Summary
Ein quantitatives Verfahren zur spontanen Migration von Zellen in einem eindimensionalen beschränkt Mikro studieren beschrieben. Dieses Verfahren nutzt den Vorteil der mikrogefertigten Kanälen und kann verwendet werden, um die Migration der Vielzahl von Zellen unter verschiedenen Bedingungen in einzelnen Experimenten zu untersuchen.
Abstract
Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Zellwanderung unter Einschluss in einer Dimension. Es basiert auf der Verwendung von mikrogefertigten Kanälen, die einen polarisierten Phänotyp Zellen durch physikalische Beschränkungen auferlegen basiert. Einmal in Kanäle, Zellen haben nur zwei Möglichkeiten: vorwärts oder rückwärts zu bewegen. Dies vereinfacht die Migration in dem Richtungs beschränkt erleichtert die automatische Verfolgung von Zellen und die Gewinnung von quantitativen Parameter für Zellbewegung beschreiben. Diese Parameter umfassen Zellgeschwindigkeit, Richtungsänderungen, und Pausen während der Bewegung. Mikrokanäle sind auch bei der Verwendung von Fluoreszenzmarkern kompatibel und eignen sich daher zur Lokalisation von intrazellulären Organellen und Strukturen während der Zellmigration bei hoher Auflösung zu untersuchen. Schließlich kann die Oberfläche der Kanäle mit verschiedenen Substraten funktionalisiert werden, wodurch die Kontrolle der Klebeeigenschaften der Kanäle oder der Untersuchung von Haptotaxis. Zusammenfassend ist das System here beschrieben soll die Migration großer Zellzahlen unter Bedingungen, bei denen sowohl die Geometrie und die biochemische Beschaffenheit der Umgebung gesteuert analysieren, die Erleichterung der Normalisierung und Reproduzierbarkeit der unabhängigen Experimenten.
Introduction
Migration ist eine komplexe zelluläre Funktion, die wichtig für viele physiologische Prozesse in mehrzelligen Organismen, einschließlich der Entwicklung, Immunreaktionen und Geweberegeneration. Darüber hinaus können bestimmte pathologische Situationen wie der Tumorinvasion und Metastasenbildung beruhen auf Zellmotilität 1. Aus diesen Gründen hat die Zellwanderung zu einem wichtigen Feld der Studie im Rahmen der Grundlagen-und translationalen Forschung. In vivo werden die meisten Gewebe von einem reichen extrazellulären Matrix und hohe Zelldichte aus. Zellmigration daher unter physiologischen Bedingungen tritt in einer komplexen Umgebung beschränkt. Klassisch, wahrscheinlich aus historischen Gründen und technischen Grenzen, Zellmigration hat in flachen 2D-Systemen, die sich nicht fortpflanzen viele der Umgebungseigenschaften in Geweben, wie der Entbindung gefunden sucht. Außerdem Faktoren wie Zelladhäsion, die für Beweglichkeit in 2D sind, wurden kürzlich zeigte nicht necessa seinRily für die Migration in vivo oder in Gelen erforderlich, was darauf hindeutet, dass die Mechanismen, die Zellbewegung in 2D und in anderen Umgebungen herrschen verschieden sind 2. Verschiedene Systeme wurden entwickelt, um die komplexen Eigenschaften der Gewebe, die bekanntesten sind Kollagengele, die an rekapituliert die Eigenschaften der extrazellulären Matrix 3 zielen imitieren. Hier schlagen wir Mikrokanäle als einfache ergänzende Methode, die die Untersuchung der Zellmigration in einer Dimension unter einer geschlossenen Umgebung ermöglicht.
In diesem System Zellen wandern entlang Mikrokanäle, in die sie spontan ein. Wandernden Zellen erwerben dann die Form der Kanäle, die Annahme eine röhrenförmige Geometrie, die am ehesten verstärkt ihre Polarität. Die lineare Bewegung der Zellen in den Kanälen ermöglicht die automatische Tracking-Zelle und die Gewinnung von quantitativen Parameter aus Experimenten. Aus technischer Sicht ist dieses System einfach und flexibel. Die coating der Kanalwände kann manipuliert werden, die Größe und die Form der Kanäle angepasst werden kann, und eine große Anzahl von Zellen kann in Einzelexperimenten untersucht werden. Dieses System kann auch skaliert-up werden bis mittleren Bereich Bildschirm Analyse von Molekülen in Zellbewegung beteiligt durchzuführen. Das hier beschriebene Protokoll wurde unter Verwendung von dendritischen Zellen (DC) als ein zelluläres Modell standardisiert. Diese Zellen sind der Schlüssel für das Immunsystem, wie sie bei der Initiierung und Aufrechterhaltung von spezifischen Immunantworten beteiligt 4. In vitro DCs wurde gezeigt, spontan in engen Umgebungen zu wandern und sind daher ein gutes Modell, um die Zellbeweglichkeit in Mikro 5,6 studieren . Wichtiger ist, kann das System erweitert werden, um die Migration von einem anderen beweglichen Zelltyp als T-Lymphozyten, Neutrophile, oder Tumorzellen 7-9 analysieren.
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Protocol
Wichtiger Hinweis: Dieses Protokoll geht davon aus, dass die Form, die die Form für die gewünschte Mikrokanälen wurde bereits gemacht. Weitere Informationen über die Herstellung der Form wurde bereits veröffentlicht 10. Dieses Protokoll setzt voraus, dass Knochenmark-DCs Kultur bekannt ist.
1. Chipfertigungs
- Mix PDMS Öl und Härter in einem Gewichtsverhältnis 10.01 Uhr in einem Plastikbecher. Das Vermischen der beiden Verbindungen gründlich.
- Werfen Sie die Mischung über den Formlagermikrokanäle. Die Gesamthöhe muss zwischen 0,5-1 cm sein.
- Luftblasen in einem Vakuumgefäß Glocke während 1 Stunde.
- Harden PDMS in der Form durch Anordnen des letzteren in einem Ofen für 2 Stunden bei 65 ° C.
- Sobald das PDMS ist bei Raumtemperatur ein großes Stück geschnitten, auf der Struktur mit einer chirurgischen Klinge und ziehen es aus der Form (Fig. 1A).
- Löcher bohren, wo Zellen injiziert werden (typischerweise 2 mm) und die Größe des PDMSmit einem chirurgischen Messer, um die Größe zu Glasbodenschalen, in denen Migration bewertet werden (Abbildung 1B) passen. Bevor Sie fortfahren, entfernen Reststaub aus der Schüssel mit Linsenreinigungspapier. Dies begünstigt die Bindung von PDMS in Schritt 1.10 beschrieben Glas.
- Reinigen Sie die Größe verändert PDMS-Chip enthält die Kanäle durch Festhalten und Peeling Klebeband auf den Struktur Seiten.
- Beschallen der PDMS-Stücke 30 Sekunden in 70% Ethanol, um Staub und kleine PDMS Partikel zu entfernen. Trocknen Sie sie anschließend schnell durch Einblasen von sauberer Luft.
- Aktivieren Sie die PDMS (Strukturen oben) und Kulturschalen von Luft (oder Sauerstoff) Plasma-Behandlung während 30 Sekunden bei 300 Torr.
- Legen Sie beide aktivierten Oberflächen in Kontakt, um die PDMS dauerhaft halten Sie sich an das Substrat. Falls erforderlich, verwenden Sie Metallzange, um oben auf dem PDMS leicht drücken, um den Kontakt zwischen dem Polymer und dem Glas der Schale (Abbildung 1C) zu zwingen.
- Inkubieren der Chip in dem Ofen bei 65 ° C for 1 Stunde die Bindung zu stärken.
2. Beschichtung von Mikrokanälen
- Aktivieren Sie die ganze Struktur, die durch Luft-Plasma bei 300 Torr für 1 min. Dadurch wird der Eintritt von Flüssigkeit in die Kanäle in dem nächsten Schritt zu fördern.
- Füllen Sie schnell die Eintrittslöcher des Chips mit Fibronektin bei 10 ug / ml in Wasser. Andere Substrate, wie PEG verwendet werden, um die Zellhaftung an den Kanalwänden zu modifizieren. Achten Sie darauf, dass die Flüssigkeit durch die gesamte Struktur ausbreitet. Dies kann leicht mit dem Auge unter normalen Licht oder mit einem normalen Hellfeld-Mikroskop überprüft werden.
Hinweis: in sehr kleinen Strukturen, in denen die Diffusion härter Eintritt von Flüssigkeit in den Kanälen kann durch Anordnen der Struktur in einem Vakuumgefäß Glocke während mindestens 15 Minuten gezwungen. Um die Effizienz des Beschichtungs fluoreszierende Substrate verwendet werden (Fig. 2) zu überprüfen. - Inkubiere 1 h bei Raumtemperatur, um die Adsorption von Fibronektin oder andere Beschichtungs subst ermöglichenGeschwindigkeit an den Wänden der Kanäle.
- Waschen Sie die Strukturen 3x mit PBS, um die nicht gebundenen Substrat zu entfernen.
- Nach dem Waschen des Protokolls Nr. 3 fahren oder lagern Sie den Chip bei 4 ° C für eine spätere Verwendung (24 Stunden maximal).
3. Zell Loading
- Entfernen Sie die PBS von der Platte und füllen das Mikrosystem mit Zellmedium. Lassen Inkubation für 1 Stunde, um die Kanäle mit dem Medium zu sättigen.
HINWEIS: Für Experimente mit Drogen wie molekularen Inhibitoren, ist es ratsam, die Kanäle mit einem Medium, das Medikament in der richtigen Konzentration vorinkubiert. Darüber hinaus neigen einige Medikamente in der PDMS-Struktur, die die effektive Konzentration reduziert lösen. Einige Lösungen vorgeschlagen worden, um dieses Problem zu 11-12 entgegenzuwirken. - Entfernen und wieder schwimm DCs halb adhärenten Zellen durch Spülen mit Kulturmedium. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
HINWEIS: Für die Zellkern-Bildgebung, eine Hoechst 33342-Färbung kann vorher durch dadurch erreicht werden,cubating 2 x 10 6 Zellen für 30 min mit dem Farbstoff bei 200 ng / ml in vollständigem Medium. Zweimal waschen durch Zentrifugation, um überschüssige Farbstoff bevor das Protokoll zu entfernen. - Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g während 5 min (Zeit und Geschwindigkeit kann unterschiedlich sein, je nach Zelltyp) und entsorgen Sie das Medium. Verdünnt das Pellet eine Konzentration von 20 x 10 6 Zellen / ml zu erreichen.
- Entfernen Sie das überschüssige Medium von der Platte und leeren die Eintrittslöcher in der PDMS-Struktur mit einer Mikropipette. Füllen Sie die Einträge mit 5 ul Zelllösung, einen Betrag von 1 x 10 5 Zellen in jedem Eingangsloch zu erreichen.
HINWEIS: hohe Zelldichte erforderlich, um den Kontakt der Zellen mit den Kanälen zu begünstigen. Niedrige Zelldichte kann in geringen Anzahl von Zellen in Kanälen und Ausfall des Experiments führen. - Inkubieren des Mikrochips für 30 min bei 37 ° C im Brutschrank. 2 ml Vollmedium dem Experiment Schale.
HINWEIS: Die ganze Struktur PDMS muss be um das Trocknen der Zellen während des Experiments zu vermeiden bedeckt. Wenn 2 ml ist nicht genug, fügen Sie mehr Medium, um die PDMS-Struktur vollständig zu bedecken.
4. Imaging
- Die externe Bodenfläche der Gerichte mit Linsenreinigungstuch reinigen, bevor die Platten unter dem Mikroskop.
- Um die Migration in große Anzahl von Zellen zu analysieren, verwenden Sie 10-facher Vergrößerung und Weitfeldbeleuchtung in einem CO 2 und Temperatur ausgestattet Video-Mikroskop (Abbildung 3). Um die Zellverfolgung zu erleichtern, kann der Hoechst-Färbung und UV-Licht verwendet werden (siehe Schritt 3.2). Migration kann mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, um eine höhere Auflösung zellulärer Strukturen während der Migration erhalten auch analysiert.
- Für Zeitraffer-Mikroskopie bei 10X, wählen Sie eine Zeit-Frequenz entsprechend der erwarteten Zellzahl (typischerweise 2 min für die Migration dendritischer Zellen mit einer Geschwindigkeit von 5 um / min).
Hinweis: Die hier beschriebenen Protokoll funktioniert not zählen die Analyse der Zellmigration Parameter. Ein paar Punkte sind in der Diskussion, um die Leser auf, wie Sie vorgehen, um Informationen von Zeitraffer-Filmen extrahieren beraten aufgelistet.
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Representative Results
In jedem Experiment wird die Oberfläche des PDMS mit einem Molekül, das Interesse der Studie geeignet beschichtet. 2 zeigt Kanäle mit einem fluoreszierenden Molekül, PLL-g-PEG beschichtete vor und nach dem Waschen (Schritt 2.4). Ein solches Experiment ermöglicht die Steuerung der Homogenität der Beschichtung in den Kanälen.
Nach Beladung der Zellen können Videomikroskopie durchgeführt, um Zellmigration zu folgen. Fig. 3A zeigt ein Beispiel eines DC Migration in Mikrokanälen in einer Dichte angebracht, die Zellen zu verfolgen. Beide, Phasenkontrast-und Hoechst-Färbung kann für diesen Zweck verwendet werden (siehe Diskussion). Die Technik ist auch mit fluoreszierenden konfokale Mikroskopie mit höherer Auflösung kompatibel, und kann verwendet werden, um Organellen oder Zellstrukturen zu verfolgen. 4B zeigt ein Beispiel der dynamischen polymerisiertes Actin in Migration DCs exprimieren LifeActGFP.
Ein Beispiel für die Quantifizierung von ZellBeweglichkeit, die in der Migration DCs analysiert ist in Abbildung 5 dargestellt. 5A zeigt Kymographen von WT oder Y27632 behandelt DCs generiert. Y27632 ist ein gut charakterisiertes Inhibitor der Zellmigration und Kontraktilität, und wurde verwendet, um die Fähigkeit des Systems auf Veränderungen in der Geschwindigkeit zu erfassen überprüfen. Die Kymographen weiter analysiert, um zu extrahieren, Position und Größe der Zellen als Funktion der Zeit, so dass die Untersuchung der verschiedenen Parameter, die die Zellmigration zu beschreiben. 5B zeigt die Geschwindigkeit der Migration von Abbildungskern Positionierung mit einer hausgemachten Software 13 verfolgt. DCs haben eine mittlere Geschwindigkeit knapp 6 um / min. Die Behandlung mit Y27632 verringert ihre Geschwindigkeit deutlich. Dieses Beispiel zeigt die Leistung der Technik, die die Quantifizierung der großen Anzahl von Zellen in einzelnen Experimenten und die Nützlichkeit des Systems, um Unterschiede von medikamentösen Behandlungen induziert wird ermöglicht. Dies kann auf die Verwendung von siRNA und Screening von Mol verlängert Moleküle in der Steuerung der Migration beteiligt.
Abbildung 1. Schritte in Kanälen Montage. PDMS-Chip wurde von einem Kanal Form repliziert. (A) Die Chip-Kanäle enthält, wurde direkt aus der Form extrahiert. (B) Der Chip in der Größe verändert, um die experimentellen Gericht und ein Loch passen wurde gemacht, um den Eintritt der Zellen zu ermöglichen. (C) Der Chip wurde schließlich auf der Oberseite der Glasschale geklebt. (D und E) Schematische Darstellung der Vorrichtung. (D) Draufsicht. (E) Seitenansicht. Grüne Objekte repräsentieren Zellen in oder aus Kanälen (blau). Bar 1 cm.
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2. Beschichtung von Kanälen mit einem fluoreszierenden Substrat. (A), 5 &mgr; m × 5 &mgr; m Kanäle mit fluoreszierenden PEG bei 100 ug / ml während 1 Stunde inkubiert. (B) Abbildung stellvertretend für die Restleuchtstoff PEG nach PBS Waschen der Kanäle. Bar 50 um.
Abbildung 3. Zellen migrieren entlang Mikrokanäle. Phasenkontrast-(grau) und Kernfärbung (blau) von wandernden Zellen in 5 um x 5 um mikro Kanäle. (A) Einzelbild aus einem Film von DCs Migration entlang von Kanälen extrahiert. (B) Montage, welches die Verlagerung eines Auswahlted DC Migration entlang von Kanälen. Weiße Pfeile zeigen wandernden Zellen. Zeitskala 1 img / 2 min. Bar 50 um.
Abbildung 4. Beispiel für hochauflösende Zellen in Mikrokanälen. Hochauflösende Bildgebung von DCs Migration entlang einzigen Mikrokanäle. (A) Montage der Phasenkontrast-Aufnahmen (1 img/20 sec) einer Gleich Migration in einem Mikrokanal (100X Vergrößerung). (B) Montage eines DC-exprimierenden LifeAct (Highlights polymerisiert Actin), die Kompatibilität des Systems mit Fluoreszenz-Bildgebung (1 img/20 sec, 60X Vergrößerung, einzelne optische Abschnitt). Polymerized Aktin ist in schwarz dargestellt. Kanalgröße 10 um breit x 5 um hoch. Bar 10 um.
Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse der DCs Migration entlang Mikrokanäle. Diese Abbildung zeigt die Art der Analyse, die aus Filmen von Zellen durchgeführt werden kann Migration entlang Mikrokanäle. 5A zeigt Kymographen von Zeitraffer-Phasenkontrastbilder von WT oder Y27632 behandelt DCs in der Migration erzeugt Mikrokanäle (10X, 1 img / 2 min). 5B zeigt ein Beispiel für die Quantifizierung von Zellverfolgungsgeschwindigkeit nach der DC-Kern mit Hoechst-Färbung und einer hausgemachten Software 13 erhalten. Daten werden unter Verwendung eines nicht-parametrischen T-Test (Mann-Whitney-Test) analysiert. Bar 100 um.
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Discussion
Hier beschreiben wir ein Gerät von Mikrokanälen zusammengesetzt als eine Methode, um die Migrationseigenschaften der großen Anzahl von Zellen in einzelnen Experimenten zu untersuchen. Dieses experimentelle System ahmt die begrenzten Umweltauflagen im Gewebe durch endogene wandernden Zellen gefunden. Jedoch durch die Migration zwingt in einer einzigen Dimension, ermöglicht es die automatische Tracking-Zelle und die Gewinnung von Messgrößen (Abbildung 5). Wir zeigen auch, dass unser Gerät ist mit Fluoreszenzmikroskopie kompatibel und kann daher angepasst, um Organellen-Positionierung während der verschiedenen Phasen des Zellbeweglichkeit (Abbildung 4) zu untersuchen.
Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Qualität der Kanäle. Es ist wichtig, die gute Haftung der PDMS auf der Glasoberfläche zu steuern. Wenn Probleme des Klebens erscheinen die ersten Dinge, um zu überprüfen, sind die Sauberkeit der beiden Oberflächen und der von der Plasmareiniger. Ein weiterer Parameter, der kritisch werden kann, ist thE Dichte von beladenen Zellen. Die spontane Migration benötigt Nähe der Zellen zu den Kanälen, um den Eintritt in die Rohre zu ermöglichen, und die optimale Zahl für jedes Zelltyps bewertet.
Als Beispiel haben wir die spontane Migration von DCs gezeigt, aber das System kann verwendet werden, um die Migration von anderen Zelltypen zu analysieren. Im Labor haben wir primären T-Lymphozyten, Makrophagen und Tumorzelllinien (Daten nicht gezeigt und Referenzen 7-9) getestet.
Um die Zellwanderung in den Kanälen zu analysieren, wurden zwei wichtigsten Protokolle getestet. Die erste erfordert Bildgebung durch Phasenkontrast (10x) und auf der automatischen Erkennung und Erzeugung von wandernden Zellen Kymographen 3 (Fig. 5A) bezogen. Geschwindigkeit, Zellgröße und Ausdauer sind unter anderem Parameter, die von Kymographen extrahiert werden können. Dieses System wird durch die Qualität der Kymographen und zur Entwicklung beschränktdie Software zu erzeugen und zu analysieren. Eine zweite und einfacher Weg, um die Daten zu quantifizieren ist auf dem Halb automatisierte Nachführung des Kerns mit Hoechst-Färbung (Fig. 3) auf. Die Verwendung von Fluoreszenz erlaubt die Nachverfolgung und Analyse von Migrations mit Standard-Bildbearbeitungssoftware. Ein Beispiel einer solchen Strategie ist die weltweit erste Zellenring 12 entwickelt.
Da die Oberfläche des PDMS mit praktisch jedem Protein adsorbiert werden, können Mikrokanäle verwendet werden, um die Wirkung von extrazellulären Matrixproteinen in Zellmigration zu bewerten. Die Geometrie der Kanäle kann verändert werden, erleichtert die Untersuchung der Auswirkungen der physikalischen Zwänge bei der Zellmigration.
Schließlich kann dieses experimentelle System angepasst, um mehrere Bedingungen in einzelnen Experimenten zu erwerben. Dies, zusammen mit einer semi-automatisierte Analyse ist mit mittlerem Durchsatz-Screenings zur Entdeckung von neuen Akteuren kompatibel beinhaltend in der Migration von Krebszellen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen die stark PICT IBiSA Plattform am Institut Curie (CNRS UMR144). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse finanziert: dem Europäischen Forschungsrat zu AM.LD (Strapacemi 243103), der Verband Nationale pour la Recherche (ANR-09-Piri-0027-PCVI), der InnaBiosanté Fundament (Micemico) zu MP und Uhr. LD und der ERC Nachwuchs Strapacemi Zuschuss AM.LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Package of 90% silicone base and 10% curing agent |
| Core sample cutter | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diameter 2.5 mm |
| Glass-bottom dish | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32 G | For small samples (35 dishes). A bigger version is also available |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
References
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