Summary
El secano Barnes laberinto es ampliamente utilizado para medir la capacidad de navegación espacial en respuesta a estímulos aversivos ligeramente. Durante días consecutivos, el rendimiento (por ejemplo, la latencia para localizar huida jaula) de los sujetos de control mejora, indicativo de aprendizaje normal y la memoria. Las diferencias entre las ratas y ratones necesitan aparatos y la metodología de los cambios que se detallan aquí.
Abstract
El aprendizaje espacial y la memoria de los ratones de laboratorio a menudo se evalúan a través de la capacidad de navegación en laberintos, el más popular de los cuales son la (Barnes) laberintos de agua y sobre la tierra seca. Mejora el rendimiento en las sesiones o ensayos se piensa para reflejar el aprendizaje y la memoria de la ubicación de escape jaula / plataforma. Considerado menos estresante que los laberintos de agua, el laberinto Barnes es un diseño relativamente simple de un superior plataforma circular con varios agujeros equidistantes alrededor del borde perimetral. Todos menos uno de los agujeros con doble fondo o ciego que termina, mientras que una conduce a una jaula de escape. Estímulos aversivos Ligeramente (por ejemplo, plafon brillantes) proporcionan la motivación para localizar la jaula escape. Latencia para localizar la caja de escape puede ser medida durante la sesión, sin embargo, los puntos finales adicionales suelen requerir la grabación de vídeo. A partir de esas grabaciones en vídeo, el uso de software de seguimiento automático puede generar una variedad de criterios de valoración que son similares a los producidos en los laberintos de agua (por ejemplo </ Em> la distancia recorrida, la velocidad / velocidad, el tiempo de permanencia en el cuadrante correcto, el tiempo pasado en movimiento / reposo, y la confirmación de latencia). Tipo de estrategia de búsqueda (es decir, al azar, serial o direct) se pueden clasificar también. Barnes metodologías de construcción laberinto y las pruebas pueden ser diferentes a los pequeños roedores, tales como ratones, y grandes roedores, como las ratas. Por ejemplo, mientras que las señales extra-laberinto son eficaces para las ratas, roedores salvajes más pequeños pueden requerir señales intra-laberinto con una barrera visual por el laberinto. Estímulos apropiados deben ser identificados que motivan el roedor para localizar la jaula de escape. Tanto Barnes y laberintos de agua puede llevar mucho tiempo ya que se requieren típicamente 4-7 ensayos de prueba para detectar un mayor rendimiento del aprendizaje y la memoria (por ejemplo, las latencias más cortas o longitudes de trayecto para localizar la plataforma de escape o jaula) y / o diferencias entre los grupos experimentales. Aun así, el laberinto Barnes es una evaluación de comportamiento ampliamente utilizado medir capacidades de navegación espacial ysu potencial de perturbación por neuroconductuales, manipulaciones genéticas, o exposición a la droga / sustancia tóxica.
Introduction
El aprendizaje espacial y la memoria en roedores de laboratorio se evaluó por primera vez con ratas privadas de alimento que navegaban en un laberinto de callejuelas de localizar un reforzador de alimentos 1. Varias décadas más tarde, un sistema de memoria de referencia espacial fue propuesto 2. A diferencia de la memoria de trabajo, que se refiere a la memoria dentro de una sesión de pruebas ni juicio, la memoria de referencia se refiere a la memoria a través de las sesiones de pruebas o ensayos y está más estrechamente relacionado con la memoria a largo plazo.
Existen varios tipos de laberintos se han desarrollado como evaluaciones no invasivas de este aprendizaje dependiente del hipocampo y la memoria espacial en roedores pequeños y grandes (por ejemplo, laberinto de agua, múltiple T-laberinto, laberinto de brazos radiales y laberintos de secano) 3-6. Aquí, nos centramos en la plataforma circular o Barnes laberinto, descrita por primera vez en 1979 por el Dr. Carol Barnes 7. Este laberinto se ha utilizado para probar el aprendizaje de navegación espacial y la memoria en una amplia gama de modelos de roedores, incluyendo ratas (Ranorvegicus TTU), ratones (Mus musculus), ciervos ratones (Peromyscus maniculatus bairdii), los ratones de California (Peromyscus californicus) y roedores hystricomorph (por ejemplo, degus [degus Octodon]) 8-13. Otras especies evaluadas utilizando el laberinto Barnes incluyen las cucarachas americanas (Periplaneta americana), 14 serpientes del maíz (Elaphe guttata guttata) 15, reptiles escamosos (por ejemplo, del lado-blotched lagartos [Uta stansburiana]) 16, y los primates no humanos (por ejemplo, los lémures ratón [Microcebus murinus]) 17. En nuestros laboratorios, el rendimiento laberinto Barnes se ha utilizado como índice de la neurotoxicidad después de bisfenol desarrollo A (BPA) o etinil estradiol (EE2) exposición 9-1113. También se utiliza comúnmente para el comportamiento de fenotipos de varias cepas de ratón 18-21, la evaluación de los efectos del envejecimiento 7,22-28, y sin duda relacionada con la enfermedad de AlzheimerIIC en modelos animales 3,29-33, así como los efectos del ejercicio y la dieta, ambientales y metabólicos alteraciones 34-42.
Una ventaja principal del uso de laberinto Barnes es que induce menos estrés en los temas relativos a laberintos de agua, tales como el laberinto de agua de Morris 43, aunque ambos pueden inducir aumentos agudos en las concentraciones de corticosterona en el plasma en ratones 44. Como un laberinto de la tierra seca, el laberinto Barnes puede ser más etológico-relevante para los roedores terrestres 45. Aunque el rendimiento del laberinto de agua ha demostrado ser más sensible a las alteraciones genéticas en ratones 3,46,47, desempeño en el laberinto de Barnes es más sensible a ciertas otras alteraciones 48,49. En modelos de roedores donde el uso de laberinto de agua no es posible, el laberinto Barnes puede proporcionar una evaluación de afinado de la retención de la memoria espacial 31. Los estímulos aversivos ligeramente usados típicamente en el laberinto Barnes (luces brillantes), es decir,sin embargo, no puede proporcionar suficiente motivación para que el roedor para localizar la caja de escape 45. Además, los roedores pueden aprender que ningún castigo ocurre si no entran en la jaula de escape. Por lo tanto, en lugar de la búsqueda activa de la jaula de escape, algunos roedores exploran activamente el laberinto durante largos períodos de cada ensayo. Como ya han dicho por Kennard y Woodruff-Pak 24, este aumento de la exploración prolongará la latencia para localizar la caja de escape, la longitud del trayecto, y aumentar el número de errores. Por lo tanto, la medición de varios parámetros, incluyendo latencia, tasa de error, el tiempo pasado en los cuadrantes correctas e incorrectas, velocidad, tiempo en movimiento, tiempo de descanso, y la estrategia de búsqueda, se puede proporcionar en conjunto un mejor indicador de espacio de aprendizaje de la navegación y la memoria la capacidad de cada tema 8 -10. Además, el rendimiento se puede medir como la latencia para localizar primero la jaula de escape (medida primaria) o la latencia para entrar en la jaula de escape (medida total). Algunos tienen argumentoed que las medidas principales de actuación son un reflejo más exacto de aprendizaje espacial que las medidas totales de 50. La mayoría de los estudios, incluyendo los ejemplos descritos aquí, utilizan la latencia para entrar en la jaula de escape para determinar la tasa de error y la estrategia de búsqueda. Además, algunos sistemas de software de seguimiento tienen un sistema de detección de cuerpo de tres puntos que puede medir las frecuencias de inhalación de los vs correctas agujeros incorrectos. Por último, el laberinto se debe limpiar a fondo con etanol entre los ensayos para eliminar señales olfativas que podrían proporcionar pistas o resultar molesto para los animales posteriores.
Diseños laberinto Barnes variar, pero en general cada uno tiene 12 o 20 agujeros de escape potenciales, sólo uno de los cuales conduce a la casa o una jaula de escape. La jaula de escape puede estar situada justo debajo del hueco de escape en la parte superior del laberinto (por laberintos sin paredes) o integrado en la pared circundante del laberinto. Las señales pueden variar en tamaño de aproximadamente 16,5 cm de altura o anchura (dentro de la maze) a una línea horizontal 21,6 cm de ancho colocados desde el suelo hasta el techo de la pared de la sala fuera del laberinto. Figuras 1-5 muestran ejemplos de Barnes diseños de laberinto para especies Peromyscus (Figura 1) y ratas (figuras 2-5). Tapones o dobles fondos deben cubrir los agujeros nonescape para evitar que el animal caiga fuera del laberinto. Tamaño de la habitación de prueba puede variar (~ 20 m 2), pero debe ser lo suficientemente grande como para proporcionar un amplio espacio para el laberinto, habituar a los animales a la sala, con capacidad para un ordenador con video de puesta a punto (si se utiliza), y un lugar para el experimentador para sentarse a una distancia (al menos ~ 122 cm) desde el aparato de laberinto de tal manera que su presencia no interfiere con el desempeño del animal. Asignación de la ubicación jaula de escape debe ser equilibrada entre los grupos de tratamiento y sexo. Mientras que los procedimientos específicos descritos aquí no incluyen girar el laberinto entre los ensayos para desalentar el uso de los intra-laberinto señales olfativas, algunos estudiosincorporar este procedimiento 50. En nuestros procedimientos, el laberinto se limpia con etanol entre los ensayos para eliminar señales olfativas.
En la localización de la jaula de escape, tres tipos de estrategias de búsqueda se han definido (llamado originalmente "patrones" de Barnes 7): 1) al azar, operacionalmente definidos como búsquedas localizadas de agujeros separados por senderos que cruzan el centro del laberinto, 2) de serie, que se define como una búsqueda sistemática de agujeros consecutivos en un sentido horario o antihorario, y 3) directa o espacial, definida como la navegación directamente al cuadrante correcto sin cruzar el centro del laberinto más de una vez y con tres o menos errores. En general, la prueba se repite, roedores típicamente progresan a través de las estrategias de búsqueda en el orden indicado (al azar, serial y directa) 51. Una sonda de prueba sin la jaula de escape también puede ser utilizado como una medida adicional de la memoria 50.
El protocolo y el representanteResultados En este sentido se han desarrollado para dos tipos de roedores (denominado Peromyscus especies de roedores pequeños de otro modo) y ratas. Mientras que estos procedimientos generales podrán celebrar también para ratones consanguíneos y / o consanguínea (Mus musculus), otros estudios deberían ser consultados sobre posibles diferencias metodológicas para estas últimas especies de 18-21.
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Protocol
1. Barnes procedimiento Maze para pequeños roedores
- Encienda las luces del techo por encima del laberinto y el lugar "no entrar" señales en el exterior de la puerta del laboratorio.
- Traiga ratones en sus jaulas normales a la sala de ensayo de aproximadamente 30 minutos antes de comenzar el primer ensayo para permitir la habituación. Si la habitación es tranquila, puede que no sea necesario incluir el ruido blanco, de lo contrario esta medida cautelar puede ser considerado.
- Configure el programa de seguimiento.
- Retire con cuidado el primer ratón de su jaula y coloque en la caja de plástico cubierta de altura. Coloque su escape (hogar limpio) jaula de polipropileno (29 cm x 19 cm x 13 cm) debajo del orificio de evacuación designada.
- Asegúrese de que el papel que está bloqueando el tubo se retira de ese agujero de escape y el resto de los agujeros se tapan.
- Dibuje cortina alrededor del laberinto.
- Coloque la caja de plástico con el ratón en el interior, en el centro del laberinto y aproximadamente 8 segundos después, suavemente take el animal fuera de la jaula y colocarlo en el laberinto.
- Después de colocar el animal en el centro del laberinto, en silencio pasar a la zona de ordenadores (~ 150 cm desde el laberinto).
- Iniciar el programa de software de seguimiento apropiado que ya debería estar abierta para asegurar un mínimo de tiempo (dentro de unos pocos segundos) transcurrido desde el momento en que el animal fue colocado en el laberinto hasta que el programa se inicia documentar su desempeño.
- Observar el desempeño del animal del monitor del ordenador y el número de registro del agujero, número de juicio, la estrategia de búsqueda, y el número de errores cometidos. Un error se define como la inhalación de un agujero correctos. Evaluación de la estrategia de búsqueda se puede hacer en vivo o posterior basado en el patrón de seguimiento.
- Estrategia de búsqueda se clasifica como directa (de ir directamente a la jaula de escape con 3 o menos errores),
- Serie (viajando a lo largo del perímetro laberinto hasta la jaula escape se encuentra), o
- Random </ Strong> (cruzando el centro del laberinto varias veces para comprobar varios agujeros).
- Detener el programa de seguimiento cuando el animal tiene las cuatro patas en el interior de la jaula de escape.
- Si el ratón no consigue entrar en la jaula de escape dentro de 5 minutos, con cuidado lo guiará hasta la ubicación correcta y dentro de la jaula de escape. Deje que el ratón permanece en la jaula de escape durante 2 min.
- Retire del ratón de la jaula de escape y colocar en jaula.
- Rocíe la parte superior laberinto y escapar de la jaula con etanol al 70% y secar. Ajuste la primera jaula / mouse de lado durante 30 minutos antes de ejecutar su segundo juicio.
- Antes de comenzar la próxima ratón, tapar el agujero de escape previamente correcta y quitar el tapón de papel bloquear el agujero del orificio de escape designado al siguiente tema.
- Cada ratón es la prueba de 2 ensayos / día con un intervalo entre ensayos de aproximadamente 30 min.
- Repita estos pasos hasta que todos los ratones se han probado durante siete días consecutivos, lo que puede aumentar la probabilidad of observar un mejor rendimiento y / o diferencias entre grupos de tratamiento, con relación a sólo cuatro días de datos.
2. Barnes Testing laberinto para ratas cuando un programa de seguimiento no está disponible
- Asegúrese de que el laberinto se encuentra en su ubicación correcta (directamente centrada debajo de las luces), dobles fondos que bloquean los orificios nonescape y evitar que el animal caiga estén firmemente en el laberinto, y la jaula de escape está en el lugar designado para el primer sujeto. Luces de arriba por encima del laberinto deben estar encendidos.
- Asegúrese de ordenador y la cámara están listos y un cronómetro disponible.
- Encienda el ruido blanco para atenuar cualquier ruido de otras localidades cercanas. La silla del probador es de aproximadamente 122 cm del borde más cercano de la parte superior del laberinto y permanece en el mismo lugar durante toda la prueba.
- Un contador de tiempo (ajustado a 2 min) debe estar disponible (sólo es necesario en el Día 1 de la prueba). El temporizador no debe "bip" o de lo contrario hacer ruido. Puerta (s) para probar room debe tener de "No entrar" en el exterior.
- Una hoja de pedido de prueba para los sujetos una lista del orden de las pruebas de materia, el número de sesiones, la ubicación del número de agujero de la caja de escape para cada sujeto, y las áreas para registrar la latencia y la hora del día para cada tema, así como una zona para cualquier notas necesarias (Figura 6).
- De 30 a 60 minutos antes de la primera rata se va a probar, llevar a los animales en sus jaulas a la sala de ensayo para permitir la habituación.
- El tubo central que la rata se coloca en al principio de un ensayo se encuentra en el centro del laberinto. Ajuste la hoja de cartón que muestra la primera identificación de los animales en la parte superior. Esto permite la grabación de vídeo para capturar la identificación de los animales para facilitar la identificación de cada sujeto mediante la observación de los primeros segundos del video.
Inicial Day Testing 1:
- Comienza la grabación de vídeo del ordenador (si se utiliza) e incluyen aproximadamente 5 segundos de la prueba con la hoja de identificación de los animales para el subject identificación. Nombre de archivo (o fecha de creación) identificarán día / hora de la prueba.
- Retire el primer animal de su jaula (verificar la identidad si varios animales están en jaulas) y suavemente coloque de cabeza en la jaula de escape. Cubra la jaula de escape con un falso fondo adicional e iniciar el temporizador 2 min. Esto permite que el animal para habituarse a la jaula de escape.
- Después terminó 2 min temporizador, retire con cuidado animal del escape de la jaula (quitar la tapa inferior falsa, así y algo lejos de laberinto), hoja de ID ascensor, e inmediatamente colocar a la rata en el interior del tubo central. Cubra la parte superior del tubo central con lámina de cartón ID.
- Suave y lentamente levante el tubo central con cubierta de cartón y póngalos aparte. Inicie el cronómetro como el tubo central se eleva por encima del animal. Vaya a sentarse en la silla del probador.
- Siéntese tranquilamente en la silla, mirando el animal y el cronómetro. Cada animal tiene un máximo de 5 minutos para encontrar la jaula de escape.
- Si la rata encuentra la jaula de escape en menos de5 min, detenga el cronómetro y la latencia y la hora del día en la hoja de registro de pedido de prueba. Retire animales de escapar de la jaula y poner de nuevo en jaula.
- Si la rata no encuentra la jaula de escape dentro de 5 min, guíe con cuidado el animal a la jaula de escape y permita 15 segundos para pasar antes de retirar y devolver el animal a la jaula.
- Esta duración seg 15 se puede programar utilizando un reloj con segundero en la pared de la sala de ensayo.
- Tiempo de registro del día en la hoja de pedido de prueba y registro que la rata no se encontró la jaula escape.
- Si la rata cae / saltos fuera del laberinto, el probador debe echar un vistazo a cronómetro de tiempo. El auditor debe entonces tratar de recuperar rápidamente el animal.
- Si esto se puede hacer dentro de 10 seg, reemplazar el animal en el centro del laberinto y registrar el tiempo de la caída / salto en la hoja de prueba (si el probador puede distinguir entre una caída o salto, esto debe ser denotado). Continúa el juicio.
- Si la recuperación de la animal tarda más de 10 segundos, se detiene el cronómetro, y puso animales de nuevo en la jaula. Registre el tiempo de otoño / salto (si el probador puede distinguir entre una caída o salto, tenga en cuenta esto).
- Los datos de los ensayos en los que un animal cayó / saltó y no se pudo recuperar a los 10 segundos se omiten en los análisis estadísticos.
- Detener la grabación de vídeo en el ordenador. Registre cualquier comentario sobre el juicio.
- Retire cualquier resto de orina o heces de la parte superior del laberinto, rocíe con etanol al 70%, y seque a fondo. Retire escapar de la jaula y limpiar con etanol al 70%.
- Ponga una jaula de escape limpio en la ubicación designada para el próximo tema. Tener más de una jaula de escape permite que cada uno se seque al aire para disminuir el olor del etanol. Ponga un falso fondo limpio en el hoyo anterior (para que todos menos uno agujero tiene un doble fondo y que contiene un agujero de la jaula de escape).
- Ajuste el tubo central con la hoja de identificación para el siguiente tema en el centro del laberinto. Comienza la grabación de vídeo en el ordenador. Retire el siguiente animal a ensayar, poner en fuga jaula (si Día / Sesión 1), y empezar a 2 min del temporizador (sólo si el Día / Sesión 1). Continúe desde el paso 2 anterior. Cada sujeto recibe 1 ensayo / día.
- Después de que todos los animales se ponen a prueba, limpie el laberinto y escapar de la jaula, apague las luces del techo, y el ruido blanco. Eliminar "Do Not Enter" signo (s) de la puerta (s).
Días 2 a 7 Pruebas
- Configure sala de pruebas y laberinto para las pruebas, como se detalla más arriba.
- Ajuste el tubo central en el centro del laberinto con la hoja de identificación en la parte superior. Comienza la grabación de vídeo. Retire el primer animal de la jaula en casa y colocar en el tubo central.
- Este paso se diferencia Días 2-7 desde el Día 1, en concreto, en los días 2-7, el sujeto se coloca directamente en el tubo central después de la eliminación de la jaula de alojamiento y el período de habituación 2 min dentro de la jaula de escape no se hace.
- Repita el procedimiento comenzando desde el paso 4 anterior.
3. Análisis estadísticospara Barnes Maze Endpoints
- Los análisis de datos pueden requerir varias pruebas estadísticas. Las variables continuas, tales como la latencia y la tasa de error, pueden ser analizadas como parcelas divididas en el espacio y el tiempo 52.
- Si algunos animales no localizan el escape o en el hogar jaula dentro del tiempo máximo permitido, los datos de latencia se pueden asignar como máximo y analizados mediante el uso de pruebas ProcLife en SAS versión 9.2 de software de análisis.
- Este método estadístico es útil para los datos de comportamiento en las que hay un corte de límite superior.
- Estrategia de búsqueda Los datos se pueden analizar mediante el uso de un diseño de medidas repetidas con PROC GLIMMIX y la versión SAS 9.2 software de análisis.
- Este primer análisis emplea un acumulado registrarlo enlace y una distribución multinomial de tal manera que las tres estrategias de búsqueda (al azar, serial y directa) se incluyen en este análisis.
- Para determinar si los animales están aprendiendo a usar la estrategia de búsqueda más eficiente (directa), una segundad análisis sobre la estrategia de búsqueda se puede realizar en el que se combinan y se comparan con la estrategia más eficiente de búsqueda directa las dos estrategias menos eficientes (al azar y de serie).
- Este último método resulta en una distribución binomial y también emplea PROC GLIMMIX.
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Representative Results
Ratones de los ciervos machos sexualmente maduros dependen de una mayor capacidad de navegación espacial para localizar socios potenciales de cría, que son ampliamente difundidos en todo el entorno. Tanto la exposición prenatal y adulto a la testosterona son esenciales en la organización y activación de este comportamiento adulto de sexo masculino más tarde 53. Como tal, se presume que la exposición temprana a los compuestos disruptores endocrinos podría perturbar este rasgo más tarde en los hombres. Para probar esta hipótesis, los ratones ciervos machos y hembras fueron expuestas de desarrollo a través de la dieta materna con varias dosis de relevancia ambiental de BPA en una dieta libre de fitoestrógeno, un control positivo de estrógeno (etinil estradiol [EE2]) en una dieta libre de fitoestrógeno, o la base controlar la dieta refinada-fitoestrógeno gratuita, y se evaluaron para un rendimiento laberinto Barnes como adultos. Figura 1 muestra el aparato de laberinto Barnes para esta especie. Los varones expuestos a los dos más alto, pero no el más bajo, las dosis de BPA demuestrand déficits equivalentes en el aprendizaje espacial, tal como se manifiesta por la latencia prolongada, aumento de la tasa de error, y la incapacidad para convertir la estrategia de búsqueda directa durante el período de prueba (Figuras 7-9). Sin embargo, las hembras expuestas a EE2 y la dosis media de BPA, pero no las otras dosis de BPA mostraron patrones masculinizados de aprendizaje espacial y la memoria (es decir, la disminución de la latencia y el aumento de la utilización de la estrategia de búsqueda directa) 9,13.
En contraste con los ratones de los ciervos polígamos, sus primos relacionados, los ratones machos monógamos California, aumentar su éxito reproductivo por lazos de pareja y permanecer en el territorio con una sola hembra y compartiendo las responsabilidades de crianza 54,55. Por lo tanto, la capacidad de navegación espacial no ha sido sometida a una fuerte sección evolutiva en ratones de California. En consecuencia, la presunción es que a principios de BPA y la exposición EE2 no apuntarían a este comportamiento en los ratones de California. En apoyo de esta hipótesissis, la exposición a BPA en el desarrollo o EE2 no alteró los comportamientos espaciales de navegación (latencia, tasa de error, o la conversión a la estrategia de búsqueda directa) en los hombres o mujeres, que demostraron respuestas comparables en todos los grupos de tratamiento (Figuras 10 y 11) 10. En comparación con los ratones control ciervos, ratones de control de California no disminuyeron el número de errores cometidos durante los siete días de prueba consecutivas ni tampoco las de control de California ratones machos aumentar el uso de la estrategia de búsqueda directa. Esto puede reflejar una diferencia especie en la capacidad de aprendizaje, sin embargo, es posible que se requiera un mayor refinamiento de la evaluación del aprendizaje y la memoria de pruebas viso-espacial de los ratones de California.
El aparato de laberinto de Barnes y el hardware asociado para las ratas se muestran en las Figuras 2-5. Este aparato se utilizó para evaluar el aprendizaje espacial y la memoria de ratas Sprague-Dawley macho y hembra en los días postnatales 47-51 (5 consecuenciasdía cutivo, 1 ensayo / día). En el último día (día 5), la jaula de escape fue movido 180 ° de su ubicación original en los días 1-4. Estos temas han sido previamente evaluados por el reflejo de enderezamiento y el comportamiento tabla inclinada (predestete), y la conducta de juego, los niveles de actividad de campo abierto, y la coordinación motora. Sus presas habían consumido 3 pequeños trozos de barquillo de vainilla sobre el que se dispensó 1 ml / kg de peso corporal de agua en los días de gestación 6-21. Los sujetos mismos fueron tratados oralmente con 1 ml / kg de peso corporal de agua dos veces al día en los días postnatales 1-21. Al destete, que estaban alojados par-con un hermano del mismo sexo. Sin embargo, sólo 1/sex/litter se evaluó para desempeño en el laberinto de Barnes. La Figura 12 muestra la latencia media para localizar la jaula de escape para cada sexo en cada uno de los días de prueba 5. Efectos principales significativos del sexo (p <0,04) y la sesión (p <0,01) indicaron latencias más cortas en las hembras y latencias más cortas en los días 2-5 en relación con el día 1. Otros VHAe informó también latencias más cortas en las ratas hembra 56, sin embargo, los efectos sexuales similares no siempre se han observado en nuestro laboratorio 11. Por lo tanto, un efecto del sexo consistente en ratas es todavía por determinar puntos finales distintos de latencia aún no están disponibles;. Sin embargo, el seguimiento de software está en uso en un estudio similar para examinar la tasa de error y la estrategia de búsqueda en ratas.
Figura 1. El aparato laberinto Barnes para especies Peromyscus. A) Las señales geométricas intra-laberinto (por ejemplo, círculo, cuadrado, triángulo y la estrella) se colocan en el interior de la pared del laberinto cada 90 °, hay 12 agujeros de escape colocados cada 30 °, y el laberinto está rodeado por una cortina negro (no se muestra). B) La parte superior laberintose coloca en un soporte de polipropileno y elevado 100 cm por encima del suelo. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. El aparato de Barnes laberinto para ratas. La parte superior laberinto y soportes de apoyo se pueden ver con la tapa de laberinto diámetro y la altura desde el suelo se muestra. Los números en el suelo indican el número de agujeros y permitir que el probador para colocar la jaula de escape en el lugar designado (los números de los pisos no pueden ser vistas por el sujeto). Una de las señales visuales extra-laberinto se puede ver en la pared del fondo (es decir, las rayas verticales negras). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. Una vista más cercana del aparato laberinto Barnes para las ratas blancas Los toboganes de escape de la jaula en las ranuras en la parte inferior de la parte superior laberinto.. Ranuras similares se encuentran en la parte inferior de la parte superior del laberinto para cada hoyo perímetro. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 4. El tubo central con la identificación de la muestra sujeta la hoja en la parte superior del aparato de laberinto Barnes para las ratas. La cubierta de cartón levanta lejos a placse sustituye a continuación, e la rata en el interior del tubo y. El mango en el tubo central permite la elevación fácil para comenzar el juicio. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 5. La jaula de escape para las ratas con las dimensiones. Pisadas pequeñas en la rampa descendente proporcionar tracción para la rata al entrar. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 6.
. Figura 7 Efectos de la exposición del desarrollo de los ratones macho y hembra de venado al BPA o EE2 en la estrategia de búsqueda en Barnes laberinto A) Ejemplo de diagramas que ilustran las tres estrategias definidas de búsqueda:. Aleatorio (arriba), de serie (en el centro) y directa (abajo) . B) Porcentaje de BPA, EE2 y ratones de control que emplea aleatorio (amarillo), serie (verde) o (negro) las estrategias de búsqueda a través de las pruebas directas de adquisición. Machos CTL utilizan la estrategia de búsqueda directa más comúnmente durante el período de ensayo de 7 días consecutivos de todos los demás grupos, excepto a dosis bajas de BPA machos y hembras EE2 (todos los valores de p <0,05). CTL = control; EE2 = etinil estradiol, BPA = bisfenol A Adaptado con permiso de.0;. 13 Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 8. Efectos de la exposición del desarrollo de los ratones macho y hembra de venado al BPA o EE2 (mismos grupos que en la Figura 3) en la latencia para localizar la caja de escape en el Barnes laberinto. A) Los varones. B) Las hembras. CTL machos más rápidamente ubicada la jaula de escape correcta, como se ejemplifica en las latencias más cortas, que las hembras de CTL (p = 0,0103), machos expuestos EE2 (P <0,0008), y los machos superiores y de la dosis media de BPA (P = 0,03, P = 0,02, respectivamente). Machos de CTL, sin embargo, mostraron respuestas similares como dosis bajas de BPA machos y hembras EE2 (P> 0,05). En contraste, las mujeres habían EE2 dperíodos de latencia ecreased todo el período de prueba que EE2 machos expuestos (p = 0,0013). Los datos se presentan como la media ± SEM. Adaptado con permiso de Jasarevic et al. 13 Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 9. Exposición durante el desarrollo de los ratones de los ciervos machos y hembras al BPA y EE2 (mismos grupos que en la Figura 3) en los errores de escape. A) Los varones. B) Las hembras. Machos de CTL demostraron aproximadamente la mitad del número de errores o entradas incorrectas en los agujeros en comparación con hembras de CTL (P = 0,0002) y los machos EE2 (P = 0,02). Por otra parte, los machos de CTL cometieron menos errores que la dosis superior varones BPA (P =0,02), pero no difirió de la tasa de error (P> 0,05) de la dosis, ya sea media o baja machos BPA. Por otro lado, las hembras EE2 demostraron una respuesta masculinizada de tal manera que este grupo poseía la misma tasa de error como machos de CTL y errores redujo (p = 0,002) que en los hombres de EE2. Dosis Oriente hembras expuestas al BPA también mostraron menos errores que las dosis bajas de BPA y CTL hembras (P = 0,0005 y 0,01, respectivamente). Los datos se presentan como la media ± SEM. Adaptado con permiso de Jasarevic et al. 13 Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 10. Estrategias de búsqueda de ratones machos y hembras de California en las pruebas de laberinto Barnes estrategias de búsqueda. Arun código de colores e: al azar (amarillo), serie (verde) y directa (negro). Durante el período de prueba de 7 días, no hubo efectos significativos de sustancia tóxica o de sexo en el empleo de estrategias de búsqueda para estos animales. Adaptado con permiso de Williams et al. 10 Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 11. Latencia para localizar la caja de escape y escapar de los errores en las pruebas de laberinto Barnes para el varón (A & C) y hembra (B & D) los ratones de California (mismos grupos que en la figura 6). A y B) de latencia. C y D) Escapar errores . Durante el período de prueba de 7 días, no hubo signi ficativo efectos de la sustancia tóxica o de sexo en el empleo de estrategias de búsqueda para estos animales. Los datos se presentan como la media ± SEM. Adaptado con permiso de Williams et al. 10 Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 12. Latencia para localizar la caja de escape para los hombres y ratas Sprague-Dawley hembras evaluados en los días postnatales 47-51 (1 ensayo / día). El último día (día 5), la jaula de escape fue movido 180 ° de su original ubicación. Las hembras mostraron latencias significativamente más cortos que los hombres y las latencias en los días 2 a 5 fueron significativamente más corta que la latencia en el día 1. Los datos se presentan como la media ± SEM.tp :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51194/51194fig12highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
Los pasos críticos en los procedimientos de prueba de laberinto de Barnes son: 1) proporcionar el buen estímulo aversivo ligeramente para motivar a los animales para localizar la jaula de escape, 2) garantizar condiciones uniformes se mantienen entre los ensayos con animales (por ejemplo, el tiempo de prueba, pruebas de personal, control de ruido externo, y otros estímulos que pueden afectar el rendimiento), 3) si los ensayos son de vídeo grabado, optimizando y asegurando la grabación de vídeo adecuada y presentar una copia de seguridad, y 4) la limpieza del laberinto con etanol al 70% para eliminar señales olfativas entre los ensayos.
La identificación de los mejores estímulos para motivar al sujeto para localizar la caja de escape puede requerir algunas modificaciones y / o reparación. El estímulo típico es brillante sobrecarga de iluminación. Sin embargo, esto puede no ser suficiente para algunas especies. Aunque sólo ha señalado de manera anecdótica por nosotros, las ratas que han sido ampliamente evaluados comportamiento (y por lo tanto, ampliamente manejados) parecen menos motivados bajo el estándar Barnes laberinto condiciones, probablemente debido a que se vuelven más dóciles y habituado a diversos aparatos y / o ambientes. Los estímulos auditivos (sonidos de ejemplo depredador) pueden ser considerados, pero esto limita la capacidad de habituarse a la vez otros animales a la sala de pruebas. Otros estímulos que se han utilizado con éxito incluyen ventiladores de techo para dirigir el aire en la parte superior 57,58 laberinto o modificar el Barnes laberinto ser apetitivo, en lugar de 56 aversivo.
Extra-laberinto señales visuales son la norma para las pruebas de laberinto Barnes con ratas. En las especies más comunes del ratón de laboratorio, se ha sugerido que las señales extra-laberinto pueden producir mejores resultados que las señales intra-laberinto 59,60. Sin embargo, los ratones de los ciervos pueden utilizar con éxito las señales intra-laberinto para localizar la caja de escape y no convertir con éxito durante el período de pruebas con el uso del 8,9 estrategia de búsqueda directa. Por otra parte, una pared externa evita que los animales caigan o saltar desde el laberinto. Como los ratones de California son más fáciles de manejar y de aproximadamente 2 a 3 veces más grande que el ratón ciervo, otros han probado con éxito esta especie en el Barnes laberinto sin el uso de una pared de 40,61. Sin embargo, el laberinto en ese caso era más pequeña (65 cm de diámetro) con 16 agujeros que fueron colocados más hacia el interior (1.3 cm).
Metodológicamente, hay pequeños detalles que podrían afectar el procedimiento de laberinto Barnes and intrepretation de los resultados. La parte superior del laberinto para los roedores es relativamente grande y la sala de prueba debe ser lo suficientemente grande como para permitir que el probador se mueva libremente por el laberinto. Colocando el laberinto en un rincón, no se recomienda que el comprobador debe ser capaz de moverse alrededor del perímetro para recuperar la rata y colocar la jaula de escape en el lugar apropiado. Los niveles de ansiedad de los roedores, como lo demuestra el aumento de la concentración de corticosterona en plasma de 44 años, se elevan durante las pruebas y estímulos extraños podrían exacerbar. Los roedores típicamente se congelan a estímulos auditivos súbitosy por lo tanto, es importante que el entorno de prueba no se encuentra en la zona ruidosa. Debido a que esto puede ser una larga evaluación en un día determinado y en día, puede ser un reto para el probador de permanecer atentos a la prueba, sin embargo, es esencial la atención directa a la conducta del sujeto. Por esta razón y para evitar los efectos circadianos en el rendimiento, es óptimo para probar un número limitado de animales para una ventana de selección de tiempo (por ejemplo, por la mañana o por la tarde) en un día determinado. Finalmente, el olor de etanol puede ser aversivo para el sujeto, aunque esto no ha sido probado de forma explícita. Varias jaulas de escape y doble fondo adicionales se sugiere para que las jaulas tengan tiempo de secarse al aire después de ser rociado con etanol.
Las principales ventajas de la laberinto Barnes son su facilidad de uso en relación con otros tipos de laberinto y los criterios de valoración adicionales que se pueden obtener que pueden proporcionar una evaluación más completa de impairm inducida experimentalmentedres. Además, este laberinto de la tierra seca puede recapitular mejor el medio natural para roedores tierra-vivienda. El período de prueba de varios días podría proporcionar evidencia más robusta de prestaciones alteradas, como se evidencia por la latencia, tasa de error, y la conversión en el transcurso de la prueba de una estrategia de búsqueda ineficiente (al azar o en serie) a una estrategia de búsqueda directa.
Los resultados del laberinto Barnes se pueden verificar con otras pruebas de la navegación espacial. Además, es importante establecer que los déficits de rendimiento potenciales laberinto Barnes no son el resultado de alteraciones en la ansiedad, la actividad, o las habilidades motoras. Por lo tanto, los resultados de la ansiedad y / o evaluaciones del aparato locomotor, como el laberinto elevado en cruz o el comportamiento en campo abierto, podrán determinar si Barnes laberinto deficiencias reflejan verdaderas alteraciones en la navegación espacial. Sin embargo, pruebas murinos comunes de la ansiedad no pueden siempre ser predictivo de desempeño en el laberinto de Barnes 44. Si verdaderas alteraciones de navegación espaciales están presentes, momolecular, los cambios histopatológicos, electrofisiológicos o sinaptogénica podrían ponerse de manifiesto en el hipocampo, la corteza entorrinal, u otras áreas de la corteza, ya que esas regiones del cerebro parecen gobernar este aprendizaje y la memoria de respuesta 62-64.
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Disclosures
Este documento ha sido revisada de acuerdo con la política de Estados Unidos Food and Drug Administration (FDA) y aprobado para su publicación. La aprobación no significa que el contenido refleja necesariamente la posición u opinión de la FDA ni la mención de nombres comerciales o productos comerciales constituye aprobación o recomendación para su uso. Los resultados y conclusiones de este informe son las de los autores y no representan necesariamente la opinión de la FDA. Los autores no tienen intereses y nada que revelar la competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Sr. Eldin Jašarević, el Sr. Scott Williams, el Sr. Roger W. Meissen, Sarah A. Johnson, el Dr. R. Michael Roberts, el Dr. Mark R. Ellersieck, y el Dr. David C. Geary en la Universidad de Missouri, y el Sr. C. Ley Delbert y el personal de cuidado de los animales en el Centro Nacional para la Investigación Toxicológica / FDA. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH Desafío a Grant a la RSE (RC1 ES018195), una ventaja de Grant Mizzou a (RSE y DCG), de la Universidad de Missouri de la universidad de la concesión de la facultad de Medicina Veterinaria (RSE) y E7318 protocolo en el Centro Nacional para la Investigación Toxicológica / FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOTE: Those items that are for small rodents only are bolded. Those items that are for large rodents only are italicized. Items neither bolded nor italicized are for both. | |||
| Barnes Maze platform with 12 or 20 escape holes every 30°. For rats, each hole is 10.5 cm in diameter and 4 cm from the maze top edge. For use with automated tracking programs, a black top for white rodents or a white top for pigmented rodents is needed. For mice and rats, this circular top is 95 and 122 cm in diameter, respectively. | US Plastics Corp, Lima, OH | 42625 | This is the top of the Barnes Maze and the surface that the rodent is placed upon. It can be constructed from a variety of materials (e.g., Plexiglas), but for endocrine disruptor work, polypropylene BPA-free material is optimal. One of the holes leads to the an escape cage; all other holes are blind-ending or false-bottomed. For the rat maze, small slides on the underside of the maze platform allow the escape cage and false bottoms to slide in. |
| 2 in Polypropylene pipe plug (24) 2 in 90° Black polypropylene elbow (12) 2 in x 6 in Polypropylene pipe nipple (1) |
US Plastics Corp, Lima, OH | 30724 32086 30712 |
These are only necessary for the small rodent (e.g. mouse) Barnes Maze. These adaptations are either blind-ending tubes/elbows or one of the tubes is connected to the pipe nipple that then leads to the escape cage. |
| False bottoms for rat Barnes Maze | These were custom made of ABS plastic and vacuum molded for the rat maze apparatus. | ||
| Circular aluminum wall/barrier (50 cm high) around the maze | Ace Hardware, Columbia, MO | In the case of small rodents (e.g., mice), this barrier prevents them from falling off the maze; the rat apparatus generally does not require this. The wall may not be needed for laboratory mice that are relatively tame. | |
| Support stand for maze platform top | US Plastics Corp, Lima, OH | 42625 | The stand supports the maze platform top such that it is elevated above the floor (typically, 70-100 cm) to motivate the rodent to locate the escape cage. The stand can be constructed of any material. |
| White noise | SleepMate Sound Conditioner, Marpac, Rocky Point, NC |
980A | Background noise may be used to block out peripheral acoustic cues that may confound Barnes Maze testing across trials and animals |
| Light fixtures and 300-500 W bulbs encased in aluminum shells. For example, Utilitech 500 W halogen portable work lights. | Ace Hardware or Lowes | Bright lights provide a mildly aversive stimulus which motivate the rodent to locate the escape cage. The lights are generally suspended ~150 cm above the maze top. | |
| Escape cage. For small rodents, this can be a polypropylene cage (27.8 cm x 7.5 cm x 13 cm). | Ancare, Bellmore, NY | N40 PP | The rat escape cage here was custom built and has a ramp leading into the escape cage. |
| Opaque tube (rats only) (27 cm diameter; 23 cm height) with a piece of thick cardboard to cover the top. | The tube is placed in the center of the maze and the rat is placed into the tube from the top which is covered with the cardboard. A handle on the outside of the tube allows easier lifting of the tube, which then begins the trial. The tube can be constructed of any material, but should be opaque. | ||
| High resolution video camera (e.g., Panasonic Digital Video Camera) | Panasonic, Secaucus, NJ | ICV19458 | The video camera is positioned overhead and records trials for later analysis. |
| Extra- or intra-maze geometric cues made of high quality cardboard construction paper | any office supply store, such as Staples | These visual cues orient the animal within the maze environment, providing cues as to the spatial location of the escape cage; in rats, extra-maze cues on the walls work well, whereas in small rodents that require a wall around the maze, intra-maze cues must be used. | |
| Black curtain to surround the maze (small rodents only) | any fabric and crafts store, such as Jo-Ann Fabrics | A black curtain is used in small rodents (especially wild species, e.g. Peromyscus) to maintain attention within the maze confines. | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | After each trial, the maze top and escape cage are cleaned to eliminate potential odor cues for consecutively tested rodents. |
| Tracking software program, such as Ethovision, and computer with appropriate video card and substantial (1 TB or more) hard-drive space. Alternatively, videos can be recorded directly to the computer for later analysis using a program such as Win TV (Hauppauge Computer Works, Inc.). | Noldus (Leesburg, VA) | Tracking software is required to analyze trials for latency to locate the escape cage, velocity, distance traveled, time spent resting, time spent moving, time spent in the correct versus incorrect quadrants, time spent around the escape hole, number of errors or entries into incorrect holes, and overall search strategy employed to find the escape cage. | |
| External hard drives, such as Seagate or WD, with a minimum 1-2 TB of memory | Any office supply store, such as Staples. | Videorecordings should be backed up in at least one separate location. | |
| Videorecording program, e.g. WinTV program | Hauppauge Computer Works, Inc., Hauppauge, NY |
If tracking software is not available at the time of the testing, the trials should be video-recorded for later analysis |
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