Summary
Un método cuantitativo para estudiar la migración espontánea de las células en un microambiente confinado unidimensional se describe. Este método tiene la ventaja de canales microfabricados y se puede utilizar para estudiar la migración de gran número de células bajo diferentes condiciones en los experimentos individuales.
Abstract
El método aquí descrito permite el estudio de la migración de células en condiciones de confinamiento en una dimensión. Se basa en el uso de canales microfabricados, que imponen un fenotipo polarizado a las células por las limitaciones físicas. Una vez dentro de los canales, las células tienen sólo dos posibilidades: seguir adelante o hacia atrás. Esta migración simplificado en el que la direccionalidad está restringida facilita el seguimiento automático de las células y la extracción de parámetros cuantitativos para describir el movimiento celular. Estos parámetros incluyen la velocidad de célula, los cambios de dirección, y las pausas durante el movimiento. Los microcanales son también compatibles con el uso de marcadores fluorescentes y son por lo tanto adecuados para estudiar la localización de los orgánulos y las estructuras intracelulares durante la migración celular en alta resolución. Por último, la superficie de los canales se puede funcionalizar con diferentes sustratos, lo que permite el control de las propiedades adhesivas de los canales o el estudio de Haptotaxis. En resumen, el sistema de hERE descrito está destinado a analizar la migración de grandes números de células en condiciones en las que se controlan tanto la geometría y de la naturaleza bioquímica del medio ambiente, lo que facilita la normalización y reproducibilidad de los experimentos independientes.
Introduction
La migración es una función celular complejo que es importante para muchos procesos fisiológicos en los organismos multicelulares, incluyendo el desarrollo, las respuestas inmunes, y la regeneración de tejidos. Además, determinadas situaciones patológicas tales como la invasión tumoral y la metástasis dependen de la motilidad celular 1. Por estas razones, la migración celular se ha convertido en un importante campo de estudio en el contexto de la investigación fundamental y traslacional. In vivo, la mayoría de los tejidos se caracterizan por una rica matriz extracelular y de alta densidad celular. La migración celular, por lo tanto, en condiciones fisiológicas, se produce en un ambiente confinado complejo. Clásicamente, muy probablemente debido a razones históricas y límites técnicos, la migración celular se ha estudiado en sistemas 2D planas que no se reproducen muchas de las propiedades de entorno que se encuentran en los tejidos, tales como el confinamiento. Por otra parte, factores como la adhesión celular, que son esenciales para la motilidad en 2D, recientemente se han mostrado no ser necessariamente necesarios para la migración en vivo o dentro de un gel, lo que sugiere que los mecanismos que gobiernan la locomoción celular en 2D y en otros ambientes son distintos 2. Varios sistemas se han desarrollado para imitar las complejas propiedades de los tejidos, los más famosos geles de colágeno bienestar, cuyo objetivo es la recapitulación de las propiedades de la composición de la matriz extracelular 3. Aquí proponemos microcanales como un método complementario simple que permite la migración de células de estudio en una dimensión en un ambiente confinado.
En este sistema las células migran a lo largo de microcanales en la que entran espontáneamente. Células migratorias entonces adquieren la forma de los canales, la adopción de una geometría tubular que lo más probable refuerza su polaridad. El movimiento lineal de las células en los canales permite el seguimiento automático de células y la extracción de parámetros cuantitativos de los experimentos. Desde el punto de vista técnico, este sistema es fácil y flexible. El revestimieg de las paredes del canal se puede manipular, el tamaño y la forma de los canales pueden ser adaptados, y un gran número de células puede ser analizado en los experimentos individuales. Este sistema puede ser también ampliadas al realizar el análisis de la pantalla de medio alcance de moléculas implicadas en la motilidad celular. El protocolo descrito aquí se ha estandarizado el uso de células dendríticas (DC) como un modelo celular. Estas células son clave para el sistema inmune a medida que participan en la iniciación y el mantenimiento de las respuestas inmunes específicas 4. In vitro, países en desarrollo se ha demostrado que migrar de forma espontánea en ambientes confinados y son por lo tanto un buen modelo para estudiar la motilidad celular en microcanales 5,6 . Es importante destacar que este sistema se puede ampliar para analizar la migración de cualquier otro tipo de células móviles como linfocitos T, neutrófilos, o células tumorales 7-9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota importante: Este protocolo supone que el molde que contiene la forma de los microcanales deseados ya se ha hecho. Más información sobre la preparación del molde ha sido ya publicada 10. Este protocolo también asume que la cultura los DC de la médula ósea se conoce.
1. Fabricación de chips
- Mezclar el aceite PDMS y agente de curado en una relación en peso de 10:01 en un vaso de plástico. Mezclar ambos compuestos a fondo.
- Fundido la mezcla en los microcanales de cojinete de molde. La altura total debe estar entre 0,5 a 1 cm.
- Elimine las burbujas de aire en una campana de vacío durante 1 hora.
- PDMS endurecer en el molde mediante la colocación de este último en un horno durante 2 horas a 65 ° C.
- Una vez que el PDMS es a temperatura ambiente, se cortó un pedazo grande alrededor de la estructura con una cuchilla quirúrgica y despegarlo del molde (Figura 1A).
- Perforar agujeros donde se inyectan células (normalmente 2 mm) y cambiar el tamaño del PDMScon una hoja de bisturí para ajustarse al tamaño de los platos con fondo de cristal en el que la migración se evaluará (Figura 1B). Antes de continuar, quitar el polvo residual de la cápsula, utilizando papel de limpieza de lentes. Esto favorece la unión de PDMS de vidrio se describe en el paso 1.10.
- Limpie el chip PDMS redimensionada que contiene los canales por pegar y despegar la cinta adhesiva en los lados de la estructura.
- Sonicar las piezas de PDMS 30 segundos en etanol al 70% para eliminar el polvo y las pequeñas partículas de PDMS. Seque rápidamente después por soplado de aire limpio.
- Activar el PDMS (estructuras hacia arriba) y placas de cultivo por el aire (u oxígeno) de tratamiento con plasma durante 30 segundos a 300 mTorr.
- Coloque ambas superficies activadas en contacto a pegarse permanentemente el PDMS al sustrato. Si es necesario, el uso de fórceps metálicos para presionar ligeramente en la parte superior de los PDMS para forzar el contacto entre el polímero y el vidrio del plato (Figura 1C).
- Incubar el chip en el horno a 65 ° C FOr 1 hora de fortalecer la unión.
2. Recubrimiento de microcanales
- Activar toda la estructura por plasma de aire a 300 mTorr durante 1 min. Esto promoverá la entrada de líquido en los canales en el siguiente paso.
- Llene rápidamente los orificios de entrada del chip con fibronectina a 10 g / ml en agua. Otros sustratos tales como PEG se pueden usar para modificar la adherencia de células a las paredes del canal. Preste atención a que el líquido se extiende a lo largo de toda la estructura. Esto se puede comprobar fácilmente a simple vista bajo luz normal o el uso de un microscopio de campo claro regular.
NOTA: En estructuras muy pequeñas, en las que la difusión es más difícil, la entrada de líquido en los canales puede ser forzado mediante la colocación de la estructura en una campana de vacío durante al menos 15 min. Para comprobar la eficacia del recubrimiento sustratos fluorescentes se pueden utilizar (Figura 2). - Incubar 1 hora a temperatura ambiente para permitir la adsorción de la fibronectina o cualquier otro recubrimiento substtasa a las paredes de los canales.
- Lavar el estructuras 3 veces con PBS para eliminar el sustrato no unido.
- Después del lavado, proceda al Protocolo de 3 o almacenar el chip a 4 ° C para un uso posterior (24 horas máximo).
3. Celular Loading
- Retire la PBS de la placa y llenar el microsistema con medio celular. Deje incubar durante 1 hora para saturar los canales con el medio.
NOTA: Para los experimentos con drogas como los inhibidores de moléculas, se aconseja preincubar los canales con un medio que contiene el fármaco en la concentración correcta. Además, algunos medicamentos tienden a solubilizar en la estructura de PDMS que reduce la concentración efectiva. Se han propuesto algunas soluciones para contrarrestar este problema 11-12. - Retire flotantes centros de datos y recuperar las células semi-adherentes mediante lavado con medio de cultivo. Contar las células utilizando un hemocitómetro.
NOTA: Para imágenes núcleo, una tinción Hoechst 33342 se puede lograr de antemano por encubating 2 x 10 6 células durante 30 min con el colorante a 200 ng / ml en medio completo. Lavar dos veces por centrifugación para eliminar el exceso de tinte antes de seguir el protocolo. - Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min (tiempo y velocidad pueden ser diferentes dependiendo del tipo de célula) y se elimina el medio. Diluir la pastilla para alcanzar una concentración de 20 x 10 6 células / ml.
- Retire el exceso de medio de la placa y vaciar los orificios de entrada en la estructura de PDMS con una micropipeta. Rellene las entradas con 5 l de solución de células para alcanzar una cantidad de 1 x 10 5 células en cada orificio de entrada.
ATENCIÓN: se necesita alta densidad celular para favorecer el contacto de las células con los canales. Densidad celular baja puede resultar en un bajo número de células dentro de los canales y el fracaso del experimento. - Incubar el microchip durante 30 min a 37 ° C en la incubadora. Añadir 2 ml de medio completo al plato experimento.
NOTA: La estructura PDMS conjunto debe be cubierto con el fin de evitar el secado de las células durante el experimento. Si 2 ml no es suficiente, agregue más medio para cubrir completamente la estructura de PDMS.
4. Imaging
- Limpiar la superficie inferior externa de los platos con el tejido de limpieza de lentes antes de colocar las placas bajo el microscopio.
- Para analizar la migración en gran número de células, utilizar un aumento de 10X y amplia iluminación de campo en un CO 2 y la temperatura y equipado de vídeo-microscopio (Figura 3). Para facilitar el seguimiento de la célula, Hoechst tinción ya la luz UV puede ser utilizado (véase el paso 3.2). La migración puede ser también analizado utilizando microscopía confocal con el fin de obtener una mayor resolución de las estructuras celulares durante la migración.
- Para la microscopía de lapso de tiempo a 10 veces, elegir una frecuencia de tiempo de acuerdo a la velocidad de células esperada (normalmente 2 min para las células dendríticas migran a una velocidad de 5 m / min).
Nota: El protocolo descrito aquí hace nOT incluye el análisis de los parámetros de la migración celular. Algunos puntos se enumeran en la discusión para aconsejar a los lectores sobre cómo proceder para extraer información de películas a intervalos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En cada experimento la superficie de la PDMS se recubre con una molécula adaptada a los intereses del estudio. La figura 2 muestra los canales revestidos con una molécula fluorescente, PLL-g-PEG, antes y después de lavar (paso 2.4). Tal experimento permite el control de la homogeneidad del recubrimiento en los canales.
Después de la carga de células, microscopía de vídeo se puede realizar para seguir la migración celular. Figura 3A muestra un ejemplo de la migración de DC en microcanales a una densidad apropiada para realizar un seguimiento de las células. Ambos, contraste de fase y tinción Hoechst se pueden utilizar para este propósito (ver Discusión). La técnica también es compatible con microscopía confocal fluorescente a una resolución más alta, y se puede utilizar para realizar un seguimiento de los orgánulos o estructuras celulares. Figura 4B muestra un ejemplo de la dinámica de la actina polimerizada en la migración de los DC que expresan LifeActGFP.
Un ejemplo de cuantificación de célulasla motilidad analizado en la migración de los DC se muestra en la Figura 5. Figura 5A muestra kymographs generados a partir de WT o Y27632 DC tratadas. Y27632 es un inhibidor bien caracterizado de la contractilidad celular y la migración, y se utilizó para verificar la capacidad del sistema para detectar cambios en la velocidad. Los kymographs se pueden analizar aún más para extraer posición y el tamaño de las células como una función del tiempo, lo que permite el estudio de diferentes parámetros para describir la migración celular. Figura 5B muestra la velocidad de la migración seguido por formación de imágenes posicionamiento núcleo usando un software hecho en casa 13. Países en desarrollo tienen una velocidad media cercana a los 6 m / min. El tratamiento con Y27632 disminuye significativamente su velocidad. Este ejemplo muestra el poder de la técnica, que permite la cuantificación de gran número de células en los experimentos individuales y la utilidad del sistema para detectar diferencias inducidas por tratamientos farmacológicos. Esto se puede ampliar a la utilización de siRNA y el cribado de mol cules implicado en el control de la migración.
Figura 1. Pasos en la asamblea canales. Chip de PDMS se repitió de un molde de canal. (A) El chip que contiene los canales se extrajo directamente desde el molde. (B) El chip cambiado el tamaño para adaptarse a la placa experimental y un agujero se hizo para permitir la entrada de las células. (C) El chip fue finalmente pegado en la parte superior del plato de vidrio. (D y E) Representación esquemática del dispositivo. (D) Vista superior. (E) Vista lateral. Objetos verdes representan células dentro o fuera canales (azul). Bar 1 cm.
es/ftp_upload/51099/51099fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51099/51099fig2.jpg "/>
Figura 2. Recubrimiento de canales con un sustrato fluorescente. (A) 5 micras x 5 micras canales incubadas con PEG fluorescente a 100 g / ml durante 1 h. (B) Imagen representativa del PEG fluorescente que queda después de PBS lavado de los canales. Bar 50 micras.
Figura 3. Células que migran a lo largo de microcanales. De contraste de fase (gris) y el núcleo de tinción (azul) de células que migran en 5 m x 5 micras canales microfabricado. (A) Una foto extraída de una película de los países en desarrollo la migración a lo largo de los canales. (B) Montaje que muestra el desplazamiento de una selecciónTed DC migran a lo largo de los canales. Las flechas blancas indican las células que migran. Escala de tiempo 1 img / 2 min. Bar 50 micras.
Figura 4. Ejemplo de células de alta resolución en microcanales. De alta resolución de imagen de los países en desarrollo la migración a lo largo de microcanales individuales. (A) Montaje de imágenes de contraste de fase (1 img/20 seg) de un DC migrar en un microcanal (100 aumentos). (B) Montaje de un LifeAct expresar DC (destacado polimerizados actina) que muestra la compatibilidad del sistema con imágenes de fluorescencia (1 img/20 seg, ampliación 60X, sección óptica individual). Actina polimerizada se muestra en negro. El tamaño de Canal 10 micras de ancho x 5 m de altura. Bar 10 micras.
Figura 5. Los resultados representativos de los países en desarrollo la migración a lo largo de microcanales. Esta figura ilustra el tipo de análisis que se pueden hacer desde películas de células que migran a lo largo de microcanales. Figura 5A muestra kymographs generados a partir de imágenes de contraste de fase de lapso de tiempo de WT o Y27632 DCs tratados que migran en microcanales (10X, 1 img / 2 min). Figura 5B muestra un ejemplo de la cuantificación de la velocidad de células obtenido después de rastrear el núcleo de CC mediante la tinción de Hoechst y un software hecho en casa 13. Los datos se analizaron mediante un test t no paramétrica (prueba de Mann-Whitney). Bar 100 m.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí se describe un dispositivo compuesto de microcanales como un método para estudiar las propiedades migratorias de gran número de células en los experimentos individuales. Este sistema experimental imita las limitaciones ambientales confinados que se encuentran en los tejidos por las células migratorias endógenos. Sin embargo, al forzar la migración en una sola dimensión, que facilita el seguimiento automático de células y la extracción de los mensurables (Figura 5). También mostramos que nuestro dispositivo es compatible con microscopía de fluorescencia y por lo tanto se puede adaptar para estudiar posicionamiento orgánulo durante las diferentes fases de la motilidad celular (Figura 4).
Un paso crítico dentro del protocolo es la calidad de los canales. Es importante controlar la buena adherencia de los PDMS sobre la superficie de vidrio. Cuando aparecen problemas de adherencia de las primeras cosas que debe revisar son la limpieza de las dos superficies y el del limpiador de plasma. Otro parámetro que puede ser crítico es the densidad de células cargadas. La migración espontánea requiere una estrecha proximidad de las células a los canales para facilitar la entrada en los tubos, y el número óptimo debe ser evaluado para cada tipo de célula.
A modo de ejemplo, hemos demostrado la migración espontánea de los países en desarrollo, pero el sistema se puede utilizar para analizar la migración de otros tipos de células. En el laboratorio, hemos probado linfocitos T primarios, macrófagos, así como líneas de células tumorales (datos no mostrados y referencias 7-9).
Para el análisis de la migración celular en los canales, dos protocolos principales han sido probados. El primero requiere de formación de imágenes por contraste de fase (10 veces), y se basa en la detección automática y la generación de kymographs de migración de las células 3 (Figura 5A). La velocidad, el tamaño celular y la persistencia son, entre otros, los parámetros que se pueden extraer de kymographs. Este sistema está limitado por la calidad de los kymographs y para el desarrollo deel software para generar y analizarlos. Un segundo y más fácil manera de cuantificar los datos se basa en el seguimiento de semi-automatizado del núcleo mediante la tinción de Hoechst (Figura 3). El uso de la fluorescencia permite el seguimiento y análisis de la migración con software de imagen estándar. Un ejemplo de dicha estrategia ha sido desarrollada para la primera carrera celular del mundo 12.
Dado que la superficie de los PDMS puede ser adsorbido con prácticamente cualquier proteína, microcanales se pueden usar para evaluar el impacto de las proteínas de la matriz extracelular en la migración celular. La geometría de los canales puede ser también modificado, lo que facilita el estudio de los efectos de restricciones físicas en la migración celular.
Por último, este sistema experimental se puede adaptar para adquirir varias condiciones en los experimentos individuales. Esto, junto con un análisis semi-automatizado, es compatible con las proyecciones de mediano rendimiento para el descubrimiento de nuevos actores involucrarD en la migración de células cancerosas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen enormemente la plataforma PICT IBISA en el Institut Curie (CNRS UMR144). Este trabajo fue financiado por becas de: el Consejo Europeo de Investigación para AM.LD (Strapacemi 243.103), el Nationale pour la Recherche Asociación (ANR-09-Piri-0027-PCVI), la fundación InnaBiosanté (Micemico) a MP y AM. LD y el joven investigador subvención ERC Strapacemi a AM.LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Package of 90% silicone base and 10% curing agent |
| Core sample cutter | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diameter 2.5 mm |
| Glass-bottom dish | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32 G | For small samples (35 dishes). A bigger version is also available |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines. J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).
- Steinman, R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).
- Faure-André, G., et al. Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain. Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).
- Renkawitz, J., et al. Adaptive force transmission in amoeboid cell migration. Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).
- Moreau, H., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay. Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).
- Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules. Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).
- Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H.
- Maiuri, P., et al. The first World Cell Race. Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).
