Summary
Le circuit de l'alimentation chez la drosophile larves melanogaster propose un modèle simple mais puissant qui permet de modifier la fréquence d'alimentation pour être en corrélation avec des modifications dans les circuits neuronaux stomatogastrique. Ce circuit est composé de neurones sérotoninergiques centraux qui envoient des projections vers les crochets buccaux ainsi que l'intestin antérieur.
Abstract
Le circuit d'alimentation sérotoninergique chez Drosophila melanogaster de larves peut être utilisé pour étudier les substrats neuronaux d'une importance critique au cours de la mise au point du circuit. Utilisation de la sortie fonctionnelle du circuit, l'alimentation, les changements dans l'architecture neuronale du système stomatogastrique peut être visualisée. Le comportement alimentaire peut être enregistrée par l'observation du taux de rétraction des crochets de la bouche, qui reçoivent l'innervation du cerveau. comportement locomoteur est utilisé en tant que contrôle physiologique pour l'alimentation, étant donné que les larves utilisent leurs crochets de la bouche à parcourir à travers un substrat de gélose. Les changements dans le comportement alimentaire peuvent être corrélées avec l'architecture axonale des neurites innervant l'intestin. Utilisation de l'immunohistochimie, il est possible de visualiser et de quantifier ces modifications. Une mauvaise manipulation des larves pendant paradigmes de comportement peut modifier les données car ils sont très sensibles aux manipulations. Imagerie appropriée de l'architecture des neurites innervantl'intestin est critique pour la quantification précise du nombre et de la taille des varicosités ainsi que de l'étendue de noeuds de branche. L'analyse de la plupart des circuits de permettre seulement à la visualisation de l'architecture des neurites ou des effets comportementaux, mais ce modèle permet de corréler la sortie du circuit fonctionnel avec les déficiences de l'architecture neuronale.
Introduction
Drosophile est un système modèle extrêmement puissant pour étudier le développement des circuits neuronaux en raison du temps de génération rapide, à faible coût expérimental, et la capacité de manipuler et contrôler les facteurs génétiques et environnementaux. Neurogenèse, recherche de chemin neuronal et la synaptogenèse sont conservés entre l'homme et la drosophile, par conséquent les mécanismes de création, le maintien et la modification des circuits de neurones sont conservés ainsi.
Neurotransmetteurs classiques, tels que la sérotonine (5-hydroxytryptamine ou 5-HT) peuvent servir de facteurs de croissance avant l'adoption de leurs rôles en tant que molécules de signalisation dans le circuit neuronal maturité 1-3 Des études antérieures ont montré que les niveaux perturbée 5-HT au cours de l'embryogenèse modifier la connectivité des neurones matures 4. D'autres ont montré que l'application ectopique de la 5-HT aux neurones en culture Helisoma réprimer la croissance des neurites ainsi que la synaptogenèse 5-7. En Drosophila, développement des niveaux de 5-HT sont en relation inverse avec le nombre et la taille des varicosités ainsi que le degré de aborization, le long de la longueur des neurites en saillie à partir de l'intestin antérieur du SNC 8.
Neurotransmission sérotoninergique a été montré pour moduler les comportements alimentaires dans diverses espèces, y compris chez la drosophile 9.8. Le circuit d'alimentation de la drosophile est un circuit relativement simple qui peut être utilisé comme modèle pour mettre en corrélation la sortie fonctionnelle (d'alimentation) avec des modifications dans la mise au point des projections axonales à partir du cerveau de l'intestin antérieur. Schoofs et al. ont montré que l'alimentation des larves de drosophile est régie par des générateurs de motifs centraux qui influencent la musculature 10. Bien que l'anatomie musculaire spécifique n'est pas complètement élucidé, il a été démontré que le nerf antennaire, nerf maxillaire, et le nerf accessoire prothoracic sont responsables des cibles musculaires impliqués dans lecomportement alimentaire. La plupart des données concernant la musculature et le nerf anatomie de l'alimentation des invertébrés est limité pour les larves de Calliphora.
Le taux d'alimentation des larves de deuxième stade peut être évaluée par la rétraction des sclérites cephalopharyngeal (bouche crochets), et est reproductible et à haut débit. Les plaques cephalopharyngeal sont innervés par les fibres du centre de neurones 5-HT par l'intermédiaire du nerf frontal. Le proventricule, ou l'intestin antérieur, est innervée par des fibres sérotoninergiques (recurrens nerf) qui fasciculés dans l'intestin moyen et sont responsables de contractions de l'intestin antérieur (figure 1) 11-12. Les changements dans la ramification axonale, et le nombre et la taille des varicosités le long de la longueur des neurites, peuvent être quantifiés en utilisant des techniques d'immunohistochimie. La manipulation de la 5-HT neuronale au cours du développement, soit directement, soit indirectement, peut modifier la sortie fonctionnelle de ce circuit d'alimentation, qui peut être évalué et en corrélation avec l'évolution de la morphogy de l'architecture des neurites.
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Protocol
Une. Entretien de Cages Population
- Maintenir les cages de la population à 25 ° C sur un cycle lumière-obscurité de 12 h. Tant que les groupes témoins et expérimentaux sont exposés aux mêmes conditions d'éclairage, alors cette technique peut être réalisée dans un environnement de laboratoire standard.
- Permettre aux femmes de nuit pondent des œufs sur les pommiers plaques jus-agar.
- Recueillir les larves nouvellement écloses par le maintien des plaques avec des oeufs nouvellement déposés à 25 ° C pendant 24 heures. Placer une petite cuillerée de levure dans le centre de la plaque d'attirer larves écloses.
- Recueillir 1 er stade larvaire qui ont migré dans la pâte de levure dans le centre de la plaque de jus de pomme. Utilisez une spatule en métal pour la transférer sur une plaque de jus de pomme frais. La pâte de levure supplémentaires peuvent être ajoutées pour assurer une alimentation suffisante il est jusqu'à ce que les tests sont réalisés. des plaques à base de jus de raisin peut également être utilisé à la place de plaques à base de jus de pomme.
- Obtenir la fin de 2 ème-début 3e stade larvae en permettant 1er larvaires à l'âge de 40-48 heures. Dans cette gamme les taux d'alimentation sont constants 13. L'âge peut être confirmé par un examen de la bouche des crochets comme il ya des changements distincts dans cette structure avec chaque mue larvaire.
- Late 2 3 ème stade larvaire précoce-ème sont recueillis pour des analyses de comportement par doucement et longuement lavage des plaques à base de jus de pomme à l'eau et à recueillir les larves sur un filtre à mailles. Les larves sont ensuite transféré dans une plaque de gélose.
- Toutes les analyses sont effectuées en parallèle en utilisant des animaux témoins et expérimentaux.
2. Paradigm comportementale - Locomotion
- Placez un seul 3 ème stade larvaire sur un substrat de gélose à 2% dans une boîte de culture de tissu de 100 mm et permettre à la larve de s'acclimater pendant 30 sec. Les larves utilisent leurs sclérites cephalopharyngeal (bouche crochets) pour propulser leur corps à travers la surface du substrat agar. Cela se fait sur une plaque séparée, parce que jet est plus difficile de visualiser les contractions du corps dans la solution de levure en tant que l'animal est pratiquement la même couleur que la levure.
- Observer et noter chaque postérieur au mouvement antérieur sur le substrat pour une période de 1 min. n = 20 pour chaque génotype. Pas plus de 10 animaux doivent être testés par plaque.
3. Comportement Paradigm - Alimentation
- Utilisation de mousses Inox # 5 pinces, transférer soigneusement la 3 ème stade larvaire de la plaque de gélose locomotrice au centre d'une plaque d'agar-remplie recouvert avec 5 ml de la solution de levure de boulanger 2% activé. Assurez-vous que la solution est homogène que la levure se dépose au fil du temps. Lorsque dans la solution de levure, les larves en grande partie rester en place et l'alimentation, ce qui facilite l'observation du comportement. Le taux de bouche contractions de crochet est en corrélation directe avec la quantité de nourriture ingérée 14.
- Laisser larve de s'acclimater pendant 30 sec.
- Observer et noter le nombre debouche contractions de crochet pour une période de 1 min. n = 20 pour chaque génotype.
4. Les dissections Gut larvaires
- Faire une solution de formaldéhyde de fixation 4% EM-grade 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et placer dans un verre de tache 3 puits.
- Disséquer soigneusement errant fin 3 e stade larvaire tripes dans un plat en verre de 3 puits en utilisant une solution PBS 1x, en s'assurant que chaque fois que le proventricule est laissée intacte. Avec une pince, tenir l'extrémité postérieure, et l'autre, maintenir les crochets buccaux. Tout en maintenant le immobile extrémité postérieure, tirez doucement sur la bouche des crochets pour accéder aux tripes. Retirez tous les tissus associés (glandes salivaires, le cerveau, le corps gras, etc), puis transférer chaque intestin à l'antenne 3 puits contenant le correctif de formaldéhyde. Errant 3 e stade larvaire sont utilisés parce que, à ce stade de développement, la larve cesse de s'alimenter en préparation pour la nymphose, et le proventricule est effacé de la levure. <li> Incuber tripes à 4 ° C pendant une nuit dans une boîte de culture de tissu opaque.
- Avant de retirer la solution de formaldéhyde de fixation des puits, enlever le caecum gastrique et couper l'intestin moyen ~ 150 um 2 du proventricule de sorte que les projections peuvent clairement être considérées sans obstacle.
- Retirer formaldéhyde solution dans les puits et les remplacer par 1x PBT (1x PBS, 0,1% de sérum albumine bovine libre de protéase, X-100 0,1% de Triton) solution tampon. Laver soigneusement les tripes 6x pendant 10 min dans 1x PBT. Placer les échantillons de tissus sur un rotateur mécanique tout en faisant des lavages.
- Incuber à 4 ° C pendant 1 h à 10 -6 M 5-HT pour améliorer la signalisation de la sérotonine. Laver soigneusement les tripes 6x pendant 10 min dans 1x PBT. Des études antérieures ont démontré que cette concentration de 5-HT exogène n'affecte pas l'architecture neuronale ou la densité de varicosités dans les analyses immunohistochimiques et augmente simplement le rapport signal à bruit de 15 à 16.
- Incuber à 4 et# 176; C pendant une nuit dans l'anticorps primaire anti-sérotonine (monoclonal dirigé à la souris ou au lapin polyclonal). Laver soigneusement les tripes 6x pendant 10 min dans 1x PBT. Placer les échantillons de tissus sur un rotateur mécanique tout en faisant des lavages.
- Incuber à 4 ° C pendant 90 min dans l'anticorps secondaire (Alexa Fluor 568 de chèvre anti-souris ou anti-IgG de lapin, dilution 1:400). Laver soigneusement les tripes 6x pendant 10 min dans 1x PBT. Placer les échantillons de tissus sur un rotateur mécanique tout en faisant des lavages.
- Incuber dans du carbonate de sodium 4 mM pendant 10 min sur un agitateur mécanique, puis monter à 4% de carbonate de sodium gallate/20 mM de n-propyle, et vue en fluorescence. Le carbonate de sodium est utilisé pour convertir les échantillons à la mémoire tampon et le pH utilisé dans le milieu de montage médias.
- Capturer des images d'échantillons de tissus immunocolorées à un grossissement de 400X pour analyse.
5. Analyse de Neural Circuits
- fibres de neurites ont été quantifiés (nombre et taille des variceset le degré de ramification) en utilisant Neuroleucida et Neuroexplorer. Toutefois, cela peut également être réalisée manuellement ou en utilisant Simple Neurites Tracer (une application qui peut être téléchargée en ligne gratuit).
- Tracer les projections de fibres individuelles du cerveau vers le proventricule et de quantifier le nombre de varicosités, les branches et le nombre de grandes varicosités par unité de longueur. Les fibres axonales saillie du cerveau sont regroupés dans le nerf recurrens et ne sont pas accessibles pour l'analyse jusqu'à ce qu'ils atteignent le proventricule où ils se séparent et fasciculées.
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Representative Results
Le circuit d'alimentation sérotoninergique dans la larve de drosophile peut servir de modèle extrêmement efficace pour observer l'influence de certains facteurs sur le développement du système nerveux. En quantifiant le taux d'alimentation, il est possible de relier l'architecture axonale du circuit d'alimentation dont la sortie fonctionnelle (figure 1). Le dosage locomotrice est utilisé en tant que contrôle physiologique pour les rétractions de la bouche des crochets, étant donné que les larves utilisent leurs crochets de la bouche pour se propulser à travers la surface de la gélose. Il devrait y avoir aucune différence dans les réponses locomotrices entre le contrôle et génotypes mutants si les mutations ne concernent que le circuit d'alimentation 8 (figure 2A). Si des différences importantes se produisent, il est possible que le comportement des larves a été compromise par une mauvaise manipulation. Si l'arrêt de larves au cours de l'essai pour tenter de creuser à travers le substrat agar, ils peuvent être trop vieux, et sont susceptibles transition à l'errance stades.Il est également possible que le substrat agar peut être trop dur, ce qui rend difficile pour les larves de la bouche des crochets pour attraper le substrat agar, ce qui peut être adressée en mouillant la surface de la gélose.
Ce dosage peut être utilisé pour évaluer si des souches de Drosophila avec des défauts anatomiques neuronales affectent le développement du circuit d'alimentation sérotoninergique. Le corps de l'ellipsoïde mutant ouverte (EBO 3) présente un défaut de structure dans le corps de l'ellipsoïde central complexe. La comparaison avec la souche parentale Canton-S de type sauvage, CS wu, révèle que ces défauts anatomiques durant résultat de développement du cerveau dans l'alimentation enfoncé pendant la locomotion n'est pas affectée (figure 2B).
Les anomalies anatomiques dans ebo 3 mutants semblent modifier le développement de l'architecture des neurites de l'intestin. Figure 3 montre les changements dans l'architecture de la fibre dans les larves sociétés ebo 3rouge avec CS wu; ces larves afficher une augmentation de la ramification, ainsi qu'une augmentation du nombre de petites et grandes varicosités le long de la longueur des neurites. Notez les noeuds de branche (flèches), varicosités (pointes de flèches), et de grandes varicosités (astérisques). Figure 4 représente la quantification de ces images.
Quantification correcte de l'architecture axonale exige que les images soient extrêmement clair. Figure 5A représente une image appropriée pour l'analyse. Images de moins bonne qualité, il sera difficile de faire la distinction entre la fibre et varicosités (figure 5B). Lorsque vous photographiez l'architecture des fibres, éviter de prendre des images qui comprennent les projections de la partie antérieure du proventricule, puisque les fibres sont étroitement regroupés et sont détachées de l'autre et peuvent apparaître comme si elles sont ramifiées. Plus de fibres postérieures dans l'intestin moyen sont plus ramifiés parce qu'ils fasciculés une fois un re dans l'intérieur de ce tissu. La quantification de la branche et le nombre de varicosités, et la taille des varicosités, peut être analysé manuellement ou via un programme conçu dans le but d'étudier la morphologie des neurites, comme Neuroleucida. Tant que le proventriculus n'est pas endommagé au cours du protocole immunohistochimique, et l'image est nette, les préparations seront acceptables pour l'imagerie et l'analyse. Si l'architecture de la fibre se distingue nettement de fond, et si varicosités individuels peuvent être identifiés le long de la longueur des neurites, la préparation est appropriée pour l'analyse. En outre, si des varicosités individuels peuvent être identifiés à partir du reste de la fibre, il s'agit également d'un autre indicateur d'une image de qualité pour analyse. Toutes les fibres sont analysés à l'exception de ceux qui hors de la plage de mise au point (dans certains cas, les fibres se courbe entre plusieurs plans de mise au point).
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Figure 1. Le circuit de l'alimentation des larves. Fileter un de 3 e stade larvaire montrant cerveau et l'intestin tissus (A). Tissus Gut disséqués du 3 stades larvaires ont été immunocoloré avec un anticorps dirigé contre la drosophile tryptophane hydroxylase neuronale (DtrG, B) ou 5-HT ( C). A, B. E, de l'œsophage; Mh, crochets buccaux; Pr, proventricule, Br, cerveau (notez le modèle de neurones 5-HT). Arrowhead désigne le nerf frontal; flèche, le nerf de recurrens C.. proventricule montrant des fibres axonales (pointes de flèche). Barre d'échelle = 20 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
<br /> Figure 2. Défauts anatomiques durant résultats de développement du cerveau dans le comportement alimentaire déprimé. Les animaux ont été testés pour locomoteur (A) et les comportements alimentaires (B). Locomotion n'a pas été affectée. n = 20 pour chaque test comportemental, 2-3 expériences indépendantes. **** P <0,0001, test t non apparié. Lignes au-dessus du graphique représentent l'erreur standard de la moyenne. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Anomalies anatomiques au cours du développement des résultats sur le SNC chez aberration dans l'architecture de la fibre de l'intestin. Des tissus de l'intestin disséqué à partir de 3 ème stade larvaire et immunocolorées avec des anticorps anti-5-HT. Flèche indique nœud de branche. Arrowhead désigne un petit varicosités. Asterisk denote importante varicosités. Barre d'échelle = 40 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. Défauts anatomiques durant résultat de développement du cerveau dans aberrant architecture de fibre de l'intestin. L'analyse des tissus proventriculaire du 3 stades larvaires disséqués et incubées avec anti-5-HT. Neurites de branchement (A), nombre total de varicosités par 0,1 mm de longueur des neurites (B) et le nombre de grandes varicosités (> 1 pm 2) par 0,1 mm de longueur (C). CS wu, 20 fibres de 17 courage de deux expériences indépendantes; ebo 3, 20 fibres de 18 courage de trois expériences indépendantes. **** P <0,0001, ** p <0,01, * p <0,05, tt non appariéLignes est. graphique ci-dessus représentent l'erreur standard de la moyenne. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 5. L'image de mauvaise qualité la qualité des images est important pour le bon dosage de l'architecture de la fibre de l'intestin. Tissus Gut disséqués de CS wu 3ème stade larvaire et méthode avec des anti-5-HT. (A). Bonne qualité d'image. (B).. Barre d'échelle = 40 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
Développement aberrant du circuit stomatogastrique sérotoninergique, qui se produit à la fin de l'embryogenèse, aura une incidence sur sa fonction mature. Les changements dans l'architecture des neurites innervant l'intestin peut être corrélée à la sortie fonctionnelle du circuit, qui est le taux d'alimentation (mesurée par la bouche contractions de crochet dans une solution de levure) (Figure 1). L'utilisation du système bipartite UAS-Gal4 chez la drosophile permet de cibler spécifiquement vers le haut ou vers le bas réglementés expression d'un transcrit donné à un tissu spécifique, les changements dans l'expression d'une protéine donnée peuvent être quantifiés précisément donné les outils appropriés. Cette technique peut être utilisée pour élucider les régions du cerveau, et même des sous-ensembles de neurones nécessaires pour le développement d'un circuit neuronal spécifique.
Le dosage locomotrice est utilisée pour confirmer que les larves sont pas autrement physiologiquement compromise et, par conséquent, avec 40 larves contractions de la paroi du corps ou moins shoULD être exclus des analyses (figure 2A). Cela peut se produire soit parce que le génotype provoque des anomalies physiques, ou parce que les animaux individuels ont été blessés lors de la manipulation. En outre, la température de la pièce dans laquelle le dosage est effectué doit être contrôlée, étant donné que des températures plus basses ou plus élevées peuvent affecter les données. Il est recommandé d'effectuer cette analyse de comportement entre 24-26 ° C. Les jours où la température de la chambre d'essai est plus froid, la gélose a tendance à durcir et, par conséquent, la ré-humidification de la plaque de gélose sera nécessaire après chaque dosage locomotive est complété afin d'assurer la gélose est suffisamment souple. Il est important de garder la plaque de gélose de locomotion humide (pas mouillé) afin de permettre aux larves de voyager à travers la surface et pour les empêcher de creuser. Les températures plus fraîches ont également un impact de la performance des larves sur le substrat de gélose, comme les larves ont tendance à voyager vers des températures préférentielles (24-26 ° C) 17-18. No plus de 10 animaux doivent être testés par plaque, et rejettent toute plaque avec des perforations dans le substrat agar.
Lors de l'essai de l'alimentation, il est important d'être conscient que la suspension de levure se dépose au fil du temps, de tourbillonnement de la levure sur la plaque assure la levure reste homogène tout au long de l'essai. La visibilité réduite des crochets buccaux peut survenir si la solution de levure devient trop concentrée. Larves saines placé dans le contrat des médias de levure leurs crochets de la bouche environ 150-170 fois par minute; réduction de l'alimentation peut être aussi bas que 120, et la limite supérieure est de 210.
Lors de l'exécution du protocole immunohistochimique, il est sage d'immunocoloration la fois le contrôle et les échantillons de tissus expérimentaux en parallèle pour assurer la qualité similaire d'échantillons de tissus. Immunofluorescence de l'architecture innervant le neurites de l'intestin peut être améliorée par l'incubation des échantillons de tissus dans l'anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C. L'incubation of anticorps à 4 ° C améliore le rapport signal à bruit (Figure 5). La qualité des images est très important, car cela est indispensable pour une quantification précise de l'architecture de la fibre (figure 3) pour révéler des changements dans la ramification et le numéro de varicosités, et la taille (figure 4). La qualité des échantillons de tissus peut être détruit si le dispositif de rotation utilisé pendant les périodes de lavage se réchauffe à n'importe quel point à partir de l'utilisation constante. Bien que l'imagerie des échantillons de tissus être sûr de ne pas laisser les échantillons sous la lumière du microscope pour trop longtemps car cela permettra de réduire le immunofluorescence des échantillons, pas seulement celui actuellement en cours de mise au point mais les échantillons environnantes ainsi. L'analyse de l'architecture de fibres peut être facilement réalisé à l'aide d'un logiciel, mais peut également être effectuée manuellement. Classification des petites et grandes varicosités se référer à la zone des varicosités, varicosités mesurant plus de 1 pm 2 sont considérés comme de grands varicosités.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Fonds de recherche du Président de l'Université de Saint Louis attribué à WSN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse E-800 Microscope | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have |
| Northern Eclipse | Empix Inc | Imaging software | |
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filter for specific secondary antibody |
| N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded | Nikon Instruments | MRH00400 | Objective used for imaging |
| Simple Neurite Tracer | NIH Image J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
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