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Summary
DNabT细胞是罕见的外周T细胞之间;然而，他们是丰富的在某些非淋巴组织。从非淋巴组织中分离的DN T细胞的难度阻碍了其功能的分析尽管越来越多的认可的病理生理意义。我们描述了一种新的协议，用于从小鼠肾脏高度纯化的DN T细胞的隔离。
Abstract
目前还没有标准协议，用于DN T细胞从非淋巴组织的隔离，尽管它们在不同的免疫应答日益报道的参与。 DN T细胞是有牵连的调 节免疫和自身免疫应答和耐受allotransplants 1-6独特的免疫细胞类型。然而DN T细胞，罕见的外周血和次级淋巴器官（脾脏和淋巴结），但都在正常肾脏的主要居民。很少有人知道他们的病理生理功能7，由于其在外围缺乏。最近，我们在稳定状态，并在缺血再灌注损伤中描述的肾脏8这部分人口的综合表型和功能分析。的DN T细胞功能分析将通过开发一个协议，用于从肾脏的隔离大大提高。
在这里，我们描述了一种新的协议，允许isolatioÑ高纯度AB的CD4 + CD8 + T细胞和DN T细胞的小鼠肾脏。简单地说，我们用胶原酶消化肾组织，并通过密度梯度分离肾单核细胞（KMNC）。这是由两个步骤，从KMNC丰富的造血T细胞从3％至70％。第一步骤包括一个正选择使用CD45阳性分离试剂盒的造血细胞。在第二步骤中，DN T细胞被除去使用CD4，CD8，和MHC II类的单克隆抗体和CD1d的α-GalCer的四聚体的非期望的细胞的负分离。这个策略导致了90％以上的纯DN T细胞群。表面染色用上述抗体随后通过FACS分析用于确定纯度。
Introduction
周边αβTCR+ CD3 + CD4 - CD8 -双阴性（DN）T细胞被分成具有不同的表型和功能1-4各种子集。 DN T细胞知之甚少，但越来越多地被牵连在不同的疾病模型4-6病理免疫反应。
DN T细胞，是在各种免疫和自身免疫应答的调节和异体移植耐受的调制日益牵连了独特的免疫细胞类型。4-6，9它们是罕见的外周血和次级淋巴器官（脾和淋巴结）。然而，它们的正常肾和肠上皮10-12主要居民。很少有人知道他们在稳定状态功能7在肾和病理条件下，如肾transpl相关的急性肾损伤（AKI）下蚂蚁。
因为不同的免疫细胞在调节免疫反应，包括alloresponses，限定每个游戏者的角色的错综复杂的角色是在理解alloresponses和设计新疗法至关重要。给出的显著号码存在于生理和不同疾病状态下的肾DN T细胞，DN的T细胞很可能在移植受者起到在小鼠和人类调节免疫和自身免疫应答的关键作用，并且alloresponses。积累虽然仍散落证据牵连的DN T细胞在致病性和免疫功能，但它是知之甚少，为什么，以及他们如何表现出特定的有害或抑制功能和环境如何影响他们。
由于它们的低丰度在肾脏，分离的改进的方法是必要的。
目前还没有标准协议，用于从T DN T细胞的分离他非淋巴组织。我们的协议描述了一种新颖的方法，用于从肾脏DN T细胞的隔离;然而，也可用于各种非淋巴组织的方法。
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Protocol
1，准备工具，培养基和试剂
- 工具：准备试剂在无菌条件下并在层流罩中使用。
- 制备1升的RPMI组织培养基中，添加胎牛血清的5％，2.1克碳酸氢盐，将10毫升谷氨酸100倍，10毫克的HEPES，1毫克丙酮酸钠和10毫升的100×青霉素/链霉素。
注意：推荐的组织培养基，RPMI，是可互换使用的DMEM。 - 制备5％胶原酶的“D”（5毫升胶原酶的“D”来9毫升组织培养基）。
- 作出的Percoll溶液在三种不同浓度：100％，80％和40％。以下浓度计算1样品。保持溶液在室温下。
- 珀解决方案：添加9毫升稀释珀（来自原液）;加入1 ml的PBS的10倍。
- 珀解决方案：添加8毫升珀的100％;加入2毫升的PBS 1X的。
- 珀的解决方案：加入4 mL的Percoll 80％;加入4毫升的PBS 1X的。
- 使1升荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液;加入5 ml的10％BSA（0.1％BSA）中，加入1ml 10％的叠氮化钠（0.1％），将2ml EDTA剂，使高达1000毫升的1×PBS。
2，准备肾消解
- 已经获取任何必要的机构批准，牺牲和抽血的小鼠与标准方法并按照现行的法规和照顾动物的指引。
- 麻醉小鼠用戊巴比妥（0.07毫克/千克）。
- 继续放血。
- 鼠标放置在上手术台仰卧位置。
- 喷雾用70％乙醇的腹部区域。
- 加入10毫升的胶原酶D溶液的培养皿中。
- 取出并从每个鼠标拆封两个肾脏。
- 通过腹部皮肤和腹膜从胸骨到做一个正中切口打开abdomimal腔耻骨。
- 通过横向移动肠道内侧面暴露左肾。
- 仔细分离左侧胶囊镊子。
注意：该胶囊显示为围绕肾透明层和部分地覆盖由肾周围脂肪组织。 - 用手术剪刀切断蒂部血管取出左肾。
- 重复同样的程序右肾。
注：右肾更颅，更接近中线（花梗较短）。
- 将肾入培养皿中。
- 使用常规金属成形刀片切肾组织切成小块（1-2毫米直径），然后将片变成为在孵化30-45分钟的胶原酶溶液在37℃（ 图1）。
3，从肾脏消化制备肾单核细胞（KMNC）的
- 获取肾脏的细胞悬浮液消化用在25毫升的组织培养介质的过滤器（70微米），重悬和混合机械破坏的组织。
- 离心机在400×g离心10分钟，在4℃下沉淀的细胞悬浮液。
- 重新悬浮于4ml的40％的Percoll溶液沉淀，轻轻地覆盖到加入4ml 80％的Percoll溶液与转印塑料吸管，非常缓慢和小心。这将导致在两个阶段通过一个半透明的层显然分开。顶部将是对应于脂质黄色层。
- 在制动切断模式离心机离心以1,500 xg离心30分钟，在室温下进行。
- 通过抽吸去除黄而厚的顶层（约1-2毫升）。
- 收集仅轻微发白的半透明的两相的界面层用移液管。该悬浮液很小心转移到15毫升锥形管中含2ml组织培养基，然后添加13毫升介质，使总体积15毫升。
- 离心机在400×g离心10分钟，在4℃下
- 重悬样品在1ml的培养基中。
- 使用台盼蓝排斥于血细胞计数器计数KMNC的数量和表达的结果作为KMNC的每肾脏数每毫升。
- 洗如上一次。
4，造血隔离（CD45 +）的KMNC细胞（步骤一）
- 重悬细胞高达10 7到90微升缓冲液中。
- 加10微升CD45微珠并孵育15分钟，在4℃下
- 加入1 ml的运行缓冲液，使反应停止。离心机在400×g下在500μl的缓冲液中4℃，重悬10分钟。
- 通过放置在磁铁准备磁列和冲洗用3毫升缓冲液中。
- 通过磁性柱通过将细胞悬浮液，并收集通过柱子的未标记细胞。
- 用3毫升银行经营的洗细胞三次样缓冲液。然后收集污水。
- 从分离器和吸管5毫升电泳缓冲液到列中删除该列，并立即冲洗掉标记部分。这部分包含了CD45 +细胞。计数细胞。
- 计算不同的T细胞亚群的绝对数为肾脏由阳性细胞的百分比通过流式细胞术测定（ 图2）相乘KMNC的总数。
5，隔离的DN性T细胞的CD45 +编写的由负选择（步骤二）
- 添加2.5微升（0.5毫克/毫升，1.25微克）下列各生物素化抗体的：抗-CD4，抗CD8，抗Fc受体（CD16/32），抗-II类MHC（IA b）所示，抗CD1d的PBS-57四聚体，每10 7造血细胞。
- 孵育细胞在冷室中30分钟。
- 加入1 ml的抗生物素微珠。
- 孵育在冷室中30分钟。
- 将管在T他磁体和进行消耗。
- 计数存活的细胞用血细胞计数器确定DN T细胞的负分数的总数。
- 检查的DN T细胞的纯度流式细胞仪由以下这门控策略：第一栅CD45 +，第二栅极TCRαβ+。排除的CD1d +细胞。情节的CD4 +与CD8 +识别DN T细胞（ 图3）。
- 通过在纯度确定的百分比相乘的总数。
注：在超过90％的纯DN T细胞的人口使用该协议的结果。
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Representative Results
野生型C57BL / 6（B6）肾包含每个肾约1.5-2.1×10 6单核细胞。约小于10％是造血CD45 +细胞。对于肾脏单核细胞（KMNC）的制备中，肾脏切成小块， 如图1后跟消化，用5％的胶原酶。
其次是通过执行一个密度梯度离心来收集KMNC层（图2，左图）。 KMNC然后用CD45 +的磁性微球作为在第4（步骤I）所述受到正选择。列结合的细胞，然后通过FACS洗脱并为CD45 +分析。这将导致在CD45 +细胞富集至约80至95％，这通过流式细胞仪（图2中，中间面板）进行分析。中富集造血CD45 +细胞，约40-60％为αβTCR +（数据未显示），约30-60％的DN T细胞（图2，右图）。
涉及经受富集的CD45 +细胞，以负选择标记和除去CD4 +，CD8 +，MHC II类+和使用生物素特异性单克隆抗体和抗生物素微珠和磁列CD16/32 +细胞的最后一步。这个结果在高度纯化（90-95％）的DN T细胞（ 图3）。下面这个协议有可能获得高达0.5×10 6个造血CD45 +每只小鼠（2肾）磁性标记的细胞。
图1。肾脏进行消化，用5％的胶原酶溶液的制备的小鼠肾脏被切成小块的1-2毫米，并放置在30分钟为挖胶原酶ð5％的溶液estion。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2战略CD45 +造血细胞从肾脏的浓缩左：。肾脏跨国公司利用CD45 +套件受到正选择的CD45染色富集前中心 ：肾跨国公司利用CD45 +套件受到正选择富集CD45染色右 。： αβTCR+细胞CD45的门控+细胞T细胞的不同子集之间的CD4 + CD8 +和配置文件。 请点击此处查看该网络的放大版本GURE。
图3纯度分离的DN T细胞的左：孤立肾的DN T细胞的负选择CD45染色中心 ：。孤立肾的DN T细胞的负选择TCRαβ染色右 ：孤立的DN T细胞中CD4 + CD8 +和通过染色阴性选择。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图4。淋巴细胞在肾纯化前。
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Discussion
有一个在DN T细胞增加的兴趣，因为他们被牵连在不同的病理情况，如自身免疫性疾病，癌症，移植耐受和肾脏，包括急性肾损伤（AKI）的原发疾病，肾小球肾炎8，13。因此，有必要更好地理解和描述的DN T细胞的病理生理功能。然而，目前仍缺乏这些细胞的功能相比，CD4和CD8 T细胞的了解。一个主要的原因是DN T细胞在次级淋巴器官的缺乏，因此难以取得足够的细胞在体外分析和过继转移实验。 DN T细胞主要分布在非淋巴组织如肾脏8，但缺乏可靠的方法，从实体器官的隔离，阻碍了努力，调查它们的功能。因此，我们的新协议的DN T细胞的分离从肾脏s的预期加速研究的DN T细胞的功能。 DN T细胞积聚在淋巴结中大量的缺陷的Fas（LPR）或FasL的缺陷（GLD）的小鼠，它们可以从淋巴器官9，14，15可以很容易地分离，但它仍然是一个挑战，从其他隔离这些细胞组织。
根据这一协议，从两只老鼠的肾脏产生约0.5×10 6的造血细胞（CD45 +）和周围0.2×10 6的DN T细胞。这一数字足以在体外培养，功能分析和/或FACS分析来执行。的DN T细胞群体的纯度必须通过流式细胞术来确认。该协议提供的DN T细胞，可作为纯98％的人口。虽然这种协议被设计为从肾脏DN T细胞的分离，它可以被修改为其它非淋巴器官中分离的T细胞，例如如心脏，甲状腺等。
因为DN T细胞代表一小口，有时需要通过执行额外的几轮纯化，以增加产率。然而，如果需要（高于0.5×10 6细胞）一个号码DN T细胞更高的建议进行，以减少时间和试剂成本分拣分离。
总之，本协议描述了一种新颖的方法，用于从肾脏DN T细胞的分离。它是由一种制备（通过消化和KMNC富集）的步骤，接着通过阳性选择和阴性则选择非期望的细胞群的消耗。因此，有DN T细胞中的隔离工艺最小的直接操作。值得注意的是，有用于从小鼠和人类外周血和从次级淋巴器官，类似于那些用于常规T细胞的分离DN T细胞的分离的现有协议。
ove_content“>因为它已经表明，某些DN T细胞表达Fc受体-γ，另一种选择是不包括CD16/32 +在鸡尾酒16，17。的DN T细胞的成功分离，需要非常注重细节。尤为关键步骤包括：组织消化，肾组织切成小块的切割，并正确地识别和收集光层中的密度梯度总的来说，几轮实践和一些手巧的所需达到所期望的结果。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院的PBS（R21 AI095484）的支持。我们感谢健保四聚体核心设施的CD1d四聚体。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37 °C with 5% CO2) | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10x | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-MHC class II (I-A b) biotinylated | BD | 553609 | |
| AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys - Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| CD1d α-galcer tetramer | NHI |
References
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Tags
免疫学，第87，双阴性（DN）αβ，T细胞，CD45 + T细胞的分离，肾细胞，非淋巴组织中，T细胞的纯化，缺血再灌注损伤，急性肾损伤，组织居民淋巴细胞，淋巴增生性疾病，红斑狼疮Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle
