Visualisering af G3BP Stress Granulat Dynamics i Live primære celler

Summary

Stress granulat (SGS) er cytoplasmatiske RNA granulater indeholdende gået i stå ribonucleoprotein partikler (RNP'er) og vigtige i cellulære reaktion på forskellige påvirkninger. Dynamics SGS kan følges i levende celler ved at visualisere lokaliseringen af ​​et kodet element i SGS i transficerede primære celler efter stress.

Abstract

Strain gauges kan visualiseres i cellerne ved immunfarvning af specifikke protein komponenter eller polyA +-mRNA'er. Strain gauges er meget dynamisk og undersøgelse af deres samling og skæbne er vigtigt at forstå den cellulære reaktion på stress. Den mangel i nøglefaktorer SGS som G3BP (RasGAP SH3 domæne protein) medfører udviklingsmæssige defekter i mus og ændringer af det centrale nervesystem. At studere dynamikken i SGs i celler fra en organisme, én kultur primære celler kan og følg lokaliseringen af ​​en transficeret mærkede komponent i SGS. Vi beskriver time-lapse eksperiment for at observere G3BP1-holdige SGs i Mouse embryofibroblaster (MEF). Denne teknik kan også anvendes til at studere G3BP indeholdende strain gauges i levende neuroner, hvilket er afgørende, da det for nylig blev vist, at disse strain gauges er dannet ved påbegyndelsen af ​​neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers sygdom. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til ethvert andet cellulært legeme og granula protein komponent og udførtemed transgene dyr, så levende undersøgelse af granulater dynamik for eksempel i fravær af en specifik faktor af disse granulat.

Introduction

Stress granulat (SGS) er ikke-membranøs cytoplasmatisk foci dannet som et cellulært beskyttende respons til miljømæssig stress, såsom høj temperatur, oxidativt stress, hypoxi, osmotisk chok, UV-bestråling, glucosemangel eller virusinfektion ^1. De kan induceres kemisk ved behandling med forbindelser som natriumarsenit, som udløser oxidativ stress. SGs ophobes gået i stå oversættelse anholdt messenger ribonukleoprotein (mRNPs) komplekser ^2, kompleksdannere mRNAs fra den translationelle maskineri, og deres samling kan udløses af fosforylering af eIF2α (eukaryot indvielse faktor 2 α). SGs er dynamiske strukturer, der udveksler komponenter med polysomerne og andre granulater ligesom P-organer. De udgør et "triage center", hvor mRNAs sorteres og bearbejdes enten oversættelse, reinitiering, nedbrydning eller emballagen til stabile ikke-polysomalt mRNPs ^3. Samlingen af ​​SGs er hurtig but det er en gradvis proces med indledende talrige små aggregater, som flyder sammen i større granulat. Brugen af ​​kemiske inhibitorer, der forstyrrer eller stabiliserer mikrotubuli viser, at mikrotubulære netværk er nødvendig for SG dynamik herunder montering, sammensmeltning og adskillelse processer.

Den dynamiske samling af strain gauges fremmes også ved sammenlægning af specifikke RNA-bindende proteiner (RNA-BP) som TIA-1 (T-celle indre antigen-1) og TIAR (TIA-1-relateret protein), som er i stand til at dimerisere og fremme polysom ​​afmontering og routing af mRNAs i SGs ^4.. G3BP (RasGAP SH3 domæne bindende protein) er sådan en RNA-BP som lokaliseres til SGs når cellerne er stressede med arsenit eller høj temperatur, og overekspression af dephosphorylerede G3BP kan fremkalde SGs samling ^5..

G3BP er et evolutionært bevaret RNA-BP, der oprindeligt var karakteriseret gennem sin interaktion med en Ras-GTPase aktiverende protein (RasGAP p120 ^6); men denne interaktion blev for nylig revisited ^7. Den G3BP familie omfatter to medlemmer i pattedyr, G3BP1 (kaldet G3BP) og G3BP2 ^8. Begge proteiner colocalize i SGS, når cellerne udsættes for stress ^9. G3BPs omfatter en N-terminal NTF2 domæne foreslog at påvirke deres lokalisering og oligomerisering, efterfulgt af prolinrige (PxxP) motiver, så C-terminale motiver forbundet med RNA-binding: den kanoniske RNA-genkendelsesmotiv (RRM) med bevarede RNP1 og RNP2 motiver , efterfulgt af en arginin-glycin-rige (RGG) kassen. Interessant analyse af forskellige dele af proteinet ved at konstruere forskellige domæner fusioneret til EGFP viste, at NTF2-lignende domæne og det RNA-bindende domæne var mest effektivt rekrutteret til strain gauges, hvilket tyder på vigtigheden af ​​egenskaberne af dimerisering og RNA bindende samling af strain gauges. Forskellige modeller har afsløret forskellige funktioner G3BP proteiner in vitro ^10-13.Forstyrrelse af G3BP i mus har vist betydningen af dette protein i udviklingspsykologi vækst og overlevelse ^14, samt en vigtig rolle for G3BP i det centrale nervesystem (CNS), kendetegnet ved ataksi og mangler i rumlig arbejdshukommelse ^15. G3BP mangel fører til ændret neuronal plasticitet og calcium homeostase, etablere en direkte forbindelse mellem SG dannelse og neurodegenerative sygdomme ^15. Det er derfor vigtigt at være i stand til at studere dynamikken i SGS i primære celler som neuroner.

Denne protokol giver en enkel måde at observere samling af G3BP1-holdige SGs i primære celler under arsenit behandling. Det kan bruges til at studere strain gauges samling under forskellige betingelser, for eksempel forskellige typer af belastninger. Det kan også tilpasses andre granulater eller andre bestanddele i SGS. Ja, denne protokol fokuserer på G3BP1, men der er andre stress granulat markører som TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) ^2,FMRP (fragilt X mental retardering syndrom protein) ^16, TDP-43 (transactive svar DNA bindende protein 43) ¹⁷ eller Staufen ^18. Især proteiner som TIA-1 / R er ligesom G3BP, kernedannende RNA-bindende proteiner, der kan fremkalde SGs samling når overudtrykt, selv om de forskellige dannede generalsekretærerne kan variere i funktion, regulering og tilhørende udskrifter. Transfektion af fluoroforen-mærket version af nogen af ​​disse centrale komponenter eller kimdannelsesmidler SGS kan udføres for at billedet bestemt strain gauges montage og dynamik.

Protocol

Alle dyreforsøg i denne protokol er i nøje overensstemmelse med retningslinjerne fra Det Europæiske Fællesskab Rådets direktiv af 24. november 1986 (86-609/EEC). Hus musene i gruppe, hvilket giver mad og vand ad libitum. Bevar dem i et kontrolleret miljø (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% fugtighed) med en 12 hr: 12 timers lys: mørke cyklus (lys på kl 7:00).

1. Kultur murine Primære Celler:. Mouse embryofibroblaster (MEF)

1. Autoklave tynde pincet, samt buede pincet og dissekere saks. Opbevares i en steril beholder. Anvend steril D-PBS (Dulbeccos phosphatbufret saltvand). Klargør hele MEF medium: Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) / F12 suppleret med 10% føtalt kalveserum (FBS), 1 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 0,5 mM 2-mercaptoethanol og varme ved 37 ° C.
2. Aflive en gravid mus (13.5 dage efter coitum (DPC)) Ved cervikal dislokation. Fjern Uterushornene fra musen desinficeret med 90% EtOH. Under en steril og ren hætte, anbringe hornene med embryonerne i 37 ° C forvarmet D-PBS. Åbn horn, sted embryoner i en 100 mm steril plastik petriskål, rense dem op fra navlestrengen materiale og vask dem med varmt D-PBS for at fjerne blod overskud. Under en kikkert, fjerne fosterets lemmer, de indre organer og den øverste del af hovedet, der indeholder hjernen.
3. I en ny petriskål, mos embryoner i meget små stykker med en steril kirurgisk klinge eller saks (mindst 1 min.) I tilfælde af embryoner af forskellige genotyper, være omhyggelig med at sætte hver foster i individuelle petriskåle og holde halen eller den øverste chef for genotypebestemmelse.
4. Dæk embryo med 1x trypsin-EDTA (0,25% trypsin, 1 mM EDTA). Inkuber i 30 minutter til 1 time i en 37 ° C inkubator. Der tilsættes 10 ml kompletMEF'er medium at stoppe trypsin reaktion. Pipette op og ned for at fjerne alle aggregater. Lad sidde cellesuspensionen i et 50 ml rør (fyldt med komplet medium) i 10 minutter og centrifugeres supernatanten i 5 minutter ved 300 xg ved stuetemperatur. Pellet resuspenderes i komplet medium (6 ml til 1 embryo). Levedygtige kerneceller kan tælles ved hjælp af trypan blå (Ca. 5 x 10 ⁶ celler kan forventes fra et foster). Plate 3 ml per 60 mm petriskål.
5. Skift mediet den næste dag og lade cellerne vokse indtil retterne er sammenflydende. Mange celletyper kan ses, men kun fibroblaster overlever subkultur.
6. Split cellerne og give dem mulighed for at vokse i 35 mm skåle med glasbund (vigtigt for tidsforskydningen eksperiment), indtil 50-70% sammenflydning for transfektion. Test for Mycoplasma og mus patogener.

2.. Culture Adaptations i tilfælde af neuroner

1. Dagen før kultur, frakke 35 mm glasbund petriskåle med poly-L-lysin (200 pi 0,1 mg / ml) under en steril og rent hætte, og lad natten.
2. Den næste morgen, skylles med sterilt rent vand, to gange i 5 minutter og en gang i 45 minutter til 1 time. Erstat med 2 ml DMEM plus 10% FBS medium og holde i et 37 ° C inkubator.
3. Dissekere embryoner på 18,5 DPC. Under en steril og ren hætte, anbringe hornene med embryonerne i koldt steril HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) i 100 mm petriskål. Neonatale hvalpe kan også anvendes i stedet for embryoner for at bevare levetiden af ​​dæmningen og gør det muligt at producere mere afkom, især i tilfælde af transgene dyr, som kan være vanskeligt at opnå. I individuelle petriskåle, tage hver foster eller nyfødte og skære hovedet med en saks. Hold hovedet ved at indsætte buet pincet i øjnene, skære huden og forsigtigt åbne den bløde kraniet fra bagsidenaf hovedet indtil øjnene, på hver side af hovedet. Skær de optiske nerver og hjernestammen, fjerne hjernen, og sætte det i en ny petriskål indeholdende HBSS. Under en stereoskop, fjerne alle meninges bruger to tynde pincet. Adskil hippocampi, cortex eller enhver anden del af hjernen afhængig af strukturen for at studere.
4. Fordyb det dissekerede hjernens struktur i 4,5 ml kold HBSS forberedt tidligere i 15 ml rør og holde på is, indtil fordøjelse med trypsin. Tilsæt 0,5 ml 2,5% trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 15 min til 20 min. Skyl trypsin 3x med HBSS, være yderst omhyggelig med ikke at kassere de fordøjet hjerne dele.
5. Resuspender i 500 pi (hippocampi) til 1 ml (cortex) DMEM plus 10% FBS og pipette op og ned adskillige gange med en 1 ml mikropipette udstyret med en 1 ml tip, så udstyret med 1 ml plus 200 tips ul, indtil der er ingen synlig aggregat.
6. Fordel 100-200 ml cellesuspension til hver 35 mm glas bottom skål indeholdende DMEM plus 10% FBS og lad neuroner klæbe ved 37 ° C i mindst 3 timer. Erstattes af forvarmet neuron komplet medium (Neurobasal medium suppleret med 250 uM L-glutamin og NS21, fremstillet som beskrevet i Chen et al. ¹⁹⁾ og henstår ved 37 ° C for at tillade neuronal vækst. Transfektion neuronerne på 5 til 14 dage in vitro (div) (effektiviteten af transfektion er højere efter et par div men synaptiske forbindelser er bedre etableret fra 7-10 div).

3.. Transfektion af EGFP-G3BP1 Construct

Transfektion af cellerne med en vektor indeholdende cDNA'et af din protein af interesse (en komponent af strain gauges) fusioneret til en fluorescerende markør (GFP, YFP, etc.), ved anvendelse af 3 ug af oprensede plasmid per 35 mm skål.

1. Transficere MEF'er anvendelse af en kommerciel fremgangsmåde ved at følge fabrikantens protokol (se tabel Materialer / Reagenser).
2. Transficere neuroner med calciumfosfat metode tilpasset fra Xia m.fl. ²⁰ kortvarigt.:
   1. Forbered løsninger: DMEM-wash: DMEM indeholdende 25 mM KCI; transfektionsopløsning: DMEM vask indeholdende 1x DMKY (HEPES 5 mM, _MgCl2 10 mM, phenolrødt); og chok løsning: HeBS 1x, DMKY 1x, og DMSO 2% (v / v); og holde dem ved 37 ° C.
   2. Fjern medier fra neuroner, filtrat, og holde det ved 37 ° C. Vask med DMEM-vask derefter erstatte med transfektion medium og holde ved 37 ° C under udarbejdelsen af ​​calciumphosphat-plasmid-DNA bundfald.
   3. I et 1,5 ml mikrocentrifugerør, tilføje (i denne rækkefølge) Braun vand (endelig volumen 50 ul), 5 pi _CaCl2 2,5 M, og 3 ug plasmid DNA. Drop denne blanding på 50 pi HeBS 2x allerede har indført i et rundt rør bund polypropylen. Bland røret ved rotation sammen med nedkastningen. Lad bundfaldet formularen ved stuetemperatur i 30 minutter.
   4. Tilsæt precipitate dråbevis på neuroner og henstår ved 37 ° C i 30 til 50 min.
   5. Erstat med chok løsning for 1 min, derefter skylles med DMEM-vask og endelig genindføre prækonditionerede medium. Hold cellerne ved 37 ° C.

4.. Visualisering af G3BP Indeholder SGs forsamling og Dynamics

1. Udskift mediet af cellerne, som indeholder phenolrødt af phenolrødt-frit medium.
2. Brug en konfokal mikroskop udstyret med fluorescens for erhvervelserne. Tænd mikroskopsystemer: kviksølv lampe, computer og lasere. Varm op i kammeret til 37 ° C i mindst 20 min før starten af ​​opkøb.
3. De over udtryk G3BP inducerer den spontane dannelse af en type strain gauges. Cellerne kan således observeres for montering af strain gauges 24 timer lige efter transfektionen uden stress induktion. Alternativt kan stress være tilskyndet til yderligere at inducere samling af strain gauges. Tilsæt 0,5 mM natriumarsenit og stjernet købet lige efter tilsætningen af ​​forbindelsen (granulatet være velformede inden for 1 time).
4. Tilsæt olie til immersionsobjektivet (brug 40X eller 63x-målene) og installere petriskålen over mål i tilpasset 35 mm mikroskop holder, stabiliseret på indehaveren scenen. Kontroller, at fadet er flad ellers opkøbene vil blive ændret. Tænd fluorescenslys ifølge den relevante fluorofor og visualisere transficerede celler. Sluk fluorescens, når en celle af interesse er inden for området med henblik på at minimere blegning og cytotoksicitet.
5. I fanebladet "erhverve", vælg laserne afhængigt excitationsbølgelængde på tag fluorophoren (488 nm i vores protokol, der bruger EGFP-mærket G3BP), og vælg den tilpassede længde til PMT emission (fotoforstærkerrør). Juster lasereffekten (sædvanligvis ikke mere end 10%) for at minimere støj og overmætning samt toksicitet og indstille forstærkningen og offset at ændre signal-støj-forholdet.Scan hurtigt (1,000 Hz) for at minimere varigheden af ​​laser redegørelsen (line average 2, frame gennemsnit 1). Hvis det ønskes, skal du indstille parametrene for Z stakken for at være i stand til at rekonstruere billedet i 3D (en Z trin på 1 mM er normalt fint med celler). Bestem tidsintervallet mellem hvert køb: mindre intervaller tillader at opnå en mere sammenhængende film, men dette kan fremkalde fotoblegning og toksicitet (et interval på 20 sek blev anvendt i de beskrevne eksperimenter). Varighed af samlet køb kan variere afhængigt af stress-typen. Mange G3BP-holdige SGs dannes meget hurtigt under arsenit behandling og er godt synlige efter 1 time af behandling: i dette tilfælde, skal du vælge hurtigt cellerne til at filme og starte opkøb lige efter stress, med en samlet varighed på opkøb af 15 - 20 min store nok til at observere samling af flere strain gauges.
6. Gem billederne og rekonstruere de stakke og film ved hjælp ImageJ software.

Representative Results

Stress granula dannelse er vigtig i respons af celler på stress, tillader en cellulær tilpasning ved blokeret oversættelse, indtil stress er ryddet, associeret med forebyggelse af apoptose. Dette assay tilladelser til at studere SGS i primære celler, ved at følge lokalisering af centrale Sgs proteinkomponenter (Figur 1). G3BP en nøglefaktor i SGS samling, er til stede i stedet diffusivt i cytoplasmaet af dyrkede MEF'er eller neuroner (figur 2A a og c), og er klart til stede i diskrete granuler under arsenit behandling MEF'er samt neuroner (figur 2A b og d). Primære celler kan opnås fra transgene musemodeller, hvorved for eksempel undersøgelse af stress granulat i fravær af en af ​​deres komponenter. Interessant, mangel på G3BP1 i mus fører til alvorlige fejl i det centrale nervesystem, især en ataxic phenotype karakteriseret ved manglende evne til korrekt koordinere bevægelser (som set i et lem Lukning test, figur 2B) og en ændring af rumlig arbejdshukommelse. G3BP1 er til stede i stress granulat i neuroner, og det er så meget mere interessant, at generalsekretærerne har vist sig at danne ved påbegyndelsen af ​​neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom.

Denne analyse (figur 1), hvilket tillader at studere SGs i primærelementer, uundværlige for at studere deres sammensætning og montage in vivo. Endvidere tillader undersøgelse af levende celler, og kan således anvendes til at følge dynamikken i SGS, ved at visualisere en eller flere af deres overudtrykte komponenter i realtid. Figur 3 viser repræsentative time-lapse billeder tillader at følge montering og dynamik G3BP1 indeholdende strain gauges i MEF'er efter arsenit behandling. 4A er det samme forsøg udført med murine hippocampale neuroner i culture. EGFP-G3BP1 lokalisering går fra store subcellulære kornede strukturer til mere definerede og mindre granulater, SGS, efter arsenit behandling. SGs var mere og mere defineret, hvis opkøbene blev fortsat (ikke vist), men cellemorfologien begyndte at ændre sig, sandsynligvis på grund af varmen og toksicitet fremkaldt af laser excitation.

Tid bortfalder tillader registrering af en video til direkte observere SGS dynamik. Endvidere er anvendelsen af et konfokalt mikroskop tillader at rekonstruere et billede i Z-stakken og således følge helt dynamikken i organer i hele cellen i 3 dimensioner (som illustreret for en neuron på et bestemt tidspunkt i figur 4B).

Figur 1.. Beskrivende for de vigtigste trin i protokollen. Primære celler dyrkesfra embryoner (18,5 dpc (dage efter coitum) (eller neonatale hvalpe) for neuroner (a), 13,5 DPC for MEF'er (b)). Efter transfektion af et plasmid indeholdende EGFP-G3BP1 cDNA celler stresset og afbildes med laserscanning konfokal mikroskop. Dynamikken i G3BP1-holdige SGs overholdes. Neuroner er visualiseret ved MAP2 (mikrotubuli-associeret protein 2) farvning i (a), MEF'er efter G3BP1 farvning i (b). De er givet som illustrative billeder, samt EGFP-G3BP1 transficerede murine neuron (c) og fibroblast (d), som er uafhængige billeder, og ikke svarer til de celler, der er angivet i (a) og (b).

Figur 2. (A). G3BP lokalisering i dyrkede MEF'er og hippocampusneuroner, ubehandlet eller stresset med natriumarsenit. G3BP hovedsagelig cytoplasmatisk, med en diffus farvning i MEF'er (A) eller i store kornede strukturer i soma af neuroner (c), når cellerne ikke er stresset. Efter 1 time af natriumarsenit behandling, bliver G3BP lokaliseret i diskrete cytoplasmatiske granulat (MEF, b og neuroner, d). Her blev cellerne fikseret og immunfarvet med et anti-G3BP1 antistof. MAP2 farvningsteknikker tilladelser til at identificere neuroner i c) og d). DNA blev counter-farvet i blåt med Hoechst. Skala søjler repræsenterer 2 um (a og b) og 10 um (c og d), (B).. Når løftet af halen mod gulvet (lem-slår test), WT mus udvide deres ben (venstre), mens G3BP1 KO mus viser en unormal pote-knugede refleks tæt på en flagermus-lignende positur. Klik her for at se en større version af dette tal.

fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3.. Efterfølgende opkøb i time-lapse eksperiment opnået med MEF'er transficeret med EGFP-G3BP1, ved hjælp af et Leica SP5 laserscanning konfokal mikroskop (excitation ved en bølgelængde på 488 nm). Erhvervelser blev startet 10 minutter efter tilsætning af natriumarsenit, og opnået i løbet af 10 min med intervaller på 20 sek. Seks repræsentative billeder er givet, med t tiden i sekunder efter tilsætning af natriumarsenit (0,5 mM). Pilene viser to områder, hvor vi kan se samlingen af ​​strain gauges. Scale bar = 2 um.

Fig. 4. (A). Skiftende opkøb i time-lapse eksperiment opnået med murine hippocampus neuroner transficeret med EGFP-G3BP1, ved hjælp af et Leica SP5 laserscanning konfokal mikroskop (excitationved en bølgelængde på 488 nm). Erhvervelser blev startet 5 minutter efter tilsætning af natriumarsenit, og opnået i løbet af 40 min med intervaller på 20 sek. Seks repræsentative billeder er givet, med t tiden i sekunder efter tilsætning af natriumarsenit (0,5 mM). Pilene viser to områder, hvor vi kan se samlingen af ​​strain gauges. Målestokken repræsenterer 5 um d:. Dendrite; a: Axon. (B). 3-dimension rekonstruktion fra Z stak (5 akkvisitioner i Z-aksen end i alt 10 um) af et neuron transficeret med EGFP-G3BP1 og behandlet med natriumarsenit n:. Neurite (dendritceller eller Axon). Klik her for at se et større version af denne figur.

Discussion

De mest kritiske trin i protokollen, vedrører transfektion og mere især opkøb tid lapse, som skal overvåges nøje med henblik på at sænke ned cytotoksicitet.

Kultur i primære celler er ikke en vanskelig del, så længe sterile forhold opretholdes og forsigtighed er taget for at undgå skader under dissektion og celledissociering trin. MEF'er kan holdes frossen på tidlige passager. Neuron transfektion med calciumphosphat har vist sig at fungere godt ²¹ og denne protokol tilpasset fra Xia et al. ^20. muliggør godt niveau af transfektion, men det kan fremkalde en vis celledød. Det er vigtigt at transficere neuroner inden for et par dage efter kultur, til at kontrollere pH af opløsningerne og overvåge inkubation af neuroner med calciumphosphat-plasmid bundfald, som ikke bør overstige 1 time. Kontroller under et lysmikroskop og fjern transfection medium, hvis aggregater overholdes. Antallet af vask med DMEM kan forøges.

Overekspression af nogle SGS proteinkomponenter fører til spontan samling af granulat, som synes at involvere oligomerisering og RNA-bindende egenskaber af disse proteiner, som i tilfælde af TIA-1 / R ⁴ eller G3BP ^5. Derfor er det vigtigt at definere det tidspunkt, hvor du kan starte tidsforskydningen opkøb. Et par strain gauges er synlige, så snart 24 timer efter EGFP-G3BP transfektion, når proteinet udtrykkes. Men inducerer en ekstra stress fører til dannelsen af yderligere granulat, som kan variere som forskellige former for SGs med forskellige nøglekomponenter er blevet identificeret under forskellige belastninger ^1,22,23. Montering af strain gauges er hurtig i levende celler (så hurtigt som 10-20 min), og mange granulat er fuldstændig dannet inden 1 time af arsenit behandling, er det derfor vigtigt at starte opkøb snarest muligt agteris induktion af stress, hvis samlingen skal undersøges. På senere stadier kan dog dynamikken i SGs også blive undersøgt, da små korn kan smelte sammen i større strukturer, og disse strukturer er ikke faste: deres komponenter kan udveksles med cytoplasmaet eller andre former granulat ligesom P-organer, sites RNA henfald ^3. Rapid eye-detektering af transficerede celler og hurtig overvågning af opkøb parametre (især X, Y og Z koordinater) tillader at opnå en film, herunder samling af granulat, samt at begrænse fotoblegning og laser-induceret cytotoksicitet, som er den anden afgørende skridt i direkte billedvisning. Ja, i nogle tilfælde, kunne vi observere væsentlige ændringer i celle morfologi og endda død af nogle få celler, hvis opkøbene blev udført i lang tid (mere end 1 time efter induktion af oxidative stress med arsenit behandling). For at undgå disse fænomener er det muligt at fastgøre scanning og til at øge intervallernevarighed mellem hvert køb. Men for at et kortere interval tilladelser bedre følge dynamikken i SGS, der indeholder det visualiserede protein, og for at opnå en mere komplet film. Således bør man tilpasse parametrene hvert forsøg for at opnå den bedste film med begrænset fotoblegning og toksicitet, afhængigt af den primære celletype på granulatet komponent, der følges, og den tilknyttede fluorofor molekyle.

Fluorescerende protein tags er normalt tilstrækkeligt fotostabile skal afbildes for varigheden af ​​eksperimentet. Forskellige fluorescerende proteiner kan fungere godt, så længe de producerer et stærkt signal er langsomme til at blege og ugiftige. Vigtigere er det, bør de være lyst nok for at give signal over autofluorescens af cellerne og således blive pålideligt opdaget. Faktisk kan primære celler inducerer en baggrund signal på grund af autofluorescens af organeller (såsom mitochondrier og lysosomer). Men i vore hænder, autofluorescens varmeget lavt i forhold til lysstyrken af ​​EGFP-G3BP, og det var let at skelne EGFP signal af transfekterede celler versus ikke transfekterede celler. Generelt vil valget af optimale filtre og laserlys intensitetsniveauer være afgørende for at opnå det rigtige signal-til-støj-forhold, der er forbundet til lav toksicitet. Endelig, hvis billeder skal kvantitativt undersøgt, er det vigtigt at være sikker på, at fluorescensintensiteten af ​​proteinet ikke er følsom over for miljømæssige faktorer som komponenter i dyrkningsmediet.

Sgs dynamik kan faktisk sammenlignes (hastighed forsamlingsfrihed, størrelse og antal granulater) mellem forskellige betingelser (celler fra vildtype og knock-out dyr for eksempel). For at få statistisk signifikante resultater, bør man dyrke celler fra mindst tre forskellige dyr af hver genotype eller betingelse (fra tre forskellige kuld) og billed mellem 10 og 50 celler i hver uafhængigt forsøg. Det er muligt at markere flere positioneri opkøb software og dermed til billede flere transficerede celler på samme tid, som tillader at øge de opnåede data i en forholdsvis kort tid. Imaging flere celler samtidigt er interessant, da det vil være vanskeligt at yderligere bruge den samme petriskål, når cellerne er stressede og filmede (i tilfælde, hvor samlingen af ​​SGS studeret, eller hvis de eksperimentelle betingelser i lange opkøb fremkalde cytotoksicitet). Men når der kvantificerer parametrene "nummer" og "størrelse" SGS - og for at øge antallet af celler, filmede til at opnå mere statistisk relevans (mere end 50 celler i hver enkelt) - celler kan fastsættes efter arsenit behandling, så at flere celler på samme petriskålen kan studeres. Videoer vil stadig blive brugt som kvalitative resultater i denne sag.

Protokollen beskrevet her tillader at studere G3BP-holdige SGs i ubearbejdet levende celler, og kan tilpasses til andre cellulære organer og andre protein components af disse organer (som TIA-1 / R for SGS, FRMP og Staufen for SGs og neuronale transport granulat). Anvendelsen af ​​primære celler er særligt interessant i forbindelse med fysiologiske studier, der involverer for eksempel transgene dyr. Faktisk G3BP1 KO-mus afslører for eksempel afgørende funktion SGs faktor i overlevelse og udvikling af en organisme, samt i CNS fungerer ^14,15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Gibco	21331	Prewarm at 37 °C
Sodium pyruvate	Gibco	11360
Nonessential amino acids	Gibco	11140
L-Glutamine	Gibco	25030
Trypsin	Gibco	15096
Glass bottom B-35	Greiner	627860/627861	Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	Prewarm at 37 °C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	Prewarm at 37 °C
2-mercaptoethanol	Gibco	31350
Forceps	Biotek	DU-110-A	Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)
Curved forceps	Biotek	P-110-BUF	Very thin, tips 0.1 mm
Small scissors	Biotek	CM-85-BS	Can be useful to remove hippocampi
Polyplus transfection JetPEI reagent	Ozyme	101-10	MEFs transfection, follow the forward protocol
Inverted laser scanning confocal microscope	Leica	SP5