Undersøgelse af Cell Migration i microfabricated kanaler

Summary

En kvantitativ metode til at studere spontan migration af celler i en endimensional begrænset mikromiljø beskrevet. Denne fremgangsmåde drager fordel af mikrofabrikerede kanaler og kan bruges til at studere migration af et stort antal celler under forskellige betingelser i enkelte eksperimenter.

Abstract

Den her beskrevne fremgangsmåde muliggør studiet af cellemigrering under indeslutning i en dimension. Den er baseret på brugen af ​​mikrofabrikerede kanaler, der stiller en polariseret fænotype til celler med fysiske begrænsninger. Gang inde kanaler, celler har kun to muligheder: Flyt fremad eller tilbage. Denne forenklede migration, hvor retningsvirkning er begrænset letter automatisk sporing af celler og udvinding af kvantitative parametre til at beskrive celle bevægelse. Disse parametre omfatter celle hastighed, ændringer i retning, og pauser i løbet af bevægelse. Mikrokanaler er også kompatible med anvendelse af fluorescerende markører og er derfor velegnet til at studere lokalisering af intracellulære organeller og strukturer i cellemigrering ved høj opløsning. Endelig kan overfladen af ​​kanalerne funktionaliseres med forskellige substrater, muliggør styring af de klæbende egenskaber af de kanaler eller studiet af haptotaxis. Sammenfattende systemet here beskrevet er beregnet til at analysere migration af store celleantal under forhold, hvor både geometrien og den biokemiske beskaffenhed af miljøet kontrolleres lette normalisering og reproducerbarhed uafhængige forsøg.

Introduction

Migration er en kompleks cellulær funktion, som er vigtigt for mange fysiologiske processer i flercellede organismer, herunder udvikling, immunreaktioner og vævsregeneration. Desuden kan visse patologiske situationer såsom tumor invasion og metastase afhængige cellemotilitet ^1.. Af disse grunde er cellemigration blevet en vigtig fagområde i forbindelse med både grundlæggende og translationel forskning. In vivo er de fleste væv er kendetegnet ved en rig ekstracellulær matrix og høj celledensitet. Cellemigrering derfor under fysiologiske betingelser, forekommer i et kompleks lukket miljø. Klassisk, sandsynligvis på grund af historiske grunde og tekniske begrænsninger, cellevandring er blevet undersøgt i flade 2D systemer, der ikke gengiver mange af de miljø egenskaber, der findes i væv, såsom indespærring. Desuden faktorer som celle adhæsion, som er afgørende for motilitet i 2D, er for nylig blevet vist ikke at være necessamært kræves for migration in vivo eller inde geler, hvilket tyder på, at de mekanismer, der regerer celle bevægelse i 2D og i andre miljøer er forskellige ^2. Adskillige systemer er blevet udviklet til at efterligne de komplekse egenskaber af væv, de mest berømte væsen kollagengeler, som sigter mod opridset egenskaberne for den ekstracellulære matrix sammensætning ^3. Her foreslår vi mikrokanaler som en simpel supplerende metode, der tillader undersøgelse cellemigrering i en dimension i et lukket miljø.

I dette system celler migrerer langs microchannels, som de indgår spontant. Vandrende celler derefter tilegne sig formen af ​​de kanaler, vedtage en rørformet geometri, der mest sandsynligt styrker deres polaritet. Den lineære bevægelse af cellerne i kanalerne muliggør automatisk cellesporing og udvindingen af ​​kvantitative parametre fra eksperimenter. Fra et teknisk synspunkt er nem og fleksibel dette system. Den coating kanalvæggene kan manipuleres, størrelsen og formen af ​​kanalerne kan tilpasses, og et stort antal celler kan analyseres i en enkelt forsøg. Dette system kan også skaleres op til at udføre mellemlang rækkevidde skærm analyse af molekyler, der er involveret i celle motilitet. Protokollen beskrevet her er blevet standardiseret ved hjælp af dendritiske celler (DC) som en cellulær model. Disse celler er nøglen til immunsystemet som de deltager i initiering og vedligeholdelse af specifikke immunreaktioner ^4.. In vitro har DCs vist sig at spontant migrere i lukkede miljøer, og er derfor en god model til at studere celle motilitet i microchannels ^5,6 . Vigtigere er det, kan dette system udvides til at analysere migration af andre bevægelige celletype som T-lymfocytter, neutrofiler eller tumorceller ^7-9.

Protocol

Vigtigt: Denne protokol antager, at formen indeholder formen for de ønskede microchannels allerede er foretaget. Yderligere oplysninger om forberedelse af formen er allerede blevet offentliggjort ^10.. Denne protokol forudsætter også, at knoglemarv DCs kulturen er kendt.

1.. Chip Fabrication

1. Bland PDMS olie og hærder ved et vægtforhold 10:01 i en plastik kop. Bland begge forbindelser grundigt.
2. Kast blandingen over formen bærende microchannels. Den totale højde skal være mellem 0,5-1 cm.
3. Fjern luftbobler i et vakuum krukke klokke i løbet af 1 time.
4. Hærde PDMS i formen ved at placere denne i en ovn i 2 timer ved 65 ° C.
5. Når PDMS er ved stuetemperatur, skåret et stort stykke omkring struktur med en kirurgisk kniv og skræl den fra formen (figur 1A).
6. Bor huller, hvor celler vil blive injiceret (typisk 2 mm) og ændre størrelsen på PDMSmed en kirurgisk kniv til at passe størrelsen til glasbund retter, hvor migration vil blive vurderet (Figur 1B). Før du fortsætter, fjernes resterende støv fra fadet ved hjælp linsepapir. Dette begunstiger bindingen af ​​PDMS til glas, der er beskrevet i trin 1.10.
7. Rengør skaleret PDMS chip, der indeholder de kanaler ved stikning og afskalning tape på strukturen sider.
8. Sonikeres PDMS stykker 30 sek i 70% ethanol for at fjerne støv og små PDMS partikler. Tør dem hurtigt bagefter ved at blæse ren luft.
9. Aktiver PDMS (strukturer opad), og kultur retter med luft (eller oxygen) plasma behandling i løbet af 30 sek ved 300 mTorr.
10. Placere begge aktiverede overflader i kontakt permanent holde PDMS til substratet. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge metalliske pincet til at trykke lidt på toppen af PDMS at tvinge kontakt mellem polymeren og glas skålen (figur 1C).
11. Inkubér chip i ovnen ved 65 ° C for 1 time for at styrke binding.

2. Overfladebehandling af Microchannels

1. Aktivér hele strukturen af ​​luft plasma ved 300 mTorr for 1 min. Dette vil fremme optagelse af væske ind i kanalerne på det næste trin.
2. Fyld hurtigt indrejsebetingelserne huller chip med fibronektin på 10 ug / ml i vand. Andre substrater, såsom PEG, kan anvendes til at modificere cellevedhæftning til kanalvæggene. Vær opmærksom på at væsken spredes i hele strukturen. Dette kan nemt kontrolleres ved øjet under almindeligt lys eller ved hjælp af en almindelig lysfelt mikroskop.
   BEMÆRK: I meget små strukturer, hvor diffusion er hårdere, optagelse af væske i kanalerne kan tvinges ved at placere struktur i et vakuum krukke klokke i mindst 15 minutter. For at verificere effektiviteten af overtrækket fluorescenssubstrater kan anvendes (figur 2).
3. Inkuber 1 time ved stuetemperatur for at tillade adsorption af fibronektin eller anden belægning substsats til væggene i kanalerne.
4. Vask strukturer 3x med PBS for at fjerne ikke-bundet substrat.
5. Efter vask, gå videre til protokol 3 eller opbevare chippen ved 4 ° C i en senere brug (24 timers maksimum).

3. Cell Loading

1. Fjern PBS fra pladen og fyld mikrosystem med cellemediet. Lad inkuberes i 1 time for at mætte de kanaler med mediet.
   BEMÆRK: forsøg med lægemidler, såsom molekyle inhibitorer, tilrådes det at præinkubere kanalerne med et medium indeholdende lægemidlet i rette koncentration. Desuden er nogle lægemidler har tendens til at opløseliggøre i PDMS struktur, hvilket reducerer den effektive koncentration. Er blevet foreslået nogle løsninger for at modvirke dette problem ^11-12.
2. Fjern flydende udviklingslandene og inddrive semi-vedhæftende celler ved at skylle med dyrkningsmedium. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer.
   BEMÆRK: kerne billeddannelse, en Hoechst 33342 farvning kan opnås på forhånd ved icubating 2 x 10 ⁶ celler i 30 minutter med farvestoffet ved 200 ng / ml i komplet medium. Vaskes to gange ved centrifugering for at fjerne overskud af farvestof før fortsætter protokollen.
3. Centrifuger cellerne ved 300 xg i løbet af 5 min (tid og hastighed kan være forskellige afhængigt af celletype) og kassér mediet. Fortynd pellet for at opnå en koncentration på 20 x 10 ⁶ celler / ml.
4. Fjern overskydende medie fra pladen og tøm indrejse huller i PDMS struktur ved hjælp af en mikropipette. Fyld poster med 5 ul celle løsning til at nå et beløb på 1 x 10 ⁵ celler i hver post hul.
   BEMÆRK: høj celledensitet er nødvendig for at fremme kontakt af cellerne med kanalerne. Lav celletæthed kan resultere i lave antal celler inde kanaler og svigt af eksperimentet.
5. Inkuber mikrochippen i 30 minutter ved 37 ° C i inkubatoren. Tilsæt 2 ml komplet medium forsøget skålen.
   BEMÆRK: Hele PDMS struktur skal be dækkes for at undgå udtørring af cellerne under eksperimentet. Hvis 2 ml er ikke nok, tilføje mere medium til helt at dække PDMS struktur.

4.. Imaging

1. Rengør den udvendige bund overflade retter med linsepapir før placere pladerne under mikroskop.
2. At analysere migration i stort antal celler, bruger 10X forstørrelse og bredt feltbelysning i en CO ₂ og temperatur udstyret video-mikroskop (figur 3). For at lette celle tracking, kan Hoechst farvning og UV-lys anvendes (se trin 3.2). Migration kan være også analyseres ved hjælp af konfokal mikroskopi for at få højere opløsning af cellulære strukturer i løbet af migration.
3. For time-lapse mikroskopi ved 10X, vælge et tidspunkt frekvens i henhold til den forventede celle hastighed (typisk 2 min for dendritiske celler migrerer med en hastighed på 5 m / min).
   Bemærk: Den her beskrevne protokol gør not omfatter analyse af celle migration parametre. Et par punkter er anført i diskussionen at rådgive læserne om hvordan vi kommer videre at udtrække oplysninger fra time-lapse film.

Representative Results

I hvert forsøg overfladen af PDMS er belagt med et molekyle tilpasset interesse undersøgelsen. Figur 2 viser kanaler overtrukket med et fluorescerende molekyle, PLL-g-PEG før og efter vask (trin 2.4). Et sådant eksperiment tillader kontrol af homogeniteten af ​​belægning i kanalerne.

Efter celle lastning, kan video mikroskopi udføres for at følge cellemigrering Figur 3A viser et eksempel på DC migrerer i mikrokanaler ved en densitet hensigtsmæssigt at spore cellerne.. Både fasekontrast og Hoechst farvning kan bruges til dette formål (se diskussionen). Teknikken er også kompatibel med fluorescerende konfokal mikroskopi højere opløsning, og kan bruges til at spore organeller eller cellulære strukturer. Figur 4B viser et eksempel på dynamikken af polymeriseret actin i at migrere DC'er udtrykker LifeActGFP.

Et eksempel på kvantificering af cellemotilitet analyseret i migrerende DC'er er vist i fig. 5. Figur 5A viser kymographs genereret fra WT eller Y27632 behandlede DC'er. Y27632 er et godt karakteriseret inhibitor af celle kontraktilitet og migration, og blev brugt til at verificere systemets evne til at detektere ændringer i hastighed. De kymographs kan yderligere analyseres for at udtrække position og størrelse af celler som en funktion af tiden, således at undersøgelse af forskellige parametre til at beskrive cellemigrering. 5B viser hastigheden af migrering spores af billeddannelse kerne positionering ved hjælp af en hjemmelavet software ^13. DC'er har en gennemsnitlig hastighed tæt på 6 um / min. Behandling med Y27632 markant, deres hastighed. Dette eksempel viser effekten af ​​den teknik, som tillader kvantificering af et stort antal celler i enkelt forsøg og anvendeligheden af ​​systemet til at påvise forskelle induceret af lægemiddelbehandlinger. Dette kan udvides til anvendelse af siRNA og screening af mole kyler involveret i kontrollen af ​​migration.

Figur 1.. Trin i kanaler forsamling. PDMS chip blev gentaget fra en kanal mug. (A) chip, der indeholder kanalerne blev ekstraheret direkte fra formen. (B) Chippen skaleres til at passe den eksperimentelle fad og et hul blev gjort for at tillade indrejse af cellerne. (C) Chippen blev endelig indsat på toppen af glasset skålen. (D og E) Skematisk repræsentation af enheden. (D) Set ovenfra. (E) Side view. Grønne genstande repræsenterer celler i eller ud kanaler (blå). Bar 1 cm.

es/ftp_upload/51099/51099fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51099/51099fig2.jpg "/>
Figur 2.. Overfladebehandling af kanaler med et fluorescerende substrat. (A) 5 m x 5 m kanaler inkuberet med fluorescerende PEG på 100 mg / ml i løbet af 1 time. (B) Billedet repræsenterer den resterende fluorescerende PEG efter PBS vask af kanalerne. Bar 50 um.

Figur 3.. Celler migrerer langs microchannels. Fasekontrast (grå) og nucleus farvning (blå) af celler migrerer i 5 m x 5 m microfabricated kanaler. (A) Enkelt billede udvindes fra en film af DCs migrerer langs kanaler. (B) Montage viser forskydningen af en udvælTED DC migrerer langs kanaler. Hvide pile angiver migrerende celler. Tidshorisont 1 img / 2 min. Bar 50 um.

Figur 4.. Eksempel på høj opløsning celler i microchannels. Høj opløsning billeddannelse af DCs migrerer langs enkelt microchannels. (A) Montage af fasekontrast billeder (1 img/20 sek) af en DC migrerer i en mikrokanalplade (100X forstørrelse). (B) Montage af en DC udtrykker lifeact (highlights polymeriseret actin), der viser overensstemmelsen mellem ordningen med fluorescens imaging (1 img/20 sek, 60X forstørrelse, enkelt optisk afsnit). Polymeriseret actin er vist i sort. Kanal størrelse 10 um bred x 5 m høj. Bar 10 um.

Figur 5.. Repræsentative resultater af udviklingslandenes migrerer langs microchannels. Denne figur illustrerer den type analyse, der kan gøres fra film af celler migrerer langs microchannels. 5A viser kymographs genereret fra time-lapse fasekontrast billeder af WT eller Y27632 behandlede udviklingslande migrerer i mikrokanaler (10X, 1 img / 2 min.) Figur 5B viser et eksempel på kvantificering af celle hastighed opnået efter sporing DC kernen ved hjælp af Hoechst-farvning og en hjemmelavet software ^13. Data analyseres ved hjælp af en ikke-parametrisk t-test (Mann-Whitney-test). Bar 100 um.

Discussion

Her beskriver vi en enhed bestående af mikrokanaler som en metode til at undersøge de migrerende egenskaber af store antal celler i enkelte eksperimenter. Denne eksperimentelle system efterligner de indespærrede miljømæssige begrænsninger, der findes i væv af endogene migrerende celler. Men ved at tvinge migration i en enkelt dimension, det letter automatisk cellesporing og udvindingen af measurables (figur 5). Vi viser også, at vores enhed er kompatibel med fluorescensmikroskopi og kan derfor tilpasses til at studere organel positionering under de forskellige faser af cellemotilitet (Figur 4).

Et kritisk trin i protokollen er kvaliteten af ​​kanalerne. Det er vigtigt at kontrollere den gode fastklæbning af PDMS på glasoverfladen. Når problemer af stikning vises de første ting at tjekke er renholdelse af begge flader og den ene af plasma renere. En anden parameter, der kan være kritisk er the tæthed af indlæste celler. Den spontane migration kræver nærhed af cellerne til de kanaler for at lette indrejse til rørene, og det optimale antal skal vurderes for hver celletype.

Som et eksempel har vi vist den spontane migrering af DC'er, men systemet kan anvendes til at analysere migrationen af ​​andre celletyper. I laboratoriet har vi testet primære T-lymfocytter, makrofager samt tumor cellelinier (data ikke vist og referencer ^7-9).

At analysere celle migration i kanalerne, har to vigtigste protokoller blevet testet. Den første kræver billedbehandling ved fasekontrast (10X), og er baseret på den automatiske registrering og generering af kymographs fra migrerende celler ³ (figur 5A). Velocity, cellestørrelse og vedholdenhed er blandt andre parametre, der kan udvindes fra kymographs. Dette system er begrænset af kvaliteten af ​​kymographs og til udvikling afsoftware til at generere og analysere dem. En anden og nemmere måde at kvantificere dataene er baseret på semi-automatiseret sporing af kernen under anvendelse af Hoechst-farvning (figur 3). Brugen af ​​fluorescens tillader sporing og analyse af migration med standard imaging software. Et eksempel på en sådan strategi er blevet udviklet til den første verden celle løb ^12.

Da overfladen af ​​PDMS kan adsorberes med stort set alle protein, kan microchannels bruges til at evaluere virkningen af ​​ekstracellulære matrix proteiner i celle migration. Geometri kanalerne kan også ændres, lette undersøgelse af konsekvenserne af fysiske begrænser i celle migration.

Endelig kan denne eksperimentelle system er indrettet til at erhverve flere betingelser i enkelte eksperimenter. Dette, sammen med en semi-automatiseret analyse, er forenelig med medium gennemløb screeninger for opdagelsen af ​​nye aktører inddraged i migration af kræftceller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2.5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254