Imagerie de la membrane cellulaire des blessures et des processus sous-cellulaires impliquées dans la réparation

Summary

Le processus de guérison des cellules blessées implique trafic des protéines spécifiques et des compartiments subcellulaires au site de la lésion de la membrane cellulaire. Ce protocole décrit les essais de surveiller ces processus.

Abstract

La capacité des cellules blessés à guérir est un processus cellulaire fondamental, mais les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les cellules de guérison blessés sont mal compris. Voici les dosages sont décrits à surveiller la capacité et la cinétique de la guérison des cellules cultivées après une lésion localisée. Le premier protocole décrit une approche point final à base d'évaluer simultanément la capacité cellulaire de réparation de la membrane des centaines de cellules. Le deuxième protocole décrit une méthode de formation d'image en temps réel pour surveiller la cinétique de réparation de la membrane cellulaire dans des cellules individuelles après une lésion localisée avec un laser pulsé. Comme les cellules de guérison blessés implique trafic des protéines spécifiques et les compartiments sous-cellulaires au site de la blessure, le troisième protocole décrit l'utilisation de l'approche point final au-dessus de la base pour évaluer un tel événement de trafic (lysosomale exocytose) dans des centaines de cellules blessées simultanément et le dernier protocole décrit l'utilisation de blessure laser pulsé avec micros de la FRBRcopie de suivre la dynamique des compartiments cellulaires dans des cellules individuelles blessés à haute résolution spatiale et temporelle. Bien que les protocoles ci-dessous décrivent l'utilisation de ces approches pour étudier la relation entre la réparation des membranes cellulaires et lysosomale l'exocytose dans les cellules musculaires en culture, elles peuvent être appliquées en tant que telles pour toute autre cellule en culture adhérente et un compartiment subcellulaire de choix.

Introduction

Membrane cellulaire maintient l'intégrité des cellules en formant une barrière entre la cellule et le milieu extracellulaire. Un stimulus chimique, électrique, mécanique ou qui dépasse le seuil physiologique normal ainsi que la présence d'agents pathogènes envahissants peut chaque résultat des blessures à la membrane de la cellule et de déclencher une réponse cellulaire à la suite de la réparation de ce préjudice. Pour survivre ces blessures à la membrane cellulaire, les cellules possèdent un mécanisme efficace pour la réparation. Ce mécanisme est dépendante du calcium et implique le trafic intracellulaire des protéines telles que des annexines et MG53, entre autres, ainsi que des compartiments subcellulaires tels que des endosomes, les lysosomes, l'appareil de Golgi et des vésicules dérivées des mitochondries vers la membrane cellulaire lésé ^1-7. Toutefois, les détails de la séquence d'événements moléculaires et sous-cellulaires impliqués dans la réparation de la membrane cellulaire endommagée reste mal comprise.

La réponse de réparation de la cellule peuvent être séparés dans l'oreillement et les réponses tardives. Les premières réponses, qui se produisent en quelques secondes à l'échelle minutes de temps, sont extrêmement important dans la détermination de la nature des réponses tardives menant à la réparation cellulaire succès ou la mort cellulaire. point final des analyses basées sur l'analyse biochimique et cellulaire vrac ont permis d'établir l'implication des processus moléculaires et cellulaires de réparation. Mais, en raison de l'hétérogénéité et de la rapidité de la réponse de la réparation cellulaire, point final des essais ne parviennent pas à fournir les détails cinétiques et spatiales de la séquence des événements menant à réparer. Les approches qui permettent blessure contrôlée de la membrane cellulaire et permettent le suivi de la réparation de la membrane cellulaire et subcellulaire des réponses associées à une résolution spatiale et temporelle sont idéales pour de telles études. Ici, ces approches ont été présentées. Deux des protocoles décrivent des approches pour contrôler les cinétiques réelles de temps de la réparation des membranes cellulaires et sous-cellulaires des réponses associées au processus de réparation dans les cellules vivantes suivants inj laserUry. En complément de ces analyses basées imagerie des cellules vivantes, le point de fin des essais ont également été décrits qui fournissent une mesure basée sur la population pour la réparation de suivi de cellules individuelles et les réponses des sous-cellulaires associées. Pour démontrer l'utilité de ces approches ont été utilisées pour surveiller le trafic et l'exocytose de lysosomes en réponse à une lésion de la membrane cellulaire.

Protocol

Une. Membrane d'imagerie cellulaire de réparation Utilisation en vrac (perles de verre) Blessant

Ce protocole permet le marquage séparément les cellules blessées et celles qui ne parviennent pas à guérir. La quantification de ces populations de cellules nécessite l'utilisation de trois conditions: 1. Test (C1) - Les cellules sont autorisés à réparer en présence de Ca ^{2 +,} 2. Contrôle 1 (pas de lésion C2) - Les cellules sont incubées en présence de Ca ^{2 +,} mais pas blessés, et 3. Control 2 (pas de C3 de réparation) - cellules sont autorisés à réparer en l'absence de Ca ^{2 +.}

1. À cultiver des cellules> 50% de confluence sur des lamelles couvre trois stériles et laver C1 et C2 deux fois avec du CIM à 37 ° C et C3 avec du PBS à 37 ° C et de transfert sur des lamelles couvre-joints toriques silicone.
2. Ajouter 100 ul de solution de dextrane FITC préchauffé dans CIM sur C1 et C2 ou en C3 à PBS.
3. Blesser membrane plasmique sur C1 et C3 par de douces perles 40 mg de verre sur la lamelle à la température ambiante par des lamelles inclinables manuellement en arrière et6-8 fois de suite à un angle de 30 °.
   Remarque: Pour des blessures légères, assurent les perles de verre sont réparties de manière uniforme, minimisant ainsi les blessures répétées. Pour améliorer la reproductibilité de blessures entre les échantillons, effectuer simultanément la blessure de perles de verre de différents échantillons à comparer.
4. Éviter de nouvelles roulement de billes, de transférer tous les lamelles à un incubateur à 37 ° C à CO ₂ ambiant et permet la réparation de procéder pendant 5 min.
5. Sans laisser les billes roulent, retirer les billes de verre et de dextrane FITC par lavage avec de CIM (C1 et C2) ou du PBS (C3) à 37 ° C.
6. Lieu lamelles couvre-retour sur le joint torique et ajouter 100 ul de solution fixable TRITC de dextran lysine préchauffé à CIM sur C1 et C2 ou en C3 sur PBS.
7. Incuber à 37 ° C pendant 5 min à température ambiante CO _2.
8. Laver deux fois avec des lamelles préchauffé CIM et fixer avec 4% de PFA pendant 10 min à température ambiante.
9. Laver deux fois avec du PBS et incuber pendant 2 min à température ambiante dans le colorant Hoechst.
10. Laver samples deux fois avec du PBS, monter sur une lame en utilisant un milieu de montage et de cellules d'image en utilisant un microscope à épifluorescence.
11. Utiliser des cellules de C2 pour déterminer le fond rouge et vert intensité de la coloration et utiliser cette valeur pour les seuils des canaux rouge et vert pour tous les échantillons (C1-C3).
12. Score nombre total de cellules qui sont a) vert (blessé et réparé) et b) rouge ou le rouge et le vert (blessé, mais n'ont pas réussi à réparer) dans les échantillons C1 et C3.
13. Comte> 100 cellules de verts pour chaque condition et exprimer la fraction de cellules qui n'ont pas de réparer un pour cent de toutes les cellules blessés (vert et rouge).

2. Imagerie en direct de la cinétique de membrane cellulaire après réparation laser blessures

1. Laver les cellules avec préchauffé CIM et puis mettre la lamelle en CIM avec des colorants FM.
2. Placez la lamelle dans un support dans l'incubateur de haut en scène maintenu à 37 ° C.
3. Sélectionner une région ² de 2.1 mm de la membrane cellulaire, et pour irradier <; À 10 ms avec le laser pulsé. Atténuer la puissance du laser par l'intermédiaire du logiciel de 40 à 50% de la puissance de crête. Puissance optimale permet blessure cohérente, mais non mortelle et ce doit être déterminée par essai et erreur pour chaque ligne de chaque instrument et de la cellule utilisé.
4. Pour surveiller la réparation, l'image toutes les 10 secondes en épifluorescence et clair, à partir avant l'accident et se poursuivre pendant 3-5 min après une blessure.
   Remarque: Pour aucun contrôle de la réparation, répétez les étapes 2.1-2.4 avec les cellules blessées dans du PBS contenant un colorant FM.
5. Pour quantifier la cinétique de réparation, de mesurer FM cellulaire colorant fluorescence et tracer la variation de l'intensité (ΔF/F0) au cours de l'imagerie. Ces données devraient être en moyenne de plus de 10 cellules dans chaque état et tracée en moyenne ou la valeur de cellule individuelle, selon les besoins.

3. Imagerie vrac (perles de verre) lésion induite lysosomales exocytose

Les échantillons comprennent des cellules cultivées suivantes à> 50%confluence: 1. Test (C1) - Les cellules ont permis de réparer en présence de Ca ^{2 +,} 2. Contrôle 1 (C2; Aucune blessure) - Cellules ni blessés ni incubées avec l'anticorps primaire, et 3. Control 2 (C3; Aucune réparation) - Les cellules ont permis de réparer en l'absence de Ca ^{2 +.}

1. Lavage des lamelles couvre-C1 et C2 deux fois avec de l'ICM à 37 ° C et C3 avec du PBS à 37 ° C et de les transférer sur le silicone des joints toriques.
2. Ajouter 100 pi de préchauffée lysine fixable dextran TRITC dans CIM sur C1 et C2 et C3 sur PBS.
3. Blesser membrane plasmique sur C1 et C3 comme dans l'étape 1.3.
4. Éviter de nouvelles roulement de billes, de transférer tous les lamelles à un incubateur à 37 ° C à CO ₂ ambiant et permet la réparation de procéder pendant 5 min.
5. Retirer les perles de verre et TRITC dextrane en lavant les lamelles dans du milieu de croissance à froid, en assurant de nouveau pas de roulement des billes de verre sur les cellules.
6. Rincer les lamelles couvre-objet deux fois avec du milieu de croissance à froid et à transférer les joints toriques.
7. À C1 et C3, Ajouter 100 ul de l'anticorps anti LAMPE1 de souris de rat dans un milieu de croissance complet à froid et ajouter le milieu de culture froid, complète à C2.
8. Pour permettre la liaison d'anticorps lamelles incuber pendant 30 min à 4 ° C.
9. Lavez les lamelles à trois reprises avec CIM froid et fixer tous les lamelles de 4% PFA pendant 10 min à température ambiante, puis rincez 3x avec la CIM.
10. Incuber les lamelles couvre-objet dans 100 ul de solution de blocage pendant 15 min à température ambiante
11. Incuber les lamelles couvre-objet dans 100 ul de Alexa Fluor 488 anticorps de rat anti pendant 15 min à 4 ° C.
12. Laver deux fois avec du PBS et incuber pendant 2 minutes à température ambiante dans Hoechst.
13. Laver les cellules deux fois avec du PBS, monter sur une lame en utilisant un milieu de montage et de l'image en utilisant un microscope à épifluorescence.
14. En utilisant des images de cellules C2, déterminer le fond non spécifique coloration dans le rouge (TRITC dextran) et vert (Alexa Fluor 488 anticorps) canaux et utiliser ces valeurs de coloration de fond à seuil, les canaux rouge et vert pour tous les échantillons (C1-C3). </ Li>
15. Utilisez les> 100 rouge marqué cellules de C1 et C3 pour mesurer l'intensité de la coloration LAMP1 (vert) dans les cellules lésées. Pour une expérience réussie de la coloration LAMPE1 dans les cellules de C3 sera nettement inférieur à celui des cellules de C1.

4. Imagerie en direct de membrane cellulaire blessures déclenché traite subcellulaire

1. Fluorescence étiqueter le compartiment d'intérêt par transfection journaliste approprié (par exemple CD63-GFP pour lysosomes ⁸⁾ ou en utilisant des colorants fluorescents ^9.
2. Pour lysosomes d'étiquetage avec un colorant fluorescent, incuber les cellules cultivées à 50% de confluence dans un milieu de croissance contenant FITC-dextran
3. Laisser dextrane à être endocytosée pendant 2 heures (ou plus longtemps que nécessaire pour le marquage de l'endosome suffisante avec du dextrane par la lignée cellulaire d'intérêt) dans l'incubateur à CO _2.
4. Laver les cellules avec les médias de croissance préchauffées et incuber en elle pendant 2 heures dans un incubateur à _CO2 pour permettre à tousendocytose dextrane à s'accumuler dans le lysosome.
5. Avant imagerie, rincer la lamelle en préchauffé CIM et monter dans un porte-lamelle sur le dessus de la scène incubateur à 37 ° C.
6. Effectuer champ large (pour le mouvement tout au long de la cellule) ou FRBR (mouvement à la surface cellulaire et l'exocytose) Imagerie - cellules qui n'ont pas bondés FITC dextran lysosomes étiquetés sont idéales pour l'imagerie du mouvement et l'exocytose de lysosomes individuels.
7. Alignement des lasers de la FRBR pour l'imagerie microscope: Utilisez 60X ou 100X avec objectif> 1,45 NA. Mettre en place l'angle de l'incident FRBR faisceau laser en utilisant l'approche du fabricant.
8. Blesser la membrane cellulaire par irradiation d'une région de petite taille (1 à 2 mm ²⁾ pour <100 msec, avec le laser pulsé à 40 à 50% d'atténuation.
9. Pour surveiller la réponse de lysosome de la cellule blessures, les cellules d'image à 4-6 images / sec pendant au moins 2 minutes ou plus en fonction de la dynamique de l'exocytose dans les cellules d'intérêt.

Representative Results

Protocoles décrits ici pour l'imagerie cellulaire unique sont à surveiller la capacité et la cinétique de la réparation de la membrane cellulaire (protocoles n ° 1 et 2) et le trafic subcellulaire et la fusion des lysosomes lors de la réparation (protocoles n ° 3 et 4).

Protocole 1 montre un test essentiel qui permet le marquage de toutes les cellules blessés et identifier les cellules endommagées qui ont échoué à réparer. Les résultats de la figure 1 montrent que tandis que les cellules indemnes (figure 1A) restent non marqué, les cellules lésées par perle de verre en présence de FITC dextran sont étiquetés vert (figures 1B et 1C). Lorsque les cellules sont autorisés à réparer en présence de Ca ^{2 +} la plupart des cellules (vert) blessés arrivent à réparer et ne sont pas marqués (rouge) par TRITC dextran (figure 1B). Lorsque les cellules sont autorisés à réparer en l'absence de Ca ^{2 +,} la plupart des cellules lésées sont aussi marqués en rouge par le dextran TRITC (Figure 1C). Les cellules qui n'ont jamais été blessés ne montrent pas de marquage avec le dextran TRITC. Ainsi, dans tout échantillon donné de quantifier le nombre de cellules que le vert étiqueté fournit une mesure des cellules qui ont été blessés par des billes de verre et réparés, tout en quantifiant le nombre de doubles cellules (rouge et vert) marqués fournit une mesure des cellules qui ont échoué pour réparer les blessures.

Protocole 2 décrit l'évaluation de la cinétique de réparation de la membrane cellulaire en contrôlant l'entrée de colorant FM dans la cellule. Lorsqu'elle est incubée en colorant FM, des cellules intactes montrent la coloration de la membrane cellulaire (figure 2A panneau avant blessure WF). Après une lésion de laser localisé de membrane cellulaire colorant FM commence entrer dans la cellule et endomembranes, ce qui provoque une augmentation soudaine de la fluorescence de colorant FM (figure 2B) de liaison. Comme la capacité de la membrane cellulaire pour réparer un dommage laser suivant est dépendante de Ca ^{2 +,} dans une cellule blessée présence de Ca ^{2 +} est able réparer, ce qui provoque l'entrée de colorant FM (et donc augmenter dans cellulaire FM colorant fluorescence) de cesser moins d'une minute après la blessure (figure 2A, panneau supérieur, la figure 2B, ligne bleue, et animé Vidéo 1 et Figure 2). Au contraire, une cellule a permis de réparer en l'absence de Ca ^{2 +,} ne parvient pas à réparer, ce qui conduit à l'entrée de teinture en continu et donc augmentation continue FM colorant fluorescence même 4 min après une blessure (figure 2A, panneau inférieur, figure 2B, ligne rouge et animée Vidéo 2 et figure 2). Ainsi, la réparation des membranes cellulaires conduit à un plafonnement de la coloration au colorant FM, tandis que l'absence de réparation de la membrane de la cellule provoque l'entrée de teinture en continu qui ne parvient pas à atteindre un plateau.

Protocole n ° 3 décrit l'utilisation d'vrac (billes de verre), l'approche de blessure pour contrôler la translocation de la surface cellulaire des vésicules et des protéines en réponse à la blessure. Voici èmecellules e sont blessés en présence de TRITC dextran ainsi, tandis que les cellules indemnes ne sont pas étiquetés rouge (figure 3A), mais toutes les cellules lésées sont étiquetés rouge (figures 3B et 3C). Les cellules indemnes qui ne sont pas traités avec un étiquetage de montrer d'anticorps primaire de fond pour LAMP1 de surface cellulaire (panneau LAMPE1 figure 3A). Toutefois, lorsque les cellules sont blessés et ont permis de guérir en présence de calcium, les lysosomes subissent l'exocytose et donc il ya l'augmentation du niveau de LAMP1 taches sur la surface des blessés (marqué en rouge) des cellules (figure 3B). Cette augmentation de la surface de la cellule de marquage LAMP1 est beaucoup plus faible dans les cellules qui sont autorisés à guérir en absence de calcium (Figure 3C). Ceci démontre le caractère régulé de calcium lysosomale exocytose et donc un aspect de surface de LAMP1. Ainsi, les deux, de quantifier le nombre de cellules de surface cellulaire élevée LAMP1 coloration ainsi que de mesurer le niveaude surface cellulaire LAMP1 coloration sur les cellules blessées individuelles, pour fournir des mesures de la capacité de la cellule de subir une blessure déclenche l'exocytose lysosomale.

Protocole 4 peut être utilisé pour la surveillance directe de la cinétique, la nature et l'emplacement de la fusion de lysosomes individu en réponse à une lésion de la membrane cellulaire. Les cellules sont lésés par le laser pulsé et la surface de la cellule lysosomes sont imagés par imagerie FRBR, qui permet blessure de surveillance déclenche l'exocytose de lysosomes dans les cellules individuelles (figure 4A et animé Vidéo 3). Figure 4A montre une cellule (indiquée en vert) visualisé par imagerie de contraste de phase (à gauche) et par microscopie TIRF (panneau du milieu), avant l'accident. Panneau de droite montre l'image de la FRBR de la même cellule 105 sec après une blessure. Divers blessure réponses des lysosomes déclenché sont décrites dans les figures 4B-E. Figure 4B montre blessure recrutement d'un lysosome déclenché (marquépar cercle gris) à la membrane de la cellule suivie d'exocytose (animation vidéo 4 et figure 4). Cette lysosome n'est pas visible dans l'image FRBR avant l'accident (figure 4B: panneau -2,5 s), mais suite à une blessure le lysosome arrive à la membrane cellulaire et devient détectable (figure 4B: panneau 102,5 s), comme la vésicule se rapproche de la membrane cellulaire, il est préférable excitée par l'éclairement TIRF et le dextrane fluorescence lysosomale FITC atteint la valeur maximale lorsque le pore de fusion s'ouvre provoquant une neutralisation du pH lysosomal et donc dequenching de la fluorescence de dextrane FITC (Figure 4B: panneau 104,8 s). Ensuite, le dextrane est déchargé de la vésicule vers l'extérieur de la cellule provoquant la fluorescence FITC se propager latéralement et la fluorescence de vésicules pour diminuer progressivement (figure 4B: panneau 107,1 s). Dans la deuxième catégorie, le lysosome (marqué par le cercle orange, animé Video 5 Figure 4) est présent avant la blessure (figure 4C: panneau -2,5 s), il y reste à la membrane (figure 4C: panneau 91 s) jusqu'à ce que les exocytoses des vésicules. Voici le lysosome exocytosed partiellement (figure 4C: panneau 93 s), laissant derrière certains dextran FITC dans la vésicule suivant la fusion (figure 4C: 94,5 s). Les troisième et quatrième catégories de vésicules ne fusionnent pas à la membrane. Le lysosome représenté sur la figure 4D (marqué par cercle bleu) se déplace axialement vers et à l'écart de la membrane cellulaire (vidéo animée 6 et figure 4). Cette lysosome n'est pas visible sur la membrane de la cellule avant qu'une blessure (figure 4D: panneau -2,5 s), mais à l'approche de la membrane cellulaire suite à une blessure, il devient visible par microscopie TIRF (figure 4D: panneau 59,3 s). Il a atteint le plus proche de la membrane cellulaire (figure 4D: panneau 59,6 s) et s'éloigne sans fusion (figure 4D alors: panel 63,7 s). Le lysosome dans la quatrième catégorie arrive à proximité de la membrane et se déplace horizontalement le long de la membrane de la cellule (zone indiquée par la case violet sur ​​la figure 4A, animé vidéo 7 et Figure 4). Figure 4E (panneau 8,7 s) représente l'arrivée du lysosome , qui se déplace alors le long de la membrane, et on peut le voir dans la séquence d'images après la lésion (Figure 4E: des panneaux 10,7, 11,9, 12,8, 18,8 s). Sur la base de la description ci-dessus la quantification de la FITC dextran intensité de fluorescence de chaque lysosome - fusion (Figures 4B et 4C), se déplaçant axialement (Figure 4D), ou se déplaçant horizontalement (figure 4E) permet de déterminer la réponse du lysosome d'une blessure.

La figure 1. . Cellule vrac blessures de la membrane par des perles de verre Images montrent une coloration nucléaire (Hoechst, panneau de gauche), blessure (coloration verte - FITC dextran), les cellules non réparées (coloration rouge - TRITC Dextran), et a fusionné images (Merge). (A) des cellules non blessés, en présence de calcium, (B) des cellules blessés en présence de calcium, et (C) blessés cellules en l'absence de calcium. Barre d'échelle 10 um. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2. . Imagerie en temps réel de la réparation de la membrane cellulaire en réponse à une blessure au laser (A) l'image des cellules (encadrée en orange) avant qu'une blessure [panneau de gauche - champ clair (BF) etépifluorescence (epi)], 5 sec, 1 min, et 4 min après une blessure. Le site de la lésion est indiquée par une flèche blanche. Panneau supérieur montre une cellule lésée en présence de calcium et le panneau inférieur montre une cellule lésée en l'absence de calcium. (B) Graphique montrant l'évolution de FM colorant coloration (ΔF/F0) des cellules du groupe A blessés dans la présence de calcium (bleu) ou en l'absence de calcium (rouge). La région où le colorant pénètre dans FM, et donc étiquetage fluorescence augmentée a été utilisé pour la quantification de l'intensité de fluorescence. Barre d'échelle = 10 pm). Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3. Imaging lysosomale exocytose en réponse à une lésion vrac. Images montrent une coloration nucléaire Hoechst (bleu), la coloration LAMPE1 de surface cellulaire (vert), TRITC dextran (rouge) et de fusion de tous les canaux (superposition) de (A) cellules indemnes pas marquées avec l'anticorps primaire, (B) des cellules blessés autorisés à la réparation en présence de calcium, et (C) des cellules blessés permis de réparer en l'absence de calcium. Barre d'échelle 10 um. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4. Imagerie en temps réel de l'exocytose lysosomale en réponse à une blessure au laser. Cellules avec FITC dextran lysosomes étiquetés ont été blessés par un laser pulsé en présence de calcium. (A) La limite de la cellule quea été blessé est présenté (en vert): panneau de gauche - champ lumineux avant blessure, panneau central - la FRBR avant blessure et panneau de droite - la FRBR 105 s après l'accident. Le site de la lésion est marquée par la boîte de cyan et de la zone représentant indiqué par des boîtes blanches / violet et cercles colorés dans avez en panneaux BE. La couleur de la vésicule dans la totalité de l'image de cellule (gris, orange et bleu) correspond à la couleur de l'image zoomée dans des lysosomes individuels. Panneau (B) à gauche montre un graphique de la valeur de ΔF/F0 pour la fluorescence FITC d'une vésicule recrutés après une blessure. Panneau de droite montre des instantanés de la vésicule avant blessure (-2,5 s), préfusion (102,5 s), fusion (104,8 s) et postfusion (107,1 s). Panneau (C) à gauche montre un graphique de la valeur ΔF/F0 pour la fluorescence FITC d'une vésicule à quai avant l'accident. Panneau de droite montre des instantanés de la vésicule avant blessure (-2,5 s), préfusion (91 s), fusion (93 s) et postfusion (94,5 s). (<panneau strong> D) à gauche montre un graphique de la valeur de ΔF/F0 pour la fluorescence FITC d'une vésicule se déplacer axialement (vers et à partir de la membrane cellulaire). Panneau de droite montre des instantanés de la vésicule avant blessure (-2,5 s), et après une blessure à la position différente près de la membrane à 59,3, 59,6 et 63,7 s. (E) Les instantanés de la vésicule qui se déplaçait horizontalement le long de la membrane cellulaire à différents postes avant de blessure (-2,5 s) et après une blessure à (8,7, 10,7, 11,9, 12,8 et 18,8 s). La barre d'échelle (A = 10 um, B, C, D, E = 1 um). Cliquez ici pour agrandir l'image.

Animation vidéo 1 Figure 2: . l'imagerie en temps réel de la réparation de la membrane cellulaire en réponse à une blessure au laser en présence de calcium FM entrée de colorant dans une cellule (encadrée en orange) blessés par pulséelaser en présence de calcium. Le film représente 200 images acquises toutes les 2 sec. La cellule a été blessé (région marquée par la place du cyan) après l'image 4. L'horodatage temps en heures montre: min: sec: Format ms. Barre d'échelle = 10 um.

Animées vidéo 2 Figure 2: . imagerie en temps réel de la réparation de la membrane cellulaire en réponse à une blessure au laser en l'absence de calcium FM entrée de colorant dans une cellule (encadrée en orange) blessé par laser pulsé, en l'absence de calcium. Le film représente 200 images acquises toutes les 2 sec. La cellule a été blessé (région marquée par la place du cyan) après l'image 4. L'horodatage temps en heures montre: min: sec: Format ms. Barre d'échelle = 10 um.

Animation vidéo 3 Figure 4: l'imagerie en temps réel des lysosomale exocytTSO en réponse à une blessure au laser. des réponses différentes de lysosomes dans une cellule (indiquée en vert, vidéo 3) blessés par laser pulsé. Le film représente 2 min de séquentielles images de déchéance de temps acquises par microscopie TIRF à 5 images / sec. Images en fond clair ont été acquises toutes les 20 secondes. La cellule a été blessé (indiqué par le bloc cyan) à 2 s dans cette vidéo. Les cercles colorés (gris, orange et bleu) et la boîte violette marquent les lysosomes décrites dans la figure 4 et des vidéos d'animation 4-7, ce qui démontre la diversité de leurs sorts après une lésion de la cellule. L'horodatage temps en heures montre: min: sec: Format ms. Barre d'échelle = 10 um.

Animation vidéo 4 figure 4 montre lysosome exocytose marqué par le cercle gris qui est recruté à la membrane en réponse à une blessure. À 7 secondes (5 sec après blessure) dans cette vidéo le lysosome se recruté à la membrane cellulaireet fusibles puis à ce site à 1 min et 47 sec. Barre d'échelle = 1 mm.

Animation vidéo 5 figure 4 montre lysosome exocytose marqué par le cercle orange qui a été amarré à la membrane avant l'accident et les fusibles sur ce site 1 min et 35 sec. Barre d'échelle = 1 mm.

Animation vidéo 6 figure 4 montre les lysosomes marquées par un cercle bleu se déplaçant vers et à partir de la membrane cellulaire. Barre d'échelle = 1 mm.

Animation vidéo 7 figure 4 montre une région de la cellule marquée par boîte violette en Vidéo 3 où suite à une blessure l'un des lysosomes (cercle blanc) se déplace along de la membrane cellulaire. Barre d'échelle = 1 mm.

Discussion

lésion de la membrane cellulaire in vivo se produit en raison d'une variété de facteurs de stress physiologiques et plusieurs approches expérimentales ont été mises au point pour imiter ceux-ci. Il s'agit notamment de blesser la membrane cellulaire des cellules adhérentes en les grattant le plat ou par passage à travers un étroit ^9,10 alésage de la seringue. A la suite de telles blessures guérissent les cellules en suspension et pas adhéré à la matrice extracellulaire comme ils le font normalement dans le tissu. D'autres encore, comme l'utilisation de pores formant toxines modifient chimiquement la membrane cellulaire par extraction des lipides tels que le cholestérol, donc pas mimer in vivo des lésions mécaniques ^5. Ainsi, la méthode utilisée pour les lésions des cellules peut affecter ce qui peut être appris sur la réponse de réparation. Cela nécessite non seulement preuve de prudence dans le choix de l'essai de lésion cellulaire, mais également de choisir les approches qui miment mieux les lésions mécaniques in vivo. Ces approches comprennent la lésion zéro (où une monocouche de cellules sont blesséspar un scalpel ou une aiguille) et des perles de verre blessure (cas de préjudice causé par des billes de verre qui roulent sur des cellules adhérentes). Ces approches sont bien adaptés pour une blessure de cellules en masse, mais ne se prêtent pas à l'imagerie en temps réel de processus de réparation de la membrane cellulaire. L'utilisation de micro-aiguilles et des lasers pulsés pour créer blessures localisées et bien contrôlées sur le point d'impact imiter la blessure mécanique et traumatique in vivo et sont susceptibles d'être réel imagerie en temps de la réponse de réparation, mais offre un aperçu de la réparation d'une cellule à la fois. Il est intéressant de noter que l'approche des blessures laser pulsé est distincte de l'utilisation de l'irradiation prolongée de la membrane cellulaire avec des lasers nonpulsed où la blessure de membrane est causée par un chauffage localisé, qui est connu pour induire des effets non physiologiques tels que les dommages photoxidative et photothermique à membrane lipides et des composants cytosoliques ^11.

Les protocoles décrits ici permettent d'exploiter le potentiel d'un of l'en masse approche des blessures, qui repose sur l'utilisation de billes de verre et une de la méthode de blessure localisée (laser pulsé) pour surveiller la capacité, la cinétique et le trafic intracellulaire impliqué dans la réparation de la membrane cellulaire suite à une lésion de la taille du micromètre. Ces approches sont mutuellement complémentaires - blessure majeure permet d'utiliser une population de cellules pour identifier un déficit dans la capacité de réparation et le trafic subcellulaire qui lui est associé. En permettant la visualisation de réel moment de la réparation dans des cellules individuelles, l'approche des blessures laser permet d'identifier ce que l'étape de la réparation de la membrane cellulaire et subcellulaire quels événements sont associés au déficit en réparation. Cette approche a été utilisée pour le suivi de la réparation cellulaire de la membrane dans les organismes de mammifères et invertébrés ^7,12,13. Sur la base des besoins de l'expérience ou l'autre de ces deux approches pourraient être utilisés par lui-même. Toutefois, lorsque la nature du déficit de réparation n'est pas connue ou le mécanisme impliqué dans subcellulaire tson procédé n'est pas connu, à l'aide d'une combinaison de ces approches est utile.

En raison de la variabilité inhérente du nombre de cellules lésées entre les échantillons au point de fin sur la base des dosages de lésions cellulaires, il est nécessaire d'identifier de façon indépendante toutes les cellules qui sont blessés, qui ont réussi à réparer et ceux qui n'ont pas réussi à réparer. L'approche de la blessure de perles de verre que nous avons décrit ici permet d'identifier ces cellules. Lors de la perle de verre blessant il est important que tout en faisant effort pour maximiser le nombre de cellules blessés les blessures se sont doux si les cellules ne reçoivent pas de multiples coups. Ceci est important car blessures répétées fera les cellules (sélective ceux qui sont pauvres à la réparation) meurent et se détachent de la lamelle au cours de la procédure. Cela se traduirait par une sous-estimation de cellules qui n'ont pas réussi à réparer. Il est également important d'éviter tout roulement des billes de verre lors de la manipulation et le lavage des lamelles couvre-objet pour éliminer toute nouvelle blessure quise traduira par une coloration rouge (cellules faussement positifs). Cette approche permet également de blessures surveiller une population de cellules pour la translocation de surface cellulaire de la protéine d'intérêt, comme l'a démontré ici pour lysosome associated membrane protein 1 (LAMPE1). Lors de la surveillance que les protéines localisées à la surface cellulaire par immunofluorescence une exigence essentielle est d'utiliser des anticorps qui se lient au domaine extracellulaire de la protéine d'intérêt et immunolabel cellules avant la fixation. Ceci permet de comparer le niveau de LAMP1 à la membrane cellulaire dans les cellules blessées avec des cellules non blessés ou entre les différentes populations de cellules. Bien que ce protocole a été illustrée à l'aide LAMP1, il peut être appliqué à toute autre protéine de choix pour lequel il est un anticorps spécifique au domaine extracellulaire de la protéine. Lorsque blessure déclenché lysosomale exocytose doit être comparé entre deux lignées de cellules qui n'ont pas été mis en place pour avoir le taux de base similaire (non déclenchée par une blessure) de l'exocytose lysosomale, Surface de la cellule LAMP1 coloration sur les cellules indemnes doit aussi être mesurée. Pour ce un échantillon supplémentaire est traité comme échantillon C2 sauf que à l'étape 9, les cellules doivent être incubées avec l'anticorps primaire. Ceci fournira une mesure du taux basal de l'exocytose lysosomale.

Pour le protocole de blessure laser les membranes cellulaires sont blessés par une haute intensité unique photon ns laser pulsé. Blessant est effectuée en présence de cellules dont le colorant ne pénétrant augmente fluorescence lors endomembrane de liaison (par exemple FM 1-43). Ainsi, suivant la fluorescence de colorant associée aux cellules est une mesure pour le temps pris par la cellule pour guérir ^3. blessure au laser provoque le colorant FM pour entrer dans la cellule et se lient endomembranes, ce qui entraîne l'augmentation de la fluorescence colorant FM. La réparation de la membrane cellulaire endommagée empêche en outre la saisie de colorant dans la cellule. Ainsi, pour une cellule que la réparation, la fluorescence du colorant atteint un plateau, alors que pour une cellule qui ne parvient pas à réparer colorantfluorescence augmente continuellement.

Imagerie des cellules vivantes d'événements intracellulaires individuelles impliquées dans la réparation de la membrane cellulaire nécessite la surveillance de la membrane cellulaire à haut rapport signal sur bruit. Totale de fluorescence à réflexion interne (FRBR) microscopie est une approche bien adaptée pour les événements de la surface cellulaire d'imagerie à un signal de haute ratio bruit ^14-16. Il existe plusieurs systèmes de la FRBR disponibles dans le commerce et l'un de ces systèmes compatibles avec l'imagerie des cellules vivantes peuvent être utilisés. En outre, nous avons décrit les approches pour la mise en place des microscopes TIRF maison ailleurs ^17,18. Indépendante de la configuration de la FRBR, il est nécessaire d'adopter des approches qui permettent la surveillance des différents sorts des vésicules intracellulaires avant et après une lésion. Ailleurs, nous avons fourni une discussion de ces approches qui permettent de surveiller la nature, la durée et le degré de fusion de chaque lysosome ^19. Pour surveiller blessure exocytose de FITC-dextran marqué lysoso déclenchémes décrits dans le protocole 4 de l'élément clé à observer sont les éclairs. Le flash implique la libération de FITC dextran contenu dans lysosome individu en une seule étape résultant de la propagation latérale de la fluorescence. Bien que chaque flash indique généralement une fusion exocytose de lysosomes unique, il est important d'établir en surveillant le nombre de lysosomes sont présents sur le site de fusion avant et après le flash.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS