Summary
Tek boyutlu bir kapalı mikro hücrelerin spontan göç incelemek için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, mikrofabrike kanalları yararlanır ve tek bir deneyde, farklı koşullar altında hücrelerin büyük sayıda göçünü incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Burada tarif edilen yöntem, bir boyutta kapalı alan içinde hücre göçü çalışma sağlar. Bu fiziksel kısıtlamaları ile hücrelere bir polarize fenotip empoze mikrofabrike kanalların kullanımına dayanmaktadır. Ileri ya da geri hareket: kanalların içine kez hücreler yalnızca iki olasılık var. Yön sınırlı olduğu bu basitleştirilmiş göç hücrelerinin otomatik izleme ve hücre hareketini tanımlamak için sayısal parametreler çıkarma kolaylaştırır. Bu parametreler, hareket esnasında hücre hız, yön değişimleri ve duraklar içerir. Mikro kanallar da floresan markerlerin kullanımı ile uyumludur ve yüksek çözünürlükte hücre geçiş sırasında, hücre içi organel ve yapıların lokalizasyonu incelemek için uygundurlar. Son olarak, kanalların yüzeyi kanallar ya da haptotaxis çalışma yapışkan özelliklerinin kontrol etmesine izin veren, farklı alt-tabaka ile fonksiyonalize edilebilir. Özet olarak, sistem here tarif bağımsız deneyin normalleştirme ve tekrarlanabilirlik kolaylaştırılması, geometri ve çevrenin biyo-kimyasal yapısı hem de kontrol edildiği koşullarda hücre sayıları büyük göçünü analiz etmek için tasarlanmıştır.
Introduction
Göç gelişimi, bağışıklık yanıtı, doku rejenerasyonu ve da dahil olmak üzere çok-hücreli organizmada, pek çok fizyolojik süreçler için önemli olan bir kompleks hücresel fonksiyonudur. Buna ek olarak, bu tür tümör istilası ve metastaz gibi bazı patolojik durumlar, hücre motilitesi 1 dayanır. Bu nedenlerden dolayı, hücre göçü temel ve translasyonel hem araştırma bağlamında çalışmanın önemli bir alan haline gelmiştir. In vivo, çoğu dokuların zengin hücre-dışı matris ve yüksek hücre yoğunluğu ile karakterize edilir. Hücre göçü, bu nedenle, fizyolojik koşullar altında, bir kompleks kapalı bir ortamda meydana gelir. Klasik, çoğu tarihsel nedenlerden dolayı ve teknik sınırları olasılığı, hücre göçü gibi hapsi olarak dokularda bulunan çevre özelliklerinin çoğunu yeniden yok düz 2D sistemlerinde çalışılmıştır. Ayrıca, 2B motilite için gerekli olan hücre yapışması gibi faktörler, son zamanlarda necessa olmayabilir gösterdi edilmiştirrily 2B ve diğer ortamlarda hücre lokomosyonu kural mekanizmaları 2 ayrı olduğunu öne sürerek, in vivo veya jellerin içinde göç için gerekli. Çeşitli hücre dışı matris sistemleri, bileşimin 3 özelliklerini yansıtan nişan dokuların, en ünlü olmak kollajen jel, karmaşık özelliklerini taklit etmek için geliştirilmiştir. Burada kapalı bir ortamda bir boyutta çalışma hücre göçünü sağlayan basit bir tamamlayıcı bir yöntem olarak mikrokanalların öneriyoruz.
Bu sistemde hücreler kendiliğinden girmek içine Mikrokanallar boyunca göç. Göç eden hücreler, daha sonra, büyük olasılıkla da bir polariteye güçlendiren boru şeklinde bir geometri benimseyerek, kanal şeklini kazanır. Kanallardaki hücrelerin doğrusal hareket otomatik hücre izleme ve deneylerden elde edilen kantitatif parametrelerin çıkarma sağlar. Görüş teknik açıdan bakıldığında, bu sistem kolay ve esnektir. Coatinkanal duvarlarının g kanalların boyutu ve şekli uyarlanabilir, manipüle edilebilir ve hücreler, çok sayıda tek deneylerde analiz edilebilir. Bu sistem aynı zamanda ölçekli yukarı olabilir hücre hareketi katılan moleküllerin orta menzilli ekran analizini gerçekleştirmek. Burada açıklanan protokol hücresel bir model olarak dendritik hücreler (DC) kullanılarak standardize edilmiştir. Bu 4.. In vitro, DCler kendiliğinden kapalı ortamlarda geçiş gösterilmiştir spesifik bağışıklık yanıtlarının başlatılması ve bakım katılabilir ve bu nedenle mikro 5,6 hücre hareketliliği incelemek için iyi bir model olarak bu hücreler bağışıklık sistemi için anahtar . Önemli olarak, bu sistem, T lenfositler, nötrofiller, ya da tümör hücreleri 7-9 gibi başka bir hücre tipi hareketli göçünü analiz etmek için uzatılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Önemli not: Bu protokol, istenen mikrokanalların şeklini içeren kalıp zaten yapılmış olduğunu varsayar. Kalıbın hazırlanması hakkında daha fazla bilgi 10, daha önce yayınlanmıştır. Bu protokol aynı zamanda kemik iliği DH'leri kültürü bilindiğini varsayar.
1.. Chip Fabrikasyon
- Plastik bir kap içinde bir ağırlık oranı 10:1 PDMS yağ ve sertleştirme maddesi karıştırın. İyice her iki bileşiği karıştırın.
- Kalıp yatak mikrokanalların üzerinde karışımı döküm. Toplam yüksekliği 0.5-1 cm arasında olmalıdır.
- 1 saat boyunca bir vakum kavanoz çan hava kabarcıklarını çıkarın.
- 65 ° C'de 2 saat boyunca bir fırın içinde ikinci yerleştirerek küfü içinde katılaşmaya PDMS
- PDMS oda sıcaklığında sonra, bir cerrahi bıçak ile yapı etrafında büyük bir parça kesilir ve kalıbın (Şekil 1A) onu soyulabilir.
- Hücreleri enjekte edilecektir delik (tipik olarak 2 mm) bir matkap ve PDMS boyutlandırmagöç (Şekil 1B) değerlendirilecek olan cam alt yemekleri boyutuna uyması için bir cerrahi bıçak ile. Devam etmeden önce, temizleme kağıdı lens kullanarak yemeğin kalan toz kaldırmak. Bu aşama 1.10 tarif cam PDMS bağlayıcı yanadır.
- Yapı tarafta yapışkan bant yapıştırma ve soyma kanalları içeren resized PDMS çipi temizleyin.
- PDMS toz ve küçük parçacıkların ayrılması için% 70 etanol içinde PDMS parçaları da 30 saniye sonikasyon. Temiz hava üfleme hızla sonradan onları kurutun.
- 300 mTorr 30 sn boyunca hava (veya oksijen) ile (yukarı yapılar) ve PDMS kültür kaplarına aktive plazma işleme.
- Sürekli olarak alt-tabaka için, PDMS sopa temas halindeki her iki yüzey aktif yerleştirin. Eğer gerekirse, polimer ve çanak (Şekil 1C) ve cam arasındaki temas zorlamak için PDMS üstüne hafifçe basın metalik forseps kullanır.
- 65 ° C de fo fırında çipi inkübebağlama güçlendirmek için r 1 saat.
2. Mikrokanallarda Kaplama
- 1 dakika boyunca 300 mTor hava plazma tarafından tüm yapıyı etkinleştirin. Bu, bir sonraki aşamada da kanal içine sıvının girişini teşvik edecektir.
- Su içinde 10 ug / ml 'de hızlı bir fibronektin ile çipin giriş delikleri doldurun. PEG gibi diğer alt-tabakalar kanal duvarlarına hücre yapışmasını değiştirmek için kullanılabilir. Sıvı yapının tamamı yayılır dikkat ediniz. Bu kolaylıkla normal ışık altında ya da düzenli bir aydınlık alan mikroskobu kullanarak gözle kontrol edilebilir.
NOT: difüzyon zor olan çok küçük yapılarda, kanallardaki sıvı girişi, en az 15 dakika boyunca bir vakum çan kavanoz yapıyı yerleştirerek zorlanabilir. Fluoresan alt-tabakalarını kullanılabilecek kaplama verimliliğini (Şekil 2) kontrol etmek için. - Fibronektin adsorpsiyonu ya da başka kaplama subst izin vermek için, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edinkanalların duvarlarına hızı.
- Bu yapıların nonbound tabakayı uzaklaştırmak için PBS ile 3 kez yıkayın.
- Yıkama işleminden sonra, Protokol 3 geçin veya sonraki bir kullanım (24 saat maksimum) 4 ° C'de çipi saklayın.
3. Hücre Yükleniyor
- Plaka PBS çıkarın ve hücre ortamı ile mikrosistem doldurun. Ortam ile kanal doyurmak için 1 saat boyunca inkübe olsun.
NOT: molekül inhibitörleri gibi ilaçları içeren deneyler için, doğru konsantrasyonda ilaç ihtiva eden bir ortam maddesi ile kanal Preincubate için tavsiye edilir. Ayrıca, bazı ilaçlar, etkin konsantrasyonunu azaltan PDMS yapısında çözünür olma eğilimindedir. Bazı çözümler bu sorunu 11-12 karşı ileri sürülmüştür. - Yüzer DC'ler çıkarın ve kültür ortamı ile yıkama ile, yarı-yapışkan hücreleri iyileşir. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
NOT: çekirdeği görüntüleme için, Hoechst 33342 boyama in tarafından önceden elde edilebilirtam ortam içinde 200 ng / ml 'de boya ile 30 dakika boyunca 2 x 10 6 hücre cubating. Protokolü devam etmeden önce boyanın fazlasının ayrılması için santrifüj ile iki kez yıkanır. - 5 dakika (zaman ve hız hücre türüne bağlı olarak farklı olabilir) esnasında 300 xg'de hücreleri Santrifüj ve orta atın. 20 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon elde etmek için topağı seyreltin.
- Plakadan ortamın fazlalığını çıkarın ve bir mikropipet kullanılarak PDMS yapısındaki giriş delikleri boşaltın. Her giriş deliği 1 x 10 5 hücre bir miktarda ulaşmak için hücre çözümü 5 ul girdileri doldurun.
NOT: Yüksek hücre yoğunluğu kanalları hücrelerin temas lehine için gereklidir. Düşük hücre yoğunluğu kanal ve deney hatası içinde hücre sayısı düşük neden olabilir. - Inkübatör içinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin mikroçip. Deney çanak tam ortam 2 ml ilave edilir.
NOT: Bütün PDMS yapısı b gerekire deney sırasında hücrelerin kurumayı önlemek amacıyla kapalı. 2 ml yeterli değilse, tamamen PDMS yapısı karşılamak için daha fazla orta ekleyin.
4. Görüntüleme
- Mikroskop altında plakaları yerleştirmeden önce bir objektif temizleme beziyle yemekleri dış alt yüzeyini temizleyin.
- Hücrelerin çok sayıda geçiş analiz etmek için, bir CO2 ve ısı donanımlı video mikroskop 10X büyütme ve geniş alan aydınlatma (Şekil 3) kullanın. Hücre izleme kolaylaştırmak için, Hoechst boyama ve UV ışığı (adım 3.2) de kullanılabilir. Göç aynı zamanda göç sırasında hücresel yapıların daha yüksek çözünürlük elde etmek için konfokal mikroskopi kullanılarak analiz olabilir.
- 10X de zaman atlamalı mikroskobu için, beklenen hücre hızında (5 mm / dk 'lık bir hız ile göç eden dendritik hücreler tipik olarak 2 dakika)' e uygun bir zaman frekansı seçin.
Not: Burada açıklanan protokol n yaparot hücre göçü parametrelerin analizini içerir. Birkaç puan time-lapse film bilgileri ayıklamak için nasıl devam için okuyuculara tavsiye tartışma listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her bir deneyde, PDMS yüzey çalışmanın ilgi uyarlanmış bir molekül ile kaplanır. Önce ve (adım 2.4) yıkandıktan sonra bir flüoresan molekül, PLL-PEG-g, kaplanmış Şekil 2, kanal Şekil. Böyle bir deney, kanallardaki kaplamanın homojenliği kontrol sağlar.
Hücre Yükleme işleminden sonra, bir video mikroskobu hücre göçü takip gerçekleştirilebilir. Şekil 3A, DC hücreleri izlemek için uygun bir yoğunlukta mikro göç eden bir örneğini göstermektedir. , Faz kontrast ve Hoechst boyama her ikisi de (Tartışma) bu amaç için kullanılabilir. Bu teknik aynı zamanda daha yüksek bir çözünürlükte floresan konfokal mikroskopi ile uyumludur, ve. Şekil 4B LifeActGFP ifade eden DC'ler göç polimerize aktin dinamik bir örneğini göstermektedir organel ya da hücre yapıları izlemek için kullanılabilir.
Hücre miktarının bir örneğigöç DCler analiz motilite, Şekil 5 'de gösterilmiştir. Şekil 5A, WT ve Y27632 muamele edilmiş DCler elde Kymographs gösterir. Y27632 hücre kontraktilite ve göç iyi karakterize inhibitörüdür, ve hız değişiklikleri algılamak için sistemin yeteneğini doğrulamak için kullanılmıştır. Kymographs ayrıca farklı parametrelerin çalışma hücre göçü tanımlamak için izin konumu ve zamanın bir fonksiyonu olarak bir hücre boyutu elde etmek için analiz edilebilir. Şekil 5B, bir ev yapımı yazılımı kullanılarak 13 görüntüleme çekirdeği konumlandırma tarafından izlenen göç hızını gösterir. DH'leri 6 mm / dk yakın bir ortalama hıza sahiptir. Y27632 ile tedavi hızını önemli ölçüde azaltır. Bu örnek tek deneylerde hücre sayıda ölçümü ve ilaç tedavileri ile indüklenen farklılıkları algılamak için sistemin yarar sağlayan tekniği gücünü gösterir. Bu, siRNA kullanımı ve mol tarama uzatılabilir durumda endotel göç kontrolünde dahil.
Şekil 1.. Kanal montaj Adımlar. PDMS çip kanal kalıp tekrarlanmıştır. (A) kanalı içeren çip kalıp tarafından doğrudan ekstre edilmiştir. (B) deneysel çanak ve bir delik sığacak şekilde yeniden çip hücrelerin girişine izin yapıldı. (C) yonga son olarak, cam çanak üzerine yapıştırılmış edildi. Aygıtın (D ve E) şematik temsili. (D) Üst görünümü. (E) Yan görünümü. Yeşil nesneleri (mavi) veya kanallar üzerinden hücreleri temsil eder. 1 cm Bar.
es/ftp_upload/51099/51099fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51099/51099fig2.jpg "/>
Bir alt-tabaka ile floresan kanalları Şekil 2.. Kaplama. (A), 1 saat boyunca 100 ug / ml 'de floresan PEG ile inkübe 5 um x 5 um kanalları. (B) kanalları PBS yıkama sonrası geriye kalan PEG floresan görüntü temsili. 50 um Bar.
Şekil 3.. Hücreler Mikrokanallar boyunca göç. Aşama 5 um x 5 mikron mikrofabrike kanallar göç hücrelerinin kontrast (gri) ve çekirdek boyama (mavi). Kanalları boyunca göç DH'lerin bir filmden çıkarılan (A) Tek resim. (B) Montage SELEC bir deplasman gösterented DC kanalları boyunca göç. Beyaz oklar göç hücreleri göstermektedir. Zaman ölçeği 1 img / 2 dk. 50 um Bar.
Mikrokanallardaki yüksek çözünürlüklü hücreleri Şekil 4.. Örnek. Tek Mikrokanallar boyunca göç DH'lerin Yüksek çözünürlüklü görüntüleme. Bir mikrokanal içinde göç eden bir DC faz kontrast görüntüleri (A) Montage (1 img/20 saniye) (100X büyütme). (B) floresan görüntüleme (1 img/20 sn, 60X büyütme, tek optik bölüm) ile sistemin uyumluluğunu gösteren bir DC ifade LifeAct (golleri aktin polimerize) Montajı. Polimerize aktin siyah olarak gösterilmiştir. Kanal büyüklüğü 10 mikron genişliğinde x 5 mm yüksekliğinde. 10 mikron Bar.
Şekil 5. DH'leri Mikrokanallar boyunca göç Temsilcisi sonuçları. Bu rakam Mikrokanallar boyunca göç hücrelerinin filmler yapılabilir analiz türünü göstermektedir. Şekil 5A time-lapse faz kontrast WT görüntüleri ya göç Y27632 tedavi DC'lerden üretilen Kymographs gösterir mikrokanallar (10X, 1 img / 2 dak.) Şekil 5B, Hoechst boyama ve bir ev yapımı yazılımı 13 kullanılarak DC çekirdeği izleme sonra elde edilen hücre hızında miktarının bir örneğini göstermektedir. Veriler parametrik olmayan t-testi (Mann-Whitney testi) kullanarak analiz edilir. 100 mikron Bar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tek deneylerde hücre sayıda göç özelliklerini incelemek için bir yöntem olarak mikro oluşan bir cihaz tarif etmektedir. Bu deneysel sistem endojen göçmen hücreler tarafından dokularda bulunan sınırlı çevresel kısıtlamalar taklit eder. Ancak, tek bir boyutta göç zorlayarak, otomatik hücre izleme ve measurables çıkarılması (Şekil 5) kolaylaştırır. Aynı zamanda cihaz floresan mikroskobu ile uyumlu olduğunu ve bu nedenle hücre motilitesini farklı aşamalarında (Şekil 4) boyunca bir organel konumlandırma incelemek için adapte edilebilir olduğunu göstermektedir.
Protokol içindeki kritik bir safha, kanalların kalitesidir. Bu, cam yüzey üzerinde PDMS iyi yapışmasını kontrol etmek önemlidir. Yapışma sıkıntılar göründüğünde kontrol etmek için ilk şey hem yüzeylerin temizlik ve plazma temizleyici biridir. Kritik olabilecek diğer bir parametre thyüklü hücre e yoğunluğu. Spontan göç tüpler içine girişini kolaylaştırmak için kanallara hücrelerin yakın gerektirir ve optimum sayısı, her bir hücre tipi için değerlendirilmelidir.
Bir örnek olarak, DC'lerin kendiliğinden göç göstermiştir, ancak sistem, diğer hücre türlerinin göçünü analiz etmek için kullanılabilir. Laboratuarda, primer T lenfositleri, makrofajlar ve tümör hücre çizgilerini (veriler gösterilmemiştir 7-9 ve buradaki referanslar olan) test edilmiştir.
Kanallardaki hücre göçü analiz etmek için, iki temel protokoller test edilmiştir. Birinci faz kontrast (10X) ile görüntüleme gerektirir ve hücreler 3 (Şekil 5A) göç gelen otomatik olarak algılanması ve Kymographs oluşturulmasına dayanır. Hız, hücre boyutu ve kalıcılık, diğerleri arasında, Kymographs elde edilebilir parametrelerdir. Bu sistem Kymographs kalitesi ile ve geliştirilmesi ile sınırlıdırbunları oluşturmak ve analiz etmek için yazılım. Verileri ölçmek için ikinci ve daha kolay bir şekilde Hoechst boyama (Şekil 3) ile çekirdeğin yarı otomatize takip dayanmaktadır. Floresan kullanılması standart görüntüleme yazılımı ile göç izleme ve analiz sağlar. Bu tür bir stratejinin bir örnek ilk dünya hücre yatağın 12 için geliştirilmiştir.
PDMS yüzeyi hemen hemen herhangi bir protein ile adsorbe edilmesi göz önüne alındığında, mikrokanallar hücre göçü ve hücre dışı matris proteinlerinin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Kanalların geometrisi de hücre göçü fiziksel kısıtlamayla etkisinin çalışma kolaylaştırmak, modifiye edilebilir.
Son olarak, bu deney, sistem tek deneylerinde çeşitli koşullar elde etmek için uyarlanabilir. Bu, arada bir yarı-otomatize analizi ile, içeren yeni aktörlerin keşif için orta düzeyde gösterimleri ile uyumlukanser hücrelerinin göç d.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar ölçüde Institut Curie'nin (CNRS UMR144) de PICT Ibisa platformu kabul. Bu çalışma hibe tarafından finanse edildi: AM.LD için Avrupa Araştırma Konseyi (Strapacemi 243.103), Dernek Nationale la Recherche (ANR-09-PİRİ-0027-PCVI), InnaBiosanté vakıf (Micemico) MP ve PM dökün. AM.LD. LD ve ERC Strapacemi genç araştırmacı hibe
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Package of 90% silicone base and 10% curing agent |
| Core sample cutter | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diameter 2.5 mm |
| Glass-bottom dish | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32 G | For small samples (35 dishes). A bigger version is also available |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines. J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).
- Steinman, R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).
- Faure-André, G., et al. Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain. Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).
- Renkawitz, J., et al. Adaptive force transmission in amoeboid cell migration. Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).
- Moreau, H., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay. Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).
- Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules. Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).
- Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H.
- Maiuri, P., et al. The first World Cell Race. Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).
