos sobre a reestruturação da fibra nervosa. Aqui, apresentamos um protocolo simples e confiável para multiphoton longitudinal in vivo de imagens emicrocirurgia laser baseado no rato terminações nervosas da pele.

Introduction

Terminações nervosas cutâneas sofrer alterações dinâmicas em diferentes estados fisiopatológicos. As fibras nervosas podem passar pelo processo de degeneração e regeneração ou reestruturação no curso de doenças como neuropatia periférica ² ou Morton neuroma ^3. Após lesão traumática, uma parte importante de terminações nervosas na pele é dinâmica reinervação da área danificada. No entanto, a abordagem comum para a investigação de terminações nervosas é ex vivo cortes histológicos que carece de informações em tempo real sobre os processos em curso ^4. Usando marcadores fluorescentes codificados geneticamente, é possível acompanhar as terminações nervosas na pele de animais vivos, obtendo informação rica e significativamente mais relevantes sobre as mudanças estruturais. A investigação de terminações nervosas cutâneas é possível usando microscopia de fluorescência convencional, no entanto, a dispersão de luz forte do tecido da pele prejudica fortemente a qualidadedos dados adquiridos ^5. Microscopia multiphoton permite a aquisição de imagens de alta resolução nos tecidos fortemente espalhamento devido à soma não-linear de energia de fótons de luz de excitação, resultando em emissão de fluorescência só do ponto focal da objetiva. Este efeito conduz a um forte aumento da profundidade de penetração e melhoria da relação sinal-ruído para a medição em tecidos da pele ^6. Usando o mesmo laser como de imagiologia, é possível produzir dissecção selectiva das fibras nervosas ^7. No seguinte protocolo que mostram o método de imagiologia longitudinal de terminações nervosas cutâneas in vivo em ratos transgénicos repórter combinado com lesão selectiva a laser disponíveis no comércio usando sistema multifóton microscópio.

Protocol

Procedimentos que envolvem seres animais foram aprovados pelo Conselho Experiment Animais Nacional, na Finlândia.

1 Preparação animal for Imaging

1. Anestesiar um rato por intraperitional (IP) de injecção de cetamina (0,08 mg por quilo de peso corporal) e xilazina (0,01 mg por peso corporal). Verifique a anestesia com o reflexo toe pitada traseiro.
2. Mergulhe os olhos de animais em colírio (Viscotears) para proteger os olhos de desidratação.
3. Coloque o mouse sobre uma almofada de aquecimento (Supertech) a 37 ° C para evitar a hipotermia.
4. Limpe a almofada do pé designada para imagens com etanol 70%.
5. Adicionar uma gota de água sobre a pele da almofada do pé para o acoplamento entre a imersão da pele e tampa de vidro.
6. Coloque o material de embalagem de plástico sob a pata traseira que é posicionada sob um anel de metal com classe de cobertura.
7. Ajustar a espessura do material de embalagem de plástico para achatar a pele.
8. Coloque uma gota de água sobre as glas coberturas para imersão entre tampa de vidro eo objetivo.

2. metal Fixador Anel Preparação

1. Para a estabilização da pele utilizar o fixador de metal. Usamos protegido-Design Community fixador de duas asas com um anel de metal (cortesia de Neurotar Ltd, Finlândia). Encha a seringa com supercola, coloque a pequena gota de supercola através da agulha no anel e espalhe delicadamente a cola para cobertura uniforme da superfície do anel. É crítico para colocar a quantidade mínima de cola, que é apenas necessário para uma cobertura uniforme, porque a quantidade excessiva de cola pode reduzir o campo de visão e a obstruir imagem subsequente.
   NOTA: Como alternativa a combinação de uma barra de metal (por baixo) e lâmina de vidro de microscópio padrão (como uma tampa) pode ser usado para achatar a pele e para assegurar o acoplamento óptico correcto do conjunto ^14. Dois grampos de papel pode ser usado para fixar a pata entre o vidro ea superfície barra metálica (Figura 4
2. Cubra o anel com cobertura deslizante microscópio (5 mm de diâmetro, Microscopia Eletrônica de Ciência).
3. Parafuso no anel fixador para a barra de metal rígido que é montaged no palco motorizado microscópio.

3. Imagem Procedimento

1. No caso da utilização de ratinhos Thy1-YFP-H, escolher a parte azul do espectro da lâmpada de fluorescência para visualizar as fibras nervosas. Encontre o nervo de interesse no modo de epifluorescência e se concentrar nele.
2. Anote as coordenadas de um local para geração de imagens longitudinal. Use uma almofada do carpo como um ponto de referência. Durante as seguintes sessões de imagem, detectar pela primeira vez a almofada do carpo e, em seguida, encontrar as mesmas fibras nervosas grandes upstream e voltar usando as coordenadas salvas. É essencial para a posição da almofada do pé na mesma direcção perpendicular à barra de metal para manter o mesmo sistema de referência.
3. Ative o modo de dois fótons. Para os murganhos Thy1-YFP-H, que é adequado para utilizar o comprimento de onda de 950 nm de radiação laserpara visualizar as fibras nervosas.
4. Selecione comprimento de onda do laser e emissão canais (450-480 nm para detecção segunda geração harmônica, 520-550 nm para imagens de nervos YFP-rotulados e 580-630 nm para a detecção de fluorescência YFP e autofluorescência do cabelo), comece com baixa de potência do laser (3-5%) para evitar que o fotodano e branqueamento. A tensão típica nos tubos fotomultiplicadores é de 600-700 V para este tipo de imagem.
5. Defina a resolução desejada (512 x 512 ou 640 x 640 para medições de eventos rápidos, 800 x 800 ou 1024 x 1024 para imagens morfológica), passo axial (1-3 mm), espessura da amostra e os intervalos de tempo (1-10 min). O tempo de exposição é da ordem de 1 ms por um pixel.
6. Primeiro marcar os limites superiores e inferiores do volume de imagens no software.
7. Adquirir a pilha de imagens de referência para a referência antes da lesão. Quando necessário, é possível gravar a linha de base durante vários minutos.
8. Depois de imagens limpa a almofada com um tecido e colocar o mouse em uma caixa de recuperação a 36 ° C até que esteja completamente desperto.
   NOTA: Geralmente, a duração de uma sessão de imagens combinada com lesão induzida por laser (ver abaixo) não seja superior a 1 hora. Recomendamos verificar se o animal está profundamente anestesiados cada 10-15 min; este não deve interferir com a imagem em si, mas deve ser considerado ao procedimento experimental é planejado. A duração do efeito de uma única dose de cetamina / xylazyne é de cerca de 30 a 40 minutos, assim, é recomendável a aplicação adicional de ¼ a ½ dose após 25-30 min.
   NOTA: Deve-se considerar também que a experimentação é o planejamento que a frequência de sessões de imagem para um animal não deve exceder 1 sessão por dois dias para evitar os efeitos adversos da reanestesia competitivo.

4. Laser Lesão

1. Depois de adquirir a imagem da pilha de referência, utilize o protocolo de branqueamento de fazer uma lesão micro.
2. Aumentar a potência de laser de 100%.
3. Aumentar o tempo de exposição a 100-1.000 ms por região de interesse (100-1,000x mais do que no caso de imagem padrão).
4. Delinear a área da lesão.
5. Adicione a lesão por ligar o branqueamento.
6. Alterne de volta para o modo de imagem normal e continuar com as gravações time-lapse.

5 Processamento de Dados e Análise

1. Prossiga com desmistura usando de Mistura Espectral plugin no ImageJ ⁸ (Joachim Walter, http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
2. Abra a pilha de imagens e dividir os canais.
3. Encontre a área livre dos nervos ou cabelo para as medições de fundo. Coloque uma região of interesse nessa área.
4. Delinear cuidadosamente a parte do cabelo em que é claramente distinguível dos nervos.
5. Esboço do nervo na parte da imagem em que está separado do cabelo.
6. Salve desmistura matriz.
7. Aplicar matriz desmistura medida para toda a pilha.
8. Salve as novas pilhas de imagens processadas em formato * .tif.

Representative Results

Usando a técnica descrita, é possível controlar a mesma fibra após a lesão e para estudar a degradação das terminações nervosas danificadas (Figura 1). Aquisição da pilha com a espessura de 120-150 uM é geralmente adequado para a criação da imagem repetitiva durante vários dias, de modo a manter toda a fibra no campo de visão.

A lesão pode ser produzido tipicamente de forma concisa, quando o material de embalagem de plástico é ajustado para achatar a pele, de modo que as camadas de colagénio aparecem com intensidade uniforme na imagem (Figura 2). As terminações nervosas acima da camada de colagénio são os mais adequados para produzir a lesão preciso.

No caso da pele não é achatada, a imagem pode ocorrer a esbater-se (Figura 3). A intensidade desta situação pode ainda ser adequado para investigações morfológicas das fibras nervosas, mas o procedimento de laser lesão iria ser prejudicado.

Figura 1 Tempo faixa do efeito da lesão do laser na fibra do nervo apresentado como imagens máximos de projecção. As imagens superiores mostram a fibra antes e imediatamente após a lesão, o painel inferior mostra a mesma fibra depois de 30 min e 10 dias (para a esquerda e painéis da direita, de forma correspondente). Há alguns YFP expressando estruturas de natureza não-neuronal que aparecem 10 dias após lesão. Estas estruturas são susceptíveis de ser queratinócitos que são conhecidos por expressar genes Thy1 transitoriamente sob condições traumáticas. A fluorescência de YFP de fibras nervosas é mostrada a amarelo. Uma seta indica a região da lesão. Barra de escala 30 mm.

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2 imagem de projeção máxima figura de terminações nervosas na área de pele achatada. A fluorescência YFP de fibras nervosas é mostrado em amarelo, a geração de segundo harmônico do colágeno é mostrado em azul. Barra de escala 50 mm.

Figura 3 As terminações nervosas na área curva da pele obtido como um z-projeção máxima para várias secções ópticas. A fluorescência YFP de fibras nervosas e autofluorescência do cabelo é mostrada em amarelo, a geração de segundo harmônico do colágeno é mostrado em azul. Barra de escala 50 mm.

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Figura 4 O procedimento de fixação da pata utilizando a lâmina de vidro de microscópio como uma tampa. A lâmina é preso à barra de metal usando grampos de papel convencionais.

Discussion

Neste protocolo de vídeo que demonstrar o método não-invasivo para longitudinal dois fótons de terminações nervosas individuais.

A dinâmica de inervações da pele é afetada em doenças como psoríase e neuropatia periférica ^2, e em lesões traumáticas ^9. Dois fótons permite a análise detalhada das estruturas de fibras nervosas na matriz de colágeno. A utilização de ratinhos transgénicos repórter ajuda a evitar os problemas relacionados com a coloração das fibras nervosas. Thy1-YFP-H cepa parece ser suficientemente robusto para a análise de dados morfológicos ^{de 10} enquanto que os camundongos Thy1-mitoCFP pode constituir uma oportunidade de estudos funcionais da dinâmica mitocondrial nas fibras nervosas ^11. A linha YFP-16 / ICR pode ser utilizado para a observação de corpos de Meissner ^12. A abordagem alternativa pode ser a injecção de vírus em gânglios da raiz dorsal para o rastreamento selectiva de populações neuronais específicas13.

Vale a pena notar que a produção de lesão seletiva dentro da matriz de colágeno é fortemente prejudicada em comparação com as camadas superiores da pele. É por isso, por vezes, os tempos de exposição para a dissecação de fibras nervosas pode variar tanto quanto dez vezes, enquanto a intensidade de fluorescência para a imagem difere na gama de 10-20%. Para manter uma boa qualidade de imagem do acoplamento de imersão constante tem que ser mantida.

A resolução da imagem geralmente depende da velocidade de aquisição desejável. Tempo típico para a produção de uma pilha Molduras- 30 com resolução de 800 x 800 pixels é 1 min, para que se possa diminuir a resolução ou a espessura da área imageada de detectar mudanças rápidas ou aumentar a resolução para Fina morfológicas estudos.

A fixação da pata deve ser apertado o suficiente para não permitir que a deriva da imagem, mas, ao mesmo tempo, não deve afetar a circulação sanguínea em tele pele. Para a otimização do procedimento, injeções de traçadores vasos sanguíneos (por exemplo, TexasRed marcado 70 kDa dextrano) são possíveis, permitindo que se possa ajustar a pressão plástico material da embalagem através de monitoramento do fluxo de sangue. Artefatos de movimento na preparação descritos neste protocolo é improvável porque o animal está profundamente anestesiados, a própria pata está firmemente ligado ao conjunto de fixação, e porque batimentos cardíacos e movimentos respiratórios não são transmitidos directamente à pata. No entanto, movimentos leves são possíveis, especialmente se imagens de alta ampliação é realizada. Neste caso, recomendamos o uso de plugins ImageJ destinadas a compensar artefatos de movimento.

A imagem repetitiva da mesma área pode ser conseguido através da utilização de pontos de referência tais como almofada de carpo ^14, ou no caso de injecção de algumas substâncias na pata o local de injecção pode servir como um ponto de referência ^6. A outra possibilidade é a tatuagem da pele.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782