Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microfabricated चैनल में सेल प्रवास के अध्ययन

Published: February 21, 2014 doi: 10.3791/51099
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Immunité et Cancer, Institut Curie, 2Compartimentation et Dynamique Cellulaires, Institut Curie

Summary

एक आयामी सीमित microenvironment में कोशिकाओं की सहज प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक मात्रात्मक विधि वर्णित है. इस विधि microfabricated चैनलों का लाभ लेता है और एकल प्रयोगों में विभिन्न परिस्थितियों में कोशिकाओं की बड़ी संख्या के प्रवास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

विधि यहाँ वर्णित एक आयाम में प्रसूति के तहत सेल प्रवास के अध्ययन की अनुमति देता है. यह शारीरिक बाधाओं से कोशिकाओं को एक polarized फेनोटाइप थोपना जो microfabricated चैनलों के उपयोग पर आधारित है. आगे या पीछे ले जाने: अंदर चैनल एक बार, कोशिकाओं केवल दो संभावनाएं हैं. दिशात्मकता प्रतिबंधित है जिसमें इस सरल प्रवास कोशिकाओं की स्वचालित ट्रैकिंग और सेल आंदोलन का वर्णन करने के लिए मात्रात्मक मापदंडों की निकासी की सुविधा. इन मानकों प्रस्ताव के दौरान सेल वेग, दिशा में परिवर्तन, और विराम देता है शामिल हैं. Microchannels भी फ्लोरोसेंट मार्कर के उपयोग के साथ संगत कर रहे हैं और उच्च संकल्प पर सेल प्रवास के दौरान intracellular organelles और संरचनाओं के स्थानीयकरण अध्ययन करने के लिए इसलिए उपयुक्त हैं. अंत में, चैनलों की सतह चैनलों या haptotaxis के अध्ययन के चिपकने वाली संपत्तियों के नियंत्रण की अनुमति, विभिन्न substrates के साथ क्रियाशील किया जा सकता है. संक्षेप में, सिस्टम घंटेवर्णित पहले स्वतंत्र प्रयोगों को सामान्य बनाने और reproducibility की सुविधा, ज्यामिति और पर्यावरण के जैव रासायनिक प्रकृति दोनों नियंत्रित कर रहे हैं, जिनमें शर्तों में बड़ी सेल नंबर के प्रवास का विश्लेषण करने का इरादा है.

Introduction

प्रवासन विकास, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और ऊतक पुनर्जनन सहित बहुकोशिकीय जीवों में कई शारीरिक प्रक्रियाओं, के लिए महत्वपूर्ण है कि एक जटिल सेलुलर समारोह है. इसके अलावा, इस तरह के ट्यूमर आक्रमण और मेटास्टेसिस के रूप में कुछ रोग स्थितियों सेल गतिशीलता 1 पर भरोसा करते हैं. इन कारणों के लिए, सेल प्रवास मौलिक और translational अनुसंधान दोनों के संदर्भ में अध्ययन का एक प्रमुख क्षेत्र बन गया है. में vivo, सबसे ऊतकों एक अमीर बाह्य मैट्रिक्स और उच्च घनत्व सेल की विशेषता है. सेल प्रवास इसलिए, शारीरिक शर्तों के तहत, एक जटिल सीमित वातावरण में होता है. प्रतिष्ठित, सबसे कारण ऐतिहासिक कारणों और तकनीकी सीमाओं की संभावना, सेल प्रवास ऐसी कारावास के रूप में ऊतकों में पाया पर्यावरण गुणों के कई पुन: पेश नहीं है कि फ्लैट 2 डी सिस्टम में अध्ययन किया गया है. इसके अलावा, 2 डी में गतिशीलता के लिए आवश्यक हैं कि सेल आसंजन जैसे कारकों,, हाल ही में necessa नहीं करने के लिए दिखाया गया हैrily 2 डी में और अन्य वातावरण में सेल हरकत शासन तंत्र है कि 2 अलग कर रहे हैं, सुझाव है कि इन विवो में या जैल के अंदर प्रवास के लिए आवश्यक. कई प्रणालियों बाह्य मैट्रिक्स रचना 3 के गुण recapitulating का उद्देश्य जो ऊतकों, सबसे प्रसिद्ध जा रहा कोलेजन जैल, की जटिल गुणों की नकल करने के लिए विकसित किया गया है. यहाँ हम एक सीमित वातावरण के तहत एक आयाम में अध्ययन सेल प्रवास की अनुमति देता है कि एक साधारण पूरक विधि के रूप में microchannels प्रस्ताव.

इस प्रणाली में कोशिकाओं वे अनायास दर्ज जिसमें microchannels विस्थापित साथ. प्रवासी कोशिकाओं तो सबसे अधिक संभावना उनके polarity पुष्ट कि एक ट्यूबलर ज्यामिति को गोद लेने, चैनलों के आकार के अधिग्रहण. चैनलों में कोशिकाओं के रैखिक आंदोलन स्वत: सेल ट्रैकिंग और प्रयोगों से मात्रात्मक मापदंडों की निकासी की अनुमति देता है. देखने के तकनीकी बिंदु से, इस प्रणाली को आसान और लचीला है. coatinचैनल दीवारों के ग्राम चैनलों के आकार और आकार अनुकूलित किया जा सकता है, चालाकी से किया जा सकता है, और कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में एकल प्रयोगों में विश्लेषण किया जा सकता है. इस प्रणाली को भी बढ़ाया अप किया जा सकता है सेल गतिशीलता में शामिल अणुओं की मध्यम दूरी स्क्रीन विश्लेषण करने के लिए. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक सेलुलर मॉडल के रूप में वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) का उपयोग मानकीकरण किया गया है. वे 4. इन विट्रो, DCs अनायास ही सीमित वातावरण में माइग्रेट करने के लिए दिखाया गया है विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दीक्षा और रखरखाव में भाग लेते हैं और इसलिए microchannels 5,6 में सेल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल के रूप में इन कोशिकाओं प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए महत्वपूर्ण हैं . महत्वपूर्ण बात, इस प्रणाली टी lymphocytes, neutrophils, या ट्यूमर कोशिकाओं को 7-9 के रूप में किसी भी अन्य गतिशील सेल प्रकार के पलायन का विश्लेषण करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

महत्वपूर्ण सूचना: इस प्रोटोकॉल वांछित microchannels के लिए आकार युक्त ढालना पहले से ही किया गया है कि मान लिया गया. मोल्ड की तैयारी पर आगे की जानकारी पहले से ही 10 प्रकाशित किया गया है. इस प्रोटोकॉल भी अस्थि मज्जा DCs संस्कृति में जाना जाता है कि मानता है.

1. चिप निर्माण

  1. एक प्लास्टिक के कप में एक और वजन का अनुपात 10:01 पर PDMS तेल और इलाज एजेंट मिलाएं. अच्छी तरह से दोनों यौगिकों मिलाएं.
  2. ढालना असर microchannels मिश्रण डाली. कुल ऊंचाई 0.5-1 सेमी के बीच होना चाहिए.
  3. 1 घंटा दौरान एक वैक्यूम जार घंटी में हवाई बुलबुले निकालें.
  4. 65 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक ओवन में उत्तरार्द्ध रखकर मोल्ड में कठोर PDMS
  5. PDMS कमरे के तापमान पर है एक बार, एक सर्जिकल ब्लेड के साथ संरचना के चारों ओर एक बड़ा टुकड़ा काट और मोल्ड (चित्रा 1 ए) से दूर छील.
  6. कोशिकाओं को इंजेक्शन दिया जाएगा, जहां छेद (आमतौर पर 2 मिमी) ड्रिल और PDMS आकार परिवर्तनमाइग्रेशन (चित्रा 1 बी) का मूल्यांकन किया जाएगा जिसमें गिलास नीचे बर्तन को आकार फिट करने के लिए एक सर्जिकल ब्लेड के साथ. आगे बढ़ने से पहले, कागज की सफाई लेंस का उपयोग पकवान से अवशिष्ट धूल को हटा दें. यह कदम 1.10 में वर्णित गिलास को PDMS के बंधन पक्ष में है.
  7. संरचना पक्षों पर चिपकने वाला टेप चिपके हुए हैं और छीलने द्वारा चैनलों युक्त आकृति परिवर्तन PDMS चिप साफ करें.
  8. धूल और छोटे PDMS कणों को दूर करने के लिए 70% इथेनॉल में PDMS टुकड़े 30 सेकंड Sonicate. स्वच्छ हवा बह द्वारा जल्दी से बाद में उन्हें सूखी.
  9. 300 mTorr पर 30 सेकंड के दौरान हवा (ऑक्सीजन) से (ऊपर संरचनाओं) PDMS और संस्कृति व्यंजन सक्रिय प्लाज्मा उपचार.
  10. स्थायी रूप से सब्सट्रेट करने के लिए PDMS छड़ी करने के लिए संपर्क में दोनों सक्रिय सतहों रखें. यदि आवश्यक हो, बहुलक और पकवान (चित्रा 1C) के गिलास के बीच संपर्क के लिए मजबूर करने PDMS के शीर्ष पर थोड़ा प्रेस करने के लिए धातु संदंश का उपयोग करें.
  11. 65 डिग्री सेल्सियस के लिए ओवन में चिप सेतेबंधन को मजबूत करने के लिए आर 1 घंटा.

2. Microchannels की कोटिंग

  1. 1 मिनट के लिए 300 mTorr में एयर प्लाज्मा से पूरे ढांचे को सक्रिय करें. यह अगले कदम पर चैनलों में तरल के प्रवेश को बढ़ावा देंगे.
  2. पानी में 10 ग्राम / मिलीलीटर में तेजी फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ चिप की प्रविष्टि छेद भरने. ऐसे खूंटी के रूप में अन्य substrates चैनल दीवारों को सेल के पालन को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तरल पूरा ढांचा भर में फैलता है ध्यान. यह आसानी से नियमित रूप से रोशनी के नीचे या एक नियमित रूप से उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग आंख से जाँच की जा सकती.
    नोट: प्रसार कठिन है, जिसमें बहुत छोटे संरचनाओं, में, चैनलों में तरल के प्रवेश को कम से कम 15 मिनट के दौरान एक वैक्यूम जार घंटी में संरचना रखकर मजबूर किया जा सकता है. फ्लोरोसेंट substrates इस्तेमाल किया जा सकता कोटिंग की दक्षता (चित्रा 2) को सत्यापित करने के लिए.
  3. Fibronectin की सोखना या किसी भी अन्य कोटिंग subst अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे सेतेचैनलों की दीवारों के लिए दर.
  4. संरचनाओं nonbound सब्सट्रेट दूर करने के लिए पीबीएस के साथ 3x धो लें.
  5. धोने के बाद, प्रोटोकॉल 3 के लिए आगे बढ़ना या एक बाद में उपयोग (24 घंटा अधिकतम) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर चिप की दुकान.

3. सेल लोड हो रहा है

  1. थाली से पीबीएस निकालें और सेल के माध्यम से माइक्रोसिस्टम भरें. मध्यम के साथ चैनल तर करने के लिए 1 घंटे के लिए सेते करते हैं.
    नोट: अणु inhibitors जैसे मादक पदार्थों से जुड़े प्रयोगों के लिए यह सही एकाग्रता पर दवा युक्त एक माध्यम के साथ चैनलों preincubate की सलाह दी है. इसके अलावा, कुछ दवाओं प्रभावी एकाग्रता कम कर देता है जो PDMS संरचना में solubilize के लिए करते हैं. कुछ समाधान इस समस्या को 11-12 प्रतिक्रिया करने के लिए प्रस्तावित किया गया है.
  2. चल DCs निकालें और संस्कृति के माध्यम से निस्तब्धता द्वारा अर्द्ध पक्षपाती कोशिकाओं को ठीक. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
    नोट: नाभिक इमेजिंग के लिए, एक Hoechst 33342 धुंधला में से पहले से प्राप्त किया जा सकता हैपूरा मध्यम में 200 एनजी / एमएल पर डाई के साथ 30 मिनट के दौरान 2 x 10 6 कोशिकाओं cubating. प्रोटोकॉल जारी रखने से पहले डाई से अधिक दूर करने के लिए centrifugation द्वारा दो बार धोएं.
  3. 5 मिनट (समय और गति सेल प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं) के दौरान 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और मध्यम त्यागें. 20 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता तक पहुँचने के लिए गोली पतला.
  4. थाली से मध्यम से अधिक निकालें और एक micropipette का उपयोग PDMS संरचना में प्रवेश छेद खाली है. प्रत्येक प्रविष्टि छेद में 1 x 10 5 कोशिकाओं की राशि तक पहुँचने के लिए सेल समाधान के 5 μl के साथ प्रविष्टियों भरें.
    नोट: उच्च घनत्व सेल चैनल के साथ कोशिकाओं के संपर्क के पक्ष में करने के लिए आवश्यक है. कम सेल घनत्व चैनलों और प्रयोग की विफलता के अंदर कोशिकाओं की कम संख्या में हो सकता है.
  5. इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए माइक्रोचिप सेते हैं. प्रयोग पकवान को पूरा मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें.
    नोट: पूरे PDMS संरचना ख चाहिएई प्रयोग के दौरान कोशिकाओं के सूखने से बचने के लिए कवर किया. 2 मिलीलीटर पर्याप्त नहीं है, पूरी तरह से PDMS संरचना को कवर करने के लिए और अधिक मध्यम जोड़ें.

4. इमेजिंग

  1. खुर्दबीन के नीचे प्लेटों रखने से पहले लेंस सफाई ऊतक के साथ बर्तन के बाहरी नीचे की सतह को साफ करें.
  2. कोशिकाओं की बड़ी संख्या में माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए, एक सीओ 2 और तापमान सुसज्जित वीडियो माइक्रोस्कोप में 10x बढ़ाई और विस्तृत क्षेत्र रोशनी (चित्रा 3) का उपयोग करें. सेल ट्रैकिंग की सुविधा, Hoechst धुंधला और पराबैंगनी प्रकाश (3.2 कदम देखें) का इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रवासन भी माइग्रेशन के दौरान सेलुलर संरचनाओं के उच्च संकल्प प्राप्त करने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता.
  3. 10X पर समय व्यतीत माइक्रोस्कोपी के लिए, उम्मीद सेल गति (5 माइक्रोन / मिनट की रफ्तार से पलायन वृक्ष के समान कोशिकाओं के लिए आम तौर पर 2 मिनट) के अनुसार एक समय आवृत्ति का चयन करें.
    नोट: यहां वर्णित प्रोटोकॉल पता करता हैOT सेल प्रवास मापदंडों का विश्लेषण शामिल हैं. कुछ बिंदुओं समय चूक फिल्मों से जानकारी निकालने के लिए कैसे आगे बढ़ना पर पाठकों को सलाह के लिए चर्चा में सूचीबद्ध हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रत्येक प्रयोग में PDMS की सतह के अध्ययन के हित के लिए अनुकूलित एक अणु के साथ लेपित है. से पहले और (2.4 कदम) धोने के बाद एक फ्लोरोसेंट अणु, पीएलएल-G-खूंटी, साथ लेपित 2 से पता चलता चैनलों चित्रा. इस तरह के प्रयोग चैनलों में कोटिंग की एकरूपता के नियंत्रण की अनुमति देता है.

सेल लोड करने के बाद, वीडियो माइक्रोस्कोपी सेल प्रवास का पालन करने के लिए किया जा सकता है. चित्रा 3A डीसी कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए उचित घनत्व पर microchannels में पलायन का एक उदाहरण दिखाता है. चरण के विपरीत और Hoechst धुंधला दोनों (चर्चा देखने के लिए) इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तकनीक भी उच्च संकल्प पर फ्लोरोसेंट confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संगत है, और. 4B चित्रा LifeActGFP व्यक्त DCs पलायन में polymerized actin की गतिशील की एक उदाहरण दिखाता है organelles या सेलुलर संरचनाओं को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

सेल की मात्रा का ठहराव का एक उदाहरणपलायन DCs में विश्लेषण गतिशीलता चित्रा 5 में दिखाया गया है. चित्रा 5A गुम्मट या Y27632 इलाज DCs से उत्पन्न kymographs से पता चलता है. Y27632 सेल सिकुड़ना और प्रवास की एक अच्छी तरह से होती अवरोध करनेवाला है, और गति में परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रणाली की क्षमता को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. kymographs आगे विभिन्न मापदंडों के अध्ययन सेल प्रवास का वर्णन करने के लिए अनुमति, स्थान और समय के एक समारोह के रूप में कोशिकाओं के आकार निकालने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. चित्रा 5 ब एक घर का बना सॉफ्टवेयर 13 का उपयोग इमेजिंग नाभिक स्थिति से नज़र रखी प्रवास की गति को दर्शाता है. DCs 6 माइक्रोन / मिनट के करीब एक मतलब वेग है. Y27632 साथ उपचार काफी उनके वेग कम हो जाती है. यह उदाहरण ही प्रयोगों में कोशिकाओं की बड़ी संख्या की मात्रा का ठहराव और दवा उपचार से प्रेरित मतभेदों का पता लगाने के लिए इस प्रणाली की उपयोगिता की अनुमति देता है जो तकनीक की शक्ति को दर्शाता है. इस siRNA के उपयोग और तिल की स्क्रीनिंग के लिए बढ़ाया जा सकता है cules प्रवास के नियंत्रण में शामिल किया गया.

चित्रा 1
चित्रा 1. चैनलों विधानसभा में कदम. PDMS चिप एक चैनल आचारण से दोहराया गया था. (ए) चैनलों युक्त चिप मोल्ड से सीधे निकाला गया था. (बी) के प्रायोगिक पकवान और एक छेद फिट करने के लिए आकार बदला चिप कोशिकाओं के प्रवेश की अनुमति देने के लिए बनाया गया था. (सी) चिप अंतत: गिलास पकवान के शीर्ष पर चिपकाया गया था. डिवाइस (डी और ई) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (डी) ऊपर देखें. (ई) साइड देखें. हरी वस्तुओं (नीला) में या चैनलों बाहर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. 1 सेमी पट्टी.

es/ftp_upload/51099/51099fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51099/51099fig2.jpg "/>
एक फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट के साथ चैनलों के चित्रा 2. कोटिंग. (ए) 1 घंटा दौरान 100 माइक्रोग्राम / एमएल पर फ्लोरोसेंट खूंटी के साथ incubated 5 माइक्रोन एक्स 5 माइक्रोन चैनलों. (बी) चैनलों की पीबीएस धोने के बाद शेष फ्लोरोसेंट खूंटी की छवि प्रतिनिधि. 50 माइक्रोन बार.

चित्रा 3
चित्रा 3. कोशिकाओं microchannels साथ पलायन. चरण 5 माइक्रोन एक्स 5 माइक्रोन microfabricated चैनलों में पलायन कोशिकाओं के विपरीत (ग्रे) और नाभिक धुंधला (नीला). चैनलों के साथ पलायन DCs की एक फिल्म से निकाला (क) एकल छवि. (बी) असेंबल एक selec के विस्थापन दिखाटेड डीसी चैनलों के साथ पलायन. सफेद तीर पलायन कोशिकाओं से संकेत मिलता है. Timescale 1 आइएमजी / 2 मिनट. 50 माइक्रोन बार.

चित्रा 4
Microchannels में उच्च संकल्प कोशिकाओं की चित्रा 4. उदाहरण. एकल microchannels साथ पलायन DCs के उच्च संकल्प इमेजिंग. एक microchannel में पलायन एक डीसी के चरण विपरीत छवियों (ए) असेंबल (1 img/20 सेक) (100x बढ़ाई). (बी) प्रतिदीप्ति इमेजिंग (1 img/20 सेकंड, 60x बढ़ाई, एक ऑप्टिकल अनुभाग) के साथ प्रणाली की अनुकूलता दिखा एक डीसी व्यक्त lifeact (प्रकाश डाला गया actin polymerized) के असेंबल. Polymerized actin काले रंग में दिखाया गया है. चैनल का आकार 10 मीटर चौड़ा x 5 माइक्रोन उच्च. 10 माइक्रोन बार.

के चित्रा 5. DCs microchannels साथ पलायन के प्रतिनिधि परिणाम है. यह आंकड़ा microchannels साथ पलायन कोशिकाओं की फिल्मों से किया जा सकता है कि विश्लेषण के प्रकार को दिखाता है. चित्रा 5A समय चूक चरण विपरीत गुम्मट की छवियों या में पलायन Y27632 इलाज DCs से उत्पन्न kymographs से पता चलता है microchannels (10X, 1 आइएमजी / 2 मिनट). चित्रा 5 ब Hoechst धुंधला हो जाना और एक घर का बना सॉफ्टवेयर 13 का उपयोग करते हुए डीसी नाभिक नज़र रखने के बाद प्राप्त सेल वेग की मात्रा का ठहराव का एक उदाहरण दिखाता है. डेटा एक nonparametric टी परीक्षण (मान व्हिटनी परीक्षण) का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं. 100 माइक्रोन बार.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ हम एक प्रयोगों में कोशिकाओं की बड़ी संख्या के प्रवासी गुणों का अध्ययन करने के लिए एक विधि के रूप में microchannels से बना एक युक्ति का वर्णन. यह प्रायोगिक प्रणाली अंतर्जात प्रवासी कोशिकाओं द्वारा ऊतकों में पाया सीमित पर्यावरण की कमी mimics. हालांकि, एक भी आयाम में माइग्रेशन के लिए मजबूर द्वारा, यह स्वत: सेल ट्रैकिंग और measurables की निकासी (चित्रा 5) की सुविधा. हम भी अपने डिवाइस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संगत है और इसलिए सेल गतिशीलता के विभिन्न चरणों (चित्रा 4) के दौरान organelle स्थिति का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम चैनलों की गुणवत्ता है. यह कांच की सतह पर PDMS की अच्छी चिपके नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है. चिपका की परेशानियों दिखाई देते हैं जाँच करने के लिए पहली बातें दोनों सतहों की सफाई और प्लाज्मा क्लीनर में से एक हैं. महत्वपूर्ण हो सकता है कि एक और पैरामीटर वें हैलोड कोशिकाओं के ई घनत्व. सहज प्रवास ट्यूबों में प्रवेश की सुविधा के लिए चैनलों के लिए कोशिकाओं के करीब निकटता की आवश्यकता है, और इष्टतम संख्या प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए.

एक उदाहरण के रूप में, हम DCs की सहज प्रवास से पता चला है, लेकिन प्रणाली अन्य प्रकार की कोशिकाओं के पलायन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रयोगशाला में, हम प्राथमिक टी lymphocytes, मैक्रोफेज के रूप में अच्छी तरह से ट्यूमर सेल लाइनों (डेटा 7-9 दिखाया और संदर्भ नहीं) का परीक्षण किया है.

चैनलों में सेल प्रवास का विश्लेषण करने के लिए, दो मुख्य प्रोटोकॉल परीक्षण किया गया है. पहला चरण विपरीत (10X) द्वारा इमेजिंग की आवश्यकता है, और कोशिकाओं 3 (चित्रा 5A) पलायन से स्वत: पता लगाने और kymographs की पीढ़ी पर आधारित है. वेग, सेल आकार और दृढ़ता, दूसरों के बीच में, kymographs से निकाला जा सकता है कि मानकों हैं. इस प्रणाली kymographs की गुणवत्ता से और के विकास तक सीमित हैउन्हें उत्पन्न करने और विश्लेषण करने के लिए सॉफ्टवेयर. डेटा यों तो एक दूसरे और आसान तरीका Hoechst धुंधला (चित्रा 3) का उपयोग नाभिक की अर्द्ध automatized ट्रैकिंग पर आधारित है. प्रतिदीप्ति का उपयोग मानक इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ माइग्रेशन की ट्रैकिंग और विश्लेषण की अनुमति देता है. इस तरह की रणनीति का एक उदाहरण पहले दुनिया सेल दौड़ 12 के लिए विकसित किया गया है.

PDMS की सतह लगभग किसी भी प्रोटीन के साथ adsorbed जा सकता है कि यह देखते हुए, microchannels सेल प्रवास में बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चैनलों की ज्यामिति भी सेल प्रवास में शारीरिक constrains के प्रभाव के अध्ययन की सुविधा संशोधित किया जा सकता है.

अंत में, यह प्रायोगिक प्रणाली एकल प्रयोगों में कई की स्थिति प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. यह एक साथ एक अर्द्ध automatized विश्लेषण के साथ, शामिल नए अभिनेताओं की खोज के लिए मध्यम throughput स्क्रीनिंग के साथ संगत हैकैंसर कोशिकाओं के प्रवास में डी.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों बहुत Institut क्यूरी (CNRS UMR144) में PICT IBiSA मंच को स्वीकार करते हैं. इस काम से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया: AM.LD के लिए यूरोपीय अनुसंधान परिषद (Strapacemi 243103), एसोसिएशन नेशनल ला Recherche (ANR-09-piri-0027-PCVI), InnaBiosanté फाउंडेशन (Micemico) के सांसद और AM करने के लिए डालना. AM.LD. को एलडी और ईआरसी Strapacemi युवा अन्वेषक अनुदान

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) GE Silicones RTV615 Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter Ted Pella Int. Harris Uni-Core Diameter 2.5 mm
Glass-bottom dish WPI Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner Branson Ultrasonics Branson 200
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC 32 G For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma Sigma Aldrich F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) Susos PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
Y27632 TOCRIS 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
  2. Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  3. Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines. J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).
  4. Steinman, R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).
  5. Faure-André, G., et al. Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain. Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).
  6. Renkawitz, J., et al. Adaptive force transmission in amoeboid cell migration. Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).
  7. Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).
  8. Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).
  9. Moreau, H., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
  10. Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay. Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).
  11. Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules. Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).
  12. Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. Whole-Teflon microfluidic chips. PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).
  13. Maiuri, P., et al. The first World Cell Race. Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 84 microchannels सेल प्रवास गतिशीलता वेग प्रसूति वृक्ष के समान कोशिकाओं
Microfabricated चैनल में सेल प्रवास के अध्ययन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vargas, P., Terriac, E.,… More

Vargas, P., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. Study of Cell Migration in Microfabricated Channels. J. Vis. Exp. (84), e51099, doi:10.3791/51099 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter