Study of Cell Migration i microfabricated Kanaler

Summary

En kvantitativ metode for å studere spontan migrasjon av celler i en en-dimensjonal begrenset mikromiljø er beskrevet. Denne fremgangsmåte utnytter microfabricated kanaler, og kan brukes til å studere migrering av store antall celler under forskjellige betingelser i enkle eksperimenter.

Abstract

Fremgangsmåten er beskrevet her tillater studiet av cellemigrasjon i lukket rom i en dimensjon. Den er basert på bruk av microfabricated kanaler, som pålegger en polarisert fenotype til celler av fysiske begrensninger. Når du er inne kanaler, celler har bare to muligheter: flytter du fremover eller bakover. Dette forenklede migrasjon der retningen er begrenset letter automatisk sporing av celler og utvinning av kvantitative parametre for å beskrive celle bevegelse. Disse parametrene inkluderer celle hastighet, endringer i retning, og pauser under bevegelse. Mikrokanaler er også kompatible med bruken av fluorescerende markører, og er derfor egnet for å studere lokalisering av intracellulære organeller og strukturer under cellemigrasjon med høy oppløsning. Til slutt, kan overflaten av kanalene bli funksjonalisert med forskjellige substrater, slik at kontrollen av de adhesive egenskaper til de kanaler eller studiet av haptotaxis. Oppsummert, systemet here er beskrevet er ment å analysere migrering av store antall celler under forhold hvor både geometri og den biokjemiske natur av miljøet er styrt, til rette for normalisering og reproduserbarheten av uavhengige eksperimenter.

Introduction

Migrasjon er en kompleks cellular funksjon som er viktig for mange fysiologiske prosesser i flercellede organismer, inkludert utvikling, immunreaksjoner, og vev gjenfødelse. I tillegg er visse patologiske situasjoner som tumor invasjon og metastase er avhengige av celle motilitet ^1.. Av disse grunner, og cellemigrasjon blitt et stort fagområde i sammenheng med både fundamentalt og translasjons-forskning. In vivo er de fleste vev, karakterisert ved en rik ekstracellulær matriks og med høy celletetthet. Cell migrering derfor under fysiologiske betingelser, forekommer i en kompleks avgrenset miljø. Klassisk, mest sannsynlig på grunn av historiske årsaker og tekniske begrensninger, celle migrasjon har blitt studert i flate 2D-systemer som ikke reproduserer mange av de miljøegenskapene som finnes i vev, for eksempel innesperring. Videre faktorer som celle adhesjon, som er avgjørende for motilitet i 2D, har blitt nylig viste å ikke være nødvendifremst nødvendig for migrasjon in vivo eller inne gels, noe som tyder på at de mekanismene som styrer celle locomotion i 2D og i andre miljøer er tydelig ^to. Flere systemer har blitt utviklet for å etterligne de komplekse egenskaper vev, den mest kjente var kollagen gels, som tar sikte på å rekapitulere egenskapene til den ekstracellulære matrise sammensetning ^tre. Her foreslår mikrokanaler som et enkelt komplementær metode som gjør det mulig å studere celle migrasjon i en dimensjon under et avgrenset miljø.

I dette systemet celler migrere langs mikrokanaler i hvilke de går inn spontant. Trekk cellene deretter skaffe formen av kanalene, å innta en rørformet geometri som mest sannsynlig forsterker deres polaritet. Den lineære bevegelse av cellene i kanalene tillater automatisk celle sporing og utvinning av kvantitative parametere fra eksperimenter. Fra teknisk synspunkt, er enkelt og fleksibelt dette systemet. Den beleg av kanalveggene kan manipuleres, er størrelsen og formen på kanalene kan tilpasses, og et stort antall celler kan bli analysert i enkle eksperimenter. Dette systemet kan også skalert opp for å utføre mellomområde siktanalyse av molekyler som er involvert i celle motilitet. Protokollen er beskrevet her er standardisert ved hjelp av dendrittiske celler (DC) som en mobil modell. Disse cellene er nøkkelen til immunsystemet som de deltar i initiering og opprettholdelse av spesifikke immunresponser ^4.. In vitro har DC vist seg å spontant migrere i lukkede omgivelser og derfor er en god modell for å studere celle motilitet i mikro ^5,6 . Viktigere, kan dette systemet bli utvidet til å analysere migrering av eventuelle andre bevegelige celletype som T-lymfocytter, nøytrofile, eller tumorceller ^7-9.

Protocol

Viktig merknad: Denne protokollen forutsetter at formen inneholder formen for de ønskede microchannels er allerede gjort. Ytterligere informasjon om utarbeidelse av formen er allerede publisert ^10. Denne protokollen forutsetter også at beinmargs DCs kultur er kjent.

En. Chip Fabrication

1. Bland PDMS olje og herdemiddel i et vektforhold 10:01 i en plastkopp. Bland begge forbindelser grundig.
2. Kast mix over mold bærende microchannels. Den totale høyden må være mellom 0,5-1 cm.
3. Fjerner luftbobler i en vakuum-jar bell løpet av 1 time.
4. Forherd PDMS i støpeformen ved å plassere den sistnevnte i en ovn i 2 timer ved 65 ° C.
5. Når PDMS er ved romtemperatur, skjære et stort stykke rundt strukturen med et kirurgisk blad og skrelles av fra støpeformen (fig. 1A).
6. Bor hull der cellene vil bli injisert (typisk 2 mm) og endre størrelse på PDMSmed en kirurgisk kniv for å passe størrelsen på glassbunn retter der migrasjon vil bli vurdert (Figur 1B). Før du fortsetter, fjerne støvrester fra fatet ved hjelp av linsepapir. Dette favoriserer binding av PDMS til glass som er beskrevet i trinn 1.10.
7. Rengjør endret størrelse PDMS chip som inneholder kanalene ved å stikke og peeling teip på strukturen sider.
8. Sonicate de PDMS stykker 30 sek i 70% etanol for å fjerne støv og små PDMS partikler. Tørk dem raskt etterpå ved å blåse ren luft.
9. Aktiver PDMS (strukturer oppover) og kultur retter med fly (eller oksygen) plasma behandling i løpet av 30 sek på 300 mTorr.
10. Plasser begge aktivert flater i kontakt for å permanent feste PDMS til underlaget. Hvis det er nødvendig, å bruke metall tang til å trykke svakt på toppen av PDMS å tvinge kontakten mellom polymeren og glasset på fatet (figur 1C).
11. Inkuber chip i stekeovnen ved 65 ° C for 1 time for å styrke bindingen.

2. Belegg av mikro

1. Aktivering hele strukturen av luft plasma ved 300 mTorr på 1 min. Dette vil fremme den inngang av væske inn i kanalene i det neste trinn.
2. Fyll hurtig hullene på brikken med fibronektin inngangs ved 10 mikrogram / ml i vann. Andre substrater som for eksempel PEG kan brukes for å modifisere cellene skulle vedhefte til kanalveggene. Vær oppmerksom på at væsken sprer seg gjennom hele strukturen. Dette kan enkelt sjekkes ved øyet etter vanlig lys eller bruke en vanlig lyse felt mikroskop.
   MERK: I meget små strukturer, hvor diffusjon er hardere, oppføring av væsken i kanalene kan tvinges ved å plassere strukturen i et vakuum jar bell i minst 15 min. For å verifisere effektiviteten av belegget fluorescerende substrater kan anvendes (fig. 2).
3. Inkuber i 1 time ved romtemperatur for å tillate adsorpsjon av fibronektin eller andre belegg substsats til veggene i kanalene.
4. Vask strukturene 3x med PBS for å fjerne nonbound substratet.
5. Etter vasking, fortsett til protokoll 3 og lagres chip ved 4 ° C i et senere bruk (24 hr maksimum).

Tre. Cell Loading

1. Fjern PBS fra platen og fylle mikro med cellemedium. Let inkuberes i 1 time for å mette kanalene med medium.
   MERK: For forsøk med stoffer som molekyl hemmere, er det anbefalt å forinkubere kanalene med et medium som inneholder stoffet til rett konsentrasjon. Videre har noen stoffer har en tendens til å oppløseliggjøre i det PDMS struktur som reduserer den effektive konsentrasjon. Noen løsninger har vært foreslått for å motvirke dette problemet ^11-12.
2. Fjern flytende DC og gjenopprette semi-adherente celler ved å spyle med kulturmedium. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
   MERK: For kjernen bildebehandling, en Hoechst 33342 flekker kan oppnås på forhånd med iinkubering av 2 x 10 ^6-celler i løpet av 30 min med fargestoff på 200 ng / ml i komplett medium. Vask to ganger ved sentrifugering for å fjerne overskudd av fargestoff før fortsetter protokollen.
3. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min (tid og hastighet kan være forskjellig avhengig av celletype) og kast mediet. Fortynn pellet for å nå en konsentrasjon på 20 x 10. ⁶ celler / ml.
4. Fjern overskudd av medium fra platen og tøm hullene hindringer i PDMS struktur ved hjelp av en mikropipette. Fyll innlegg med 5 mL av celleløsningen for å oppnå en mengde av 1 x 10 ⁵ celler i hver inngangshullet.
   MERK: høy celletetthet som kreves for å favorisere kontakten av cellene med kanaler. Lav celletetthet, kan resultere i lave antall celler inne kanaler og feil ved forsøket.
5. Inkuber mikrobrikke i 30 min ved 37 ° C i inkubatoren. Tilsett 2 ml fullstendig medium til forsøket fatet.
   MERK: Hele PDMS strukturen må be dekket for å unngå uttørking av cellene i løpet av eksperimentet. Hvis 2 ml er ikke nok, legge mer medium å fullstendig dekke PDMS struktur.

4. Imaging

1. Rengjør den ytre bunnen overflaten av retter med linsepapir før du legger platene under mikroskopet.
2. For å analysere migrasjon i stort antall celler, bruk 10X forstørrelse og bredt betraktningsfelt og lyser i en _CO2-og temperatur utstyrt video-mikroskop (figur 3). For å lette celle sporing, kan Hoechst flekker og UV-lys brukes (se trinn 3.2). Migrasjon kan være også analysert ved hjelp konfokalmikroskopi for å få høyere oppløsning på cellulære strukturer under trekket.
3. For time-lapse mikroskopi ved 10X, velger en tidsfrekvens i henhold til den forventede cellehastighet (vanligvis 2 min for dendrittiske celler som migrerer med en hastighet på 5 mikrometer / min).
   Merk: Protokollen er beskrevet her gjør not omfatter analysen av cellemigrerings parametere. Noen punkter er listet opp i diskusjonen for å gi råd til leserne på hvordan du går frem for å trekke ut informasjon fra time-lapse filmer.

Representative Results

I hvert forsøk overflaten av PDMS er belagt med et molekyl som er tilpasset til interesse for studiet. Figur 2 viser kanaler er belagt med et fluoriserende molekyl, PLL-g-PEG, før og etter vasking (trinn 2.4). Et slikt eksperiment tillater kontroll av homogeniteten av belegget i kanalene.

Etter celle lasting, kan videomikroskopi utføres for å følge cellemigrering. Figur 3A viser et eksempel på DC migrere i mikrokanaler i en tetthet hensiktsmessig å spore cellene. Begge, fasekontrast og Hoechst farging kan anvendes for dette formål (se diskusjon). Teknikken er også kompatibel med fluorescerende konfokal mikroskopi ved høyere oppløsning, og kan brukes til å spore organeller eller cellulære strukturer. Figur 4B viser et eksempel på en dynamisk av polymeriserte actin i å migrere DC som uttrykker LifeActGFP.

Et eksempel på kvantifisering av cellemotilitet analysert i trekkende DCS er vist i figur 5.. Figur 5A viser kymographs generert fra WT eller Y27632 behandlede DC. Y27632 er en godt karakterisert inhibitor av celle kontraktilitet og migrering, og ble brukt for å verifisere evnen til systemet for å detektere forandringer i hastighet. De kymographs kan bli ytterligere analysert for å trekke ut av posisjon og størrelse av celler som en funksjon av tid, slik at undersøkelse av forskjellige parametere for å beskrive cellemigrering. Figur 5B viser hastigheten på migrasjonen spores av avbildningskjernen posisjonering ved hjelp av et hjemmelaget ¹³ programvare. DC har en midlere hastighet i nærheten av 6 um / min. Behandling med Y27632 reduseres betydelig deres hastighet. Dette eksempel viser effekt av teknikken, som tillater kvantifisering av store antall celler i enkle eksperimenter, og nytten av systemet for å oppdage forskjeller forårsaket av medikamentbehandlinger. Dette kan utvides til bruk av siRNA og screening av mole cules involvert i kontroll av migreringen.

Figur 1. Steps i kanaler forsamlingen. PDMS chip ble kopiert fra en kanal mold. (A) Et chip som inneholder kanalene ble ekstrahert direkte fra formen. (B) Brikken endret for å passe den eksperimentelle fatet og et hull er laget for å tillate oppføring av cellene. (C) Brikken ble endelig limt på toppen av glasset fatet. (D og E) Skjematisk fremstilling av enheten. (D) Sett ovenfra. (E) fra siden. Grønne gjenstander representerer celler i eller ut kanaler (blå). Bar 1 cm.

es/ftp_upload/51099/51099fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51099/51099fig2.jpg "/>
Figur 2. Coating av kanaler med et fluorescerende substrat. (A) 5 mikrometer x 5 mikrometer kanaler inkubert med fluoriserende PEG 100 mikrogram / ​​ml i løpet av 1 time. (B) Bilde representant for den resterende fluorescerende PEG etter PBS vask av kanalene. Bar 50 mikrometer.

Figur 3. Cells migrerer langs microchannels. Fase kontrast (grå) og nucleus farging (blå) av celler migrerer i 5 mikrometer x 5 mikrometer microfabricated kanaler. (A) Ett bilde hentet fra en film av DCs migrere langs kanalene. (B) Montasje som viser forskyvningen av en selected DC migrerer langs kanalene. Hvite piler indikerer migrerende celler. Tidsskalaen en img / 2 min. Bar 50 mikrometer.

Figur 4. Eksempel på høyoppløselige celler i microchannels. Høyoppløselig avbildning av DCs migrere langs enkelt microchannels. (A) Montasje av fasekontrastbilder (1 img/20 sek) til en DC-trekkende på en microchannel (100 x forstørrelse). (B) Montage av en DC uttrykke lifeact (høydepunkter polymerisert aktin) viser kompatibilitet av systemet med fluorescens imaging (1 img/20 sek, 60x forstørrelse, enkelt optisk avsnitt). Polymerisert aktin vises i svart. Kanal størrelse 10 mikrometer brede x 5 mikrometer høy. Bar 10 mikrometer.

Figur 5. Representative resultater av DCs migrere langs microchannels. Denne figuren illustrerer den type analyse som kan gjøres fra filmer av celler migrerer langs microchannels. Figur 5A viser kymographs generert fra time-lapse fase bilder kontrast av WT eller Y27632 behandlet DCs migrere i mikrokanaler (10x, 1 img / 2 min). Figur 5B viser et eksempel på kvantifisering av cellehastighet erholdt etter sporing DC kjernen ved hjelp av Hoechst farging og en hjemmelaget ¹³ programvare. Data ble analysert ved bruk av en ikke-parametriske t-test (Mann-Whitney-test). Bar 100 mikrometer.

Discussion

Her beskriver vi en anordning som består av mikrokanaler som en metode for å studere de trekkende egenskaper stort antall celler i enkle eksperimenter. Dette eksperimentelle systemet ligner trange miljømessige begrensninger som finnes i vev av endogene trekkende celler. Imidlertid, ved å tvinge migrasjon i en enkelt dimensjon, letter det automatiske celle sporing og utvinning av measurables (figur 5). Vi viser også at vår enheten er kompatibel med fluorescensmikroskopi, og kan derfor tilpasses for å studere organell posisjonering under de forskjellige faser av celle motilitet (figur 4).

Et kritisk trinn i den protokoll er kvaliteten av kanalene. Det er viktig å kontrollere den gode klebing av PDMS på glassets overflate. Når problemene i stikker vises de første ting å sjekke er renslighet av begge flater og en av plasma renere. Et annet parameter som kan være kritisk er the tetthet av lastet celler. Den spontane migrasjon krever umiddelbar nærhet av cellene til kanalene for å lette inngang til rørene, og det optimale antall må vurderes for hver celletype.

Som et eksempel, har vi vist at spontan migrering av DC, men systemet kan brukes til å analysere migrering av andre celletyper. I laboratoriet har vi testet primære T-lymfocytter, makrofager, så vel som tumor-cellelinjer (data ikke vist, og referanser ^7-9).

For å analysere cellemigrasjon i kanalene, har to hovedprotokoller testet. Den første krever bildebehandling ved fasekontrast (10X), og er basert på automatisk registrering og generering av kymographs fra å migrere celler ³ (figur 5A). Velocity, cellestørrelse og utholdenhet er, blant andre, parametere som kan trekkes ut fra kymographs. Dette systemet er begrenset av kvaliteten på kymographs og til utvikling avprogramvaren for å generere og analysere dem. En annen og enklere måte å kvantifisere dataene er basert på semi-automatisert sporings av kjernen ved hjelp av Hoechst farging (figur 3). Bruken av fluorescens tillater sporing og analyse av migrering med standard bildeprogramvare. Et eksempel på en slik strategi er utviklet for den første verdens celle race ^12.

Gitt at overflaten av PDMS kan adsorberes med praktisk talt en hvilken som helst protein, kan mikrokanaler brukes til å evaluere effekten av ekstracellulære matriks-proteiner i cellemigrering. Geometrien av kanalene kan også modifiseres, å lette undersøkelsen av virkningen av fysiske begrensninger i cellemigrering.

Endelig kan dette eksperimentelle systemet tilpasses for å skaffe flere tilstander i enkelteksperimenter. Dette, sammen med en semi-automatisert analyse, er kompatibel med medium gjennomstrømming screenings for oppdagelsen av nye aktører involvererd i migrasjon av kreftceller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2.5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254