Summary
초파리 유충의 먹이 회로는 공급 속도의 변화가 stomatogastric 신경 회로의 변화와 상관 관계가 될 수있는 간단하면서도 강력한 모델을 제공합니다. 이 회로는 입 후크 돌기뿐만 아니라 foregut 보내 중앙 세로토닌 성 신경 세포로 구성된다.
Abstract
초파리 유충에서 세로토닌 공급 회로는 회로의 개발 과정에서 매우 중요한 신경 기판을 조사하는데 사용될 수있다. 회로의 출력 기능을 이용하여, 수유, stomatogastric 시스템의 신경 구조의 변화는 가시화 될 수있다. 먹이는 행동은 뇌에서 신경 지배를받는 입 후크의 후퇴 속도를 관찰하여 기록 할 수 있습니다. 애벌레 한천 기판을 가로 질러 통과 할 자신의 입 후크를 사용하기 때문에 전위의 동작은, 먹이에 대한 생리 학적 제어로 사용됩니다. 먹이는 행동의 변화는 신경 돌기의 축삭 구조와 상관 관계 될 수있는 창자를 지배하는. 면역 조직 화학을 사용하여 이들 변경을 가시화하고 정량 할 수있다. 그들이 조작에 매우 민감로 행동 패러다임 동안 유충을 잘못 취급하면 데이터를 변경할 수 있습니다. 신경 돌기 아키텍처 지배하는 적절한 영상창자는 정확한 정맥류의 수와 크기의 정량뿐만 아니라 분기 노드의 범위에 대한 중요합니다. 대부분의 회로의 분석에만 신경 돌기 아키텍처 또는 행동 효과의 가시화를 허용하지만,이 모델은 하나의 연결 구조에 장애가있는 회로의 기능적인 출력을 상관시킬 수있다.
Introduction
초파리는 급속한 생성 시간, 저렴한 실험 비용 및 유전 적 및 환경 적 요인을 조작하고 제어하는 능력을 신경 회로의 개발을위한 연구 매우 강력한 모델 시스템이다. 신경, 신경 경로 찾기 및 시냅스는 인간과 초파리 사이에 보존되어 있으므로, 작성 유지하고 신경 회로를 수정의 메커니즘뿐만 아니라 보존됩니다.
세로토닌 (5 - 하이드 록시 트립 타민, 5-HT)와 같은 고전적인 신경 전달 물질, 성숙한 신경 회로 1-3 신호 분자로 자신의 역할을 채택하기 전에 성장 인자 역할을 할 수 있습니다 이전 연구는 성숙한 신경 세포 (4)의 연결을 변경 배아 동안 5-HT의 수준을 교란하는 것으로 나타났습니다. 기타 교양 Helisoma 신경 세포에 5-HT의 자궁외 응용 프로그램이 신경 돌기 가지뿐만 아니라 시냅스 5-7을 억제하는 것으로 나타났습니다. D에rosophila는 발달 5-HT 수준은 반비례 CNS (8)로부터 foregut에 돌출 신경 돌기의 길이를 따라 정맥류의 수와 크기뿐만 아니라 aborization의 정도와 관련된다.
세로토닌 신경 전달 초파리 8-9를 포함, 다양한 종류의 먹이 행동을 조절하는 것으로 알려져있다. 초파리 급전 회로 foregut에 뇌로부터 축삭 돌기의 발달의 변화와 기능적 출력 (급전)를 상관시키는 모델로서 이용 될 수있는 비교적 간단한 회로이다. Schoofs 등. 초파리 유충의 먹이가 근육 (10)에 영향을 미치는 중앙 패턴 발생기에 의해 조절되는 것으로 나타났습니다. 특정 근육 해부학이 완전히 이해되지 않지만, 그것은 더듬이 신경, 상악 신경, 그리고 prothoracic 액세서리 신경에 관련된 근육의 대상에 대해 책임이 있음을 보였다동작을 먹이. 무척추 동물 먹이의 근육과 신경 해부학을 포함하는 대부분의 데이터는 Calliphora 애벌레로 제한됩니다.
두 번째 령 유충의 먹이 속도는 cephalopharyngeal 경피 (입 후크)의 수축에 의해 평가하고, 재현성 및 높은 처리량입니다 수 있습니다. cephalopharyngeal 플레이트는 정면 신경을 통해 중앙의 5-HT의 신경 세포에서 섬유에 의해 신경 지배된다. proventriculus, 또는 foregut은 중장에서 총생 (그림 1) 11 ~ 12 foregut의 수축에 대한 책임은 세로토닌 섬유 (신경을 recurrens)에 의해 신경 지배한다. 축삭 분기의 변경, 및 신경 돌기 길이를 따라 정맥류의 개수 및 크기는, 면역 조직 화학적 기법을 사용하여 정량 할 수있다. 직접 또는 간접적으로 개발 중에 신경 5-HT를 조작하는 것은 morpholo 변화로 평가되고 상관 될 수있는이 급전 회로의 출력 기능을 변경할 수신경 돌기 구조의 GY.
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Protocol
1. 인구 케이지의 유지 보수
- 12 시간의 명암주기에 25 ° C에서 인구의 새장을 유지한다. 한 컨트롤과 실험군은 동일 조명 조건에 노출 될 때,이 기술은 표준 실험실 설정에서 수행 될 수있다.
- 여성은 사과 주스 한천 플레이트에서 하룻밤 알을 낳을 수 있도록 허용합니다.
- 24 시간 동안 25 ° C에서 새로 입금 계란 판을 유지하여 부화 된 유생을 수집합니다. 부화 유충을 유치하기 위해 판의 중심에 효모의 작은 덩어리를 놓습니다.
- 사과 주스 플레이트의 중앙에 효모 붙여 넣기로 마이그레이션 한 1 차 령 애벌레를 수집합니다. 신선한 사과 주스 플레이트를 전송하는 금속 주걱을 사용합니다. 그 밖의 효모 페이스트 분석법이 수행 될 때까지 적절한 식품가되도록 첨가 할 수있다. 포도 주스 플레이트는 사과 주스 플레이트 대신에 사용될 수있다.
- 후반 2 차 - 초 3 차 령 리터를 얻1 일이 40 ~ 48 시간 동안 나이 령충 수 있도록하여 arvae. 이 범위 내에서 공급 비율은 13 일정하다. 각 유충의 탈피와이 구조에 뚜렷한 변화가 있기 때문에 나이가 입 후크의 시험에 의해 확인 될 수있다.
- 늦은 2 차 - 초 3 차 령 유충은 부드럽게 광범위하게 물에 사과 주스 플레이트의 세척 및 메쉬 필터에 애벌레를 수집하여 행동 분석을 위해 수집됩니다. 유충은 다음 한천 플레이트에 전송됩니다.
- 모든 분석은 제어 및 실험 동물을 사용하여 병렬로 수행됩니다.
2. 행동 패러다임 - 로코 모션
- 100mm 조직 배양 접시에 2 % 한천 기판 상에 하나의 3 차 령 유충을 배치하고 유충은 30 초에 적응 할 수 있습니다. 애벌레는 한천 기판의 표면을 가로 질러 자신의 몸을 추진하기 위해 cephalopharyngeal 경피 (입 후크)를 사용합니다. 이것은 별도의 접시에 이루어 때문에t는 동물이 거의 효모과 같은 색으로 효모 용액 보디 수축을 시각화하기 더 어렵다.
- 1 분 동안 기판 상에 전방의 움직임에 각 후방을 관찰하고 기록한다. N = 각 유전자형 20. 더 이상 10 이상의 동물은 접시 당 정량되어야한다.
3. 행동 패러다임 - 수유
- 무딘 INOX # 5 핀셋으로 조심스럽게 2 % 활성화 빵 효모 액 5 ㎖로 겹쳐 한천 충전 판의 중앙에 전위 한천 플레이트에서 3 차 령 유충을 전송합니다. 효모는 시간이 지남에 따라 해결되므로이 솔루션은 동질 있는지 확인합니다. 때 효모 솔루션, 유충은 주로 행동의 관찰을 용이하게, 장소 및 사료에 남아있을 것입니다. 입 걸이 수축 속도는 직접적으로 23 섭취 음식의 양의 상관 관계.
- 유충은 30 초 동안 적응 할 수 있습니다.
- 관찰의 수를 기록1 분 동안 입을 걸이 수축. N = 각 유전자형 20.
4. 애벌레 인내심 해부
- 3 잘 자리 유리 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 및 장소에서 4 % EM-등급 포름 알데히드 고정 솔루션을합니다.
- 조심스럽게, 1X PBS 용액을 이용하여 3 - 웰 유리 접시에 늦게 3 차 령 유충의 내장을 방황 proventriculus가 그대로 유지되어 있는지마다 만드는 해부. 하나 forcep으로, 후방 끝을 잡고 다른 손으로, 입 후크를 개최합니다. 후방 끝 움직를 누른 상태에서 조심스럽게 용기에 액세스 할 입 후크를 잡아. 연관된 조직 (침샘, 뇌, 지방 시체 등)을 제거한 다음, 포름 알데히드 수정이 포함 된 3 - 잘 접시에 각각의 창자를 전송합니다. 3 차 령 유충을 방황으로 인해 개발이 단계에서, 유충이 pupariation에 대비 공급 중단 사용되며, proventriculus은 효모 삭제됩니다. <리> 불투명 한 조직 배양 상자에 4 ° C에서 하룻밤 용기를 품어.
- 우물에서 포름 알데히드 고정 솔루션을 제거하기 전에 위의 caeca를 제거하고 돌기가 명확 장애물없이 볼 수 있도록 proventriculus에서 ~ 150 μm의 2 중장 클립.
- 우물에서 포름 알데히드 수정 프로그램을 제거하고 1X PBT (1X PBS, 0.1 %의 단백질 분해 효소가없는 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X-100) 완충 용액으로 교체합니다. 철저하게 1X PBT에서 10 분 동안 용기에게 배의 세척. 세척하는 동안 기계적인 회전에서 조직 샘플을 놓습니다.
- 10 -6 M 세로토닌 신호를 강화하는 5-HT 1 시간 동안 4 ° C에서 알을 품다. 철저하게 1X PBT에서 10 분 동안 용기에게 배의 세척. 이전 연구는 외인성 5-HT의 농도가이 면역 조직 화학 분석에서 신경원 아키텍처 또는 정맥류 밀도에 영향을 미치지 않는다는 것을 증명하고 단순히 잡음비 15-16에 신호를 강화 하였다.
- 4 품어 &# 176; C 하룻밤 항 세로토닌 차 항체 (마우스 또는 토끼에서 제기 클론에서 제기 된 단일 클론)에서. 철저하게 1X PBT에서 10 분 동안 용기에게 배의 세척. 세척하는 동안 기계적인 회전에서 조직 샘플을 놓습니다.
- (; 1:400 희석 알렉사 플 루어 568 염소 항 - 마우스 또는 항 - 토끼 IgG를) 이차 항체에 90 분 동안 4 ° C에서 알을 품다. 철저하게 1X PBT에서 10 분 동안 용기에게 배의 세척. 세척하는 동안 기계적인 회전에서 조직 샘플을 놓습니다.
- 기계적 회에 10 분 동안 4 mM의 탄산나트륨에서 부화 한 후 n-프로필 gallate/20 MM의 탄산나트륨 4 %에서 마운트 형광에서 볼 수 있습니다. 탄산나트륨의 mountant 매체에 사용되는 버퍼와 pH로 샘플을 변환하는 데 사용된다.
- 분석을위한 400 배의 배율로 면역 염색 조직 샘플의 이미지를 캡처합니다.
5. 신경 회로의 분석
- 신경 돌기 섬유 (정량화 된 숫자와 정맥류의 크기및 분) Neuroleucida 및 Neuroexplorer를 사용하여. 그러나, 이는 수동으로 수행하거나 단순 신경 돌기 트레이서 (온라인으로 다운로드 할 수없는 애플리케이션)을 사용 할 수있다.
- proventriculus에 뇌에서 개별 섬유의 전망을 추적하고 정맥류 번호, 지점 및 단위 길이 당 큰 정맥류의 수를 정량화. 뇌로부터 돌출 축삭 섬유는 recurrens 신경에 번들 그들은 그들이 분리 proventriculus 및 총생에 도달 할 때까지 분석을 위해 액세스 할 수 없습니다 있습니다.
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Representative Results
초파리 유충에서 세로토닌 공급 회로는 신경계 발달에 특정 요인의 영향을 관찰 할 수있는 매우 효과적인 모델이 될 수 있습니다. 공급 비율을 정량함으로써, 그 기능의 출력 (도 1)와 급전 회로의 축삭 아키텍처를 연결하는 것이 가능하다. 유충은 한천의 표면을 가로 질러 자신을 추진하기 위해 입 후크를 사용하기 때문에 전위의 분석은, 입 후크의 철회에 대한 생리 학적 제어로 사용됩니다. 돌연변이는 공급 회로 (8) (그림 2A)에 영향을 경우 제어 및 돌연변이 유전자형 사이의 전위의 반응에 차이가 없어야합니다. 유의 한 차이가 발생 할 경우, 애벌레 행동이 부적절한 취급에 의해 손상되었다 할 수있다. 분석 기간 동안 애벌레 정지 한천 기판을 파고하려고하는 경우, 그들은 너무 오래된 일 수 있고, 가능성이 령충을 방황으로 전환됩니다.그것은 한천 기판이 어려운 애벌레 입 고리가 한천 기판을 잡아 위해 만드는 따라서, 너무 어려울 수 있습니다 또한 가능하다, 이것은 한천 표면을 습윤에 의해 해결 될 수있다.
이 분석은 신경 해부학 적 결함이 초파리의 변종이 세로토닌 공급 회로의 개발에 영향을 미치는 여부를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 열린 돌연변이 타원체의 몸은 (EBO 3) 중앙 단지의 타원체 몸의 구조 결함이 있습니다. 야생 형 부모의 캔톤-S의 변형, CS 우과의 비교는, 이러한 해부학 적 결함이 우울 먹이 두뇌 개발 결과 중 운동 (그림 2B) 영향을받지 않는 동안 것을 알 수있다.
3 돌연변이가 창자의 신경 돌기 아키텍처의 개발을 변경하는 표시 EBO의 해부학 적 결함. 그림 3 EBO 3 유충 안돼요 섬유 구조의 변화를 보여줍니다CS 우 빨간색 이들 유충 분기의 증가뿐만 아니라 신경 돌기의 길이를 따라 크고 작은 정맥류의 증가를 표시합니다. 분기 노드 (화살표)를 참고 (화살촉), 대형 정맥류 (별표) 정맥류. 그림 4는 이러한 이미지의 정량을 나타냅니다.
축삭 구조의 적절한 정량 이미지. 그림 5A는 분석에 적합한 이미지를 나타내는 매우 명확해야합니다. 가난한 품질의 이미지는 어려운 섬유와 정맥류 (그림 5B)를 구분하는 것입니다. 섬유 구조를 촬영할 때, 섬유 단단히 함께하고 서로 분리되어 그들이 분기하는 것처럼 나타날 수 있기 때문에 proventriculus의 앞쪽에 돌기를 포함 이미지를 복용하지 않도록. 그들은 총생 때문에 중장 이내에 사후 섬유는 더 많은 분기가되면 그들은 이 조직 내에서 다시. 분기와 정맥류 번호 및 정맥류의 크기의 정량은, 수동 또는 Neuroleucida 같은 신경 돌기 형태를 공부의 목적을 위해 설계 프로그램을 통해 분석 될 수있다. 한 proventriculus가 면역 프로토콜 중에 손상 및 이미지의 초점이되지 않기 때문에, 준비는 이미징 및 분석을 위해 허용 될 것입니다. 섬유 구조는 명확 배경으로부터 구별 할 수 있으며 개별 정맥류가 신경 돌기 길이를 따라서 식별 될 수있는 경우에, 제제는 분석을 위해 적절한 지. 개별 정맥류는 섬유의 나머지 부분에서 식별 될 수있는 경우에 또한, 이것은 또한 분석을위한 이미지 품질의 또 다른 지표이다. 모든 섬유는 이들의 예외와 함께 분석되고 그 초점 범위 (초점 평면 사이의 여러 경우에서 섬유 의지 커브) 중.
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그림 1. 유충의 먹이 회로. 뇌와 창자 조직 (A)를 표시하는 3 차 령 유충을 필렛. 3 차 령 애벌레에서 해부 인내심 조직은 초파리 신경 트립토판 수산화 효소에 대해 제기 항체로 면역 염색 하였다 (DTRH, B) 또는 5-HT ( C). A, B. E, 식도, 니켈 수소, 입 걸이, 홍보, proventriculus, 브롬, 뇌 (5-HT 뉴런의 패턴을 참고). 화살촉은 정면 신경을 지정,., recurrens 신경 C 화살표. proventriculus 축삭 섬유 (화살촉)를 표시합니다. 스케일 바 = 20 μm의. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
<BR /> 그림 2. 우울 급전 동작의 뇌 발달 결과 중에 해부학 적 결함. 동물 전위 (A) 및 공급 동작 (B)에 대해 분석 하였다. 운동은 영향을받지이었다. N = 2 ~ 3 독립적 인 실험에서 각 행동 분석 20. **** P <0.0001, 짝이 t-검정. 그래프 위의 선이 평균의 표준 오차를 묘사. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 창자 섬유 구조에서 수차 CNS 결과 3 차 령 애벌레에서 해부 및 안티-5-HT와 면역 염색. 창자 조직의 개발하는 동안 해부학 적 결함. 화살표 지점의 노드를 나타냅니다. 화살촉은 작은 정맥류를 나타낸다. 별표 드큰 정맥류를 말합니다. 스케일 바 = 40 μm의. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 탈선 창자 섬유 구조 해부 및 안티-5-HT와 함께 배양 3 차 령 유충에서 proventricular 조직. 분석의 두뇌 개발 결과 중 해부학 적 결함. 0.1 mm의 신경 돌기의 길이 (B)와 큰 정맥류의 수 당 총 정맥류의 신경 돌기 (A) 분기, 수 (> 1 ㎛ 2) 0.1 mm 길이 (C) 당. CS 우, 2 독립적 인 실험에서 17 용기 20 섬유, EBO (3, 3) 독립적 인 실험에서 18 용기 20 섬유. **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05, 짝 TT그래프 위의 추정 선이 평균의 표준 오차를 묘사. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 이미지의 품질은 창자 섬유 구조의 적절한 정량 중요합니다. CS 우 제 3 령 애벌레에서 해부 및 안티-5-HT와 면역 염색 창자 조직. (A). 좋은 품질의 이미지입니다. (B).별로 품질의 이미지입니다. 스케일 바 = 40 μm의. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
후반 배아 중 발생하는 세로토닌 stomatogastric 회로의 탈선 개발, 자사의 성숙한 기능에 영향을 미칠 것입니다. 신경 돌기 구조의 변화는 용기가 (효모 용액에 입 후크의 수축에 의해 측정) 비율을 공급하는 회로의 기능 출력 (그림 1)과 상관 관계가 될 수있다 지배하는. 초파리 UAS-인 Gal4 양자 시스템을 사용함으로써, 특히 특정 조직에 관련 증명서의 상향 또는 하향 조절 식을 대상으로 할 수있다; 관련 단백질의 발현의 변화를 정확하게 적절한 도구 관련 정량화 될 수있다. 이 기술은 뇌 영역, 및 특정 신경 회로의 개발에 필요한에도 신경 서브셋을 명료하게 할 수있다.
전위의 분석은 애벌레는 달리 생리적으로 손상되지 않음을 확인하는 데 사용됩니다, 따라서 40 체벽의 수축 이하 소와 유충자민련은 분석 (그림 2A)에서 제외 될 수있다. 유전자형이 실제 이상 원인이되기 때문에, 또는 개별 동물을 처리하는 동안 부상 때문에이 중 하나가 발생할 수 있습니다. 또한, 상기 분석이 수행되는 방의 온도는 냉각기 또는 따뜻한 온도 데이터에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 제어 될 필요가있다. 그것은 24 ~ 26 ° C. 사이에이 동작 분석을 수행하는 것이 좋습니다 시험 실내의 온도가 냉각 될 때 일에, 한천 경화하는 경향이 있으며, 각 기관차 분석은 아가가 충분히 부드러운 있도록 완료된 후에 따라서 한천 플레이트의 재 습윤이 요구 될 것이다. 그것은 애벌레 표면에 걸쳐 이동하고내는 것을 방지 할 수 있도록하기 위해 운동력 촉촉한 (젖은)에 대한 한천 플레이트를 유지하는 것이 중요하다. 애벌레는 우선 온도 (24 ~ 26 ℃) 17 ~ 18으로 여행하는 경향 쿨러의 온도는, 한천 기판에 애벌레의 성능에 영향을 미칠 수. NO 10 개 이상의 동물은 플레이트 당 정량, 한천 기판에 구멍 어떤 판을 폐기해야합니다.
공급 분석을 수행 할 때, 그것은 효모 현탁액은 시간이 지남에 정착 점에 유의하는 것이 중요하다, 접시에 효모의 소용돌이는 효모가 분석 전반에 걸쳐 균일 한 체재를 지킨다. 효모 액이 너무 집중이되면 입 후크의 시야를 감소가 발생할 수 있습니다. 효모 미디어 계약 분당 입 고리가 약 150 ~ 170 번에 배치 건강한 유충 감소, 먹이 (120)의 낮은 될 수 있으며, 범위 상한은 210입니다.
면역 프로토콜을 수행 할 때, 조직 샘플의 유사한 품질을 보장하기 위해 제어 및 병렬 실험 조직 샘플을 모두 immunostain하는 것이 현명하다. 신경 돌기 아키텍처에 분포 창자의 면역은 4 ℃에서 하룻밤 일차 항체에 샘플을 조직 배양에 의해 강화 될 수있다 배양 OF 4 ° C에서 항체는 신호 대 노이즈 비율 (그림 5)을 향상시킨다. 이 섬유 구조의 정확한 정량 분기 및 정맥류의 수와 크기 (그림 4)의 변경 사항을 공개하는 (그림 3)에 대한 중요한로 이미지의 품질은 매우 중요합니다. 세척 기간 동안 사용되는 회 전자를 항상 사용에서 어떤 시점에서 가열하면 조직 샘플의 품질을 파괴 할 수있다. 이미지하면서 조직 샘플이 샘플은 현재 초점 미만 만 아니라 주변의 샘플뿐만 아니라의 면역을 줄일 수로 너무 오래 현미경의 빛 아래에서 샘플을 남기지 않도록해야합니다. 섬유 구조의 분석은 쉽게 소프트웨어의 도움으로 완료 할 수 있지만, 여전히 수동으로도 달성 될 수있다. 크고 작은 정맥류의 분류는 정맥류의 영역을 참조보다 1 ~ 2 ㎛ 크기의 정맥류는 큰 정맥류로 분류됩니다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자는 WSN에 수여 세인트 루이스 대학에서 대통령의 연구 기금을 인정하고 싶습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse E-800 Microscope | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have |
| Northern Eclipse | Empix Inc | Imaging software | |
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filter for specific secondary antibody |
| N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded | Nikon Instruments | MRH00400 | Objective used for imaging |
| Simple Neurite Tracer | NIH Image J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
References
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