Summary
Grânulos de estresse (SGs) são grânulos de RNA citoplasmático contendo partículas paralisadas ribonucleoproteínas (RNPs), e importante na resposta celular a várias tensões. Dinâmica da SGS pode ser seguido em células vivas, visualizando a localização de um componente marcado da SGS em células primárias transfectadas após o estresse.
Abstract
A SGS pode ser visualizada nas células por imunocoloração de componentes protéicos específicos ou poli + mRNAs. SG são altamente dinâmico e o estudo da sua montagem e o destino é importante entender a resposta celular ao stress. A deficiência em fatores-chave da SGS como G3BP (RasGAP SH3 domínio Binding Protein) leva a defeitos de desenvolvimento em ratos e alterações do Sistema Nervoso Central. Para estudar a dinâmica da SGS em células de um organismo, pode-se pilhas de cultura e seguir a localização de um componente marcado transfectadas da SGS. Descrevemos experiência de lapso de tempo para observar contendo G3BP1 SGS em rato embrionárias fibroblastos (MEFs). Esta técnica também pode ser usada para estudar SGs contendo G3BP em neurónios vivos, o que é fundamental, uma vez que foi demonstrado recentemente que estes SG são formadas no aparecimento de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Esta abordagem pode ser adaptada a qualquer outro componente do corpo celular e de proteína de grânulo, e realizadacom animais transgénicos, que permite o estudo directo de grânulos, por exemplo, a dinâmica na ausência de um factor específico destes grânulos.
Introduction
Grânulos de estresse (SGs) são focos citoplasmática não-membranoso formado como uma resposta protetora celular ao estresse ambiental, tais como temperatura elevada, estresse oxidativo, hipóxia, choque osmótico, a irradiação UV, a privação de glicose, ou infecção viral 1. Eles podem ser quimicamente induzida por tratamento com compostos como o arsenito de sódio, o que desencadeia o stress oxidativo. SG acumular tradução preso parado mensageiro ribonucleoprotein (mRNPs) complexos 2, sequestrando mRNAs da maquinaria de tradução, e sua montagem pode ser desencadeada pela fosforilação de eIF2α (fator de iniciação eucariótico 2 α). SG são estruturas dinâmicas que trocar componentes com os polissomos e outros grãos, como os corpos P. Eles constituem um "centro de triagem", onde mRNAs são classificadas e processadas para qualquer tradução, reinício, degradação, ou embalagem em estáveis mRNPs não polissomal 3. A montagem da SGS é rápido but é um processo gradual, com vários pequenos agregados iniciais que se aglutinam em grânulos maiores. O uso de inibidores químicos que perturbam ou estabilizar os microtúbulos mostra que é necessária a rede de microtúbulos para a dinâmica de SG, incluindo os processos de montagem, desmontagem e coalescência.
O conjunto dinâmico de SG é também promovida pela agregação de proteínas de ligação a ARN específicas (RNA-BP) como TIA-1 (células T interna antigénio-1) e TIAR (proteína relacionada com o TIA-1), que são capazes de formar dímeros e promover polysome desmontagem e encaminhamento de mRNAs em SG 4. G3BP (proteína de ligação de domínio SH3 RasGAP) é um tal ARN-PA que se localiza SGs, quando as células são forçadas a arsenito ou a alta temperatura, e a sobre-expressão de G3BP desfosforilado pode induzir GV de montagem 5.
G3BP é um evolutivamente conservada RNA-BP que foi inicialmente caracterizado através de sua interação com uma proteína ativando-Ras GTPase (RasGAP p120 6); mas esta interação foi recentemente revisitou 7. A família G3BP inclui dois membros em mamíferos, G3BP1 (referido como G3BP) e G3BP2 8. Ambas as proteínas colocalize em SGs, quando as células são submetidas a tensão 9. G3BPs compreendem um domínio N-terminal NTf 2 sugeriu a influenciar a sua localização e oligomerização, seguido pela prolina rica (PxxP) motivos, então motivos C-terminal associada com a ligação RNA: o RNA-canônico Recognition Motif (RRM) com conservadas RNP1 e RNP2 motivos , seguido de uma caixa rica arginina-glicina (RGG). Curiosamente, a análise de diferentes partes da proteína através da construção de diferentes domínios fundidos com EGFP mostrou que o domínio NTf2-like e o domínio de ligação a ARN-se o mais eficiente recrutados para SG, sugerindo a importância das propriedades de dimerização e de ligação de ARN em a montagem da SGS. Diversos modelos têm revelado diferentes funções das proteínas G3BP in vitro 10-13.Perturbação de G3BP em ratos mostraram a importância desta proteína no crescimento do desenvolvimento e sobrevivência de 14, bem como um papel importante para G3BP no Sistema Nervoso Central (SNC), caracterizada por ataxia e defeitos em espacial da memória de trabalho 15. Deficiência G3BP leva à alteração neuronal plasticidade e cálcio homeostase, estabelecer uma ligação directa entre a formação SG e doenças neurodegenerativas 15. Assim, é importante ser capaz de estudar a dinâmica da SGS em células primárias, como neurônios.
Este protocolo fornece uma maneira simples de observar a montagem de contendo G3BP1 SGS em células primárias em tratamento arsenito. Ele pode ser utilizado para estudar a montagem SG sob diferentes condições, por exemplo, diferentes tipos de stress. Ele também pode ser adaptado a outros grânulos ou outros componentes de SG. Com efeito, este protocolo incide sobre G3BP1, mas existem outros grânulos de stress como marcadores TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (Fragile X Retardo Mental Síndrome de proteína) 16, (proteína de ligação DNA resposta transacional 43) TDP-43 17 ou 18 Staufen. Em particular, as proteínas como TIA-1 / R são, como G3BP, proteínas de ligação de ARN de nucleação que podem induzir a montagem SGs, quando sobre-expresso, mesmo se os diferentes SGs formadas pode variar em função, regulação e transcritos associados. A transfecção de versão marcou-fluoróforo de qualquer um destes componentes-chave ou nucleadores da SGS pode ser realizada para determinada imagem montagem e dinâmica do GV.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais neste protocolo estão em estrita observância com as diretrizes da Diretiva do Conselho da Comunidade Europeia, de 24 de Novembro de 1986 (86-609/EEC). Casa dos ratos no grupo, permitindo que alimentos e água ad libitum. Mantê-los em um ambiente controlado (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% de umidade), com uma hr 12: 12 luz hr: ciclo escuro (luz às 7:00 am).
1 Cultura de Células Murino preliminares:. Rato embrionárias fibroblastos (MEFs)
- Autoclave fórceps finos, bem como uma pinça curvos e as tesouras de dissecção. Guarde em um recipiente estéril. Use estéril D-PBS (Phosphate-Buffered Saline Dulbecco). Prepare meio MEFs completa: meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 1% de aminoácidos não-essenciais, e 0,5 mM de 2-mercaptoetanol e quente a 37 ° C.
- Euthanize um rato grávidas (em 13,5 dias pós-coitum (DPC)) Por deslocamento cervical. Retire os cornos uterinos do rato higienizado com 90% EtOH. Dentro de uma câmara estéril e limpo, coloque as pontas com os embriões em 37 ° C pré-aquecido D-PBS. Abra a chifres, lugar os embriões em um 100 milímetros estéril de plástico placa de Petri, limpá-los a partir do material do cordão umbilical e lavá-los com água morna D-PBS para remover o excesso de sangue. Sob um binocular, remover membros do embrião, os órgãos internos e a parte superior da cabeça contendo o cérebro.
- Em uma nova placa de Petri, mediu o embriões em pedaços muito pequenos com um cirúrgico estéril lâmina ou tesoura (pelo menos durante 1 minuto). No caso de embriões de diferentes genótipos, ter o cuidado de colocar cada embrião em pratos individuais de Petri e manter a cauda ou a cabeça superior para genotipagem.
- Cobrir o embrião com 1x tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, EDTA 1 mM). Incubar durante 30 min a 1 hora num banho a 37 ° C incubadora. Adicionar 10 ml de completaMédio MEFs para parar reação tripsina. Pipeta cima e para baixo para remover todos os agregados. Deixar repousar a suspensão de células para um tubo de 50 ml (preenchido com meio completo) durante 10 minutos, e centrifugar o sobrenadante, durante 5 min a 300 xg à temperatura ambiente. Ressuspender o sedimento em meio completo (6 ml para um embrião). Células nucleadas viáveis podem ser contadas usando tripan azul (Cerca de 5 x 10 6 células pode ser esperado a partir de um embrião). Placa 3 ml por 60 milímetros placa de Petri.
- Troca da mídia no dia seguinte e permitir que as células cresçam até que os pratos são confluentes. Muitos tipos de células pode ser visto, mas apenas os fibroblastos vão sobreviver subcultura.
- Dividir as células e permitir-lhes crescer em pratos de 35 mm com fundo de vidro (importante para o tempo de experimentação lapso), até 50-70% de confluência para a transfecção. Teste para Mycoplasma e patógenos do mouse.
2. Cultura Adaptations em Caso de Neurônios
- O dia antes da cultura, revestimento 35 milímetros placas de Petri de fundo com poli-L-lisina (200 ul de 0,1 mg / ml) sob um capuz estéril e limpo, e deixar durante a noite.
- Na manhã seguinte, enxaguar com água pura esterilizada, duas vezes durante 5 min e depois durante 45 minutos a 1 hora. Substituir com 2 ml de meio DMEM mais 10% de FBS e manter numa incubadora a 37 ° C.
- Dissecar embriões em 18,5 dpc. Dentro de uma câmara estéril e limpo, coloque as pontas com os embriões em HBSS frio estéril (Solução Salina Balanceada de Hank) em 100 milímetros placa de Petri. Filhotes neonatais também pode ser usado em vez de embriões, a fim de preservar a vida da barragem e que possa produzir mais descendentes, especialmente no caso de animais transgénicos, que pode ser difícil de obter. Em pratos individuais de Petri, tome cada embrião ou recém-nascido e cortou a cabeça com uma tesoura. Segure a cabeça através da inserção de uma pinça curva para os olhos, cortar a pele e cuidadosamente abrir o crânio mole da parte de trásda cabeça, até os olhos, em cada um dos lados da cabeça. Cortar os nervos ópticos e do tronco cerebral, remova o cérebro, e colocá-lo em uma nova placa de Petri contendo HBSS. Sob um estereoscópio, remova todas as meninges utilizando duas pinças finas. Separa-se o hipocampo, no córtex ou qualquer outra parte do cérebro que, dependendo da estrutura de estudar.
- Imergir a estrutura do cérebro dissecado em 4,5 ml de HBSS frio preparado anteriormente em tubos de 15 ml e guardar em gelo até a digestão com tripsina. Adicionar 0,5 ml de 2,5% de tripsina e incubação a 37 ° C durante 15 min a 20 min. Lavar o 3x de tripsina com HBSS, sendo extremamente cuidadoso para não descartar as partes do cérebro digeridos.
- Ressuspender em 500 mL (hipocampo) a 1 ml (córtex) DMEM acrescido de 10% FBS e pipeta cima e para baixo várias vezes com uma micropipeta de 1 ml equipado com uma ponta de 1 ml, em seguida, equipado com 1 ml mais 200 dicas ml, até que haja nenhum agregado visível.
- Distribuir 100-200 mL de suspensão de células a cada botto vidro 35 milímetrosm prato contendo DMEM acrescido de 10% FBS e deixar os neurônios aderem a 37 ° C durante pelo menos 3 horas. Substituir por neurónio pré-aquecido meio completo (meio Neurobasal suplementado com 250 uM de L-glutamina e NS21, preparado como descrito em Chen et al. 19) e deixar a 37 ° C para permitir o crescimento neuronal. Transfecção os neurônios em 5 a 14 dias in vitro (div) (a eficiência de transfecção é maior depois de algumas conexões sinápticas div mas é melhor estabelecida 7-10 div).
3. Transfecção de EGFP-G3BP1 Construct
Transfectar as células com um vector contendo o cDNA da sua proteína de interesse (de qualquer componente de SG) fundido com um marcador fluorescente (GFP, YFP, etc), utilizando 3 ug de plasmídeo purificado por 35 milímetros prato.
- Transfectar as MEFs usando um método comercial, seguindo o protocolo do fabricante (ver o quadro de Materiais / Reagentes).
- Transfecção de neurônios com um cálciométodo do fosfato adaptado de Xia et al 20 Resumidamente.:
- Preparar as soluções: DMEM-wash: DMEM contendo KCl 25 mM; solução de transfecção: DMEM-lavagem contendo 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl2 10 mM, vermelho de fenol); e solução de choque: HeBS 1x, DMKY 1x, e DMSO a 2% (v / v); e mantê-los a 37 ° C.
- Remova a mídia dos neurônios, filtrado, e mantê-lo a 37 ° C. Lavar com DMEM-lavagem, em seguida, substitua-o por meio de transfecção e manter a 37 ° C durante a preparação dos precipitados de fosfato de ADN-plasmídeo de cálcio.
- Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar (por esta ordem) Braun água (volume final de 50 ul), 5 ul de CaCl2 2,5 M, e 3 ug de DNA de plasmídeo. Largue essa mistura em 50 mL de HeBS 2x já introduzidas em um tubo de polipropileno de fundo redondo. Misture o tubo por rotação, juntamente com a queda. Deixe o formulário precipitado à temperatura ambiente durante 30 min.
- Adicionar o precipitate gota a gota, para os neurónios e deixar a 37 ° C durante 30 a 50 min.
- Substitua com solução de choque para 1 min, em seguida, enxaguar com DMEM-lavagem e finalmente reintroduzir o meio pré-condicionado. Manter as células a 37 ° C.
4. Visualização de G3BP Contendo Assembléia e Dynamics SG
- Substituir o meio das células que contém vermelho de fenol por fenol médio vermelho-free.
- Use um microscópio confocal equipado com fluorescência para as aquisições. Ligue os sistemas de microscópio: lâmpada de mercúrio, computador e lasers. Aquecer a câmara a 37 ° C, pelo menos 20 minutos antes do início das aquisições.
- A expressão mais de G3BP induz a formação espontânea de um tipo de SG. As células podem, portanto, ser observado para o conjunto da SGS 24 hr direita após a transfecção sem indução de estresse. Alternativamente, o stress pode ser induzido para induzir ainda mais a montagem da SGS. Adicionar arsenito de sódio 0,5 mM e estrelat a aquisição logo após a adição do composto (grânulos será assim formado dentro de 1 hora).
- Adicione o óleo para a objetiva de imersão (use 40X ou 63X objetivos) e instalar a placa de Petri sobre o objetivo do titular microscópio adaptado 35 milímetros, estabilizado no suporte do palco. Verifique se o prato é plana caso contrário, as aquisições serão alterados. Ligue a luz de fluorescência de acordo com o fluoróforo relevante e visualizar células transfectadas. Desactivar a fluorescência uma vez por célula de interesse está no campo, a fim de minimizar o branqueamento e citotoxicidade.
- No "adquirir guia", selecione os lasers, dependendo do comprimento de onda de excitação do fluoróforo tag (488 nm em nosso protocolo que utiliza G3BP EGFP-marcadas) e selecione o período de emissão adaptado para a PMT (tubo fotomultiplicador). Ajustar a potência de laser (geralmente não mais do que 10%), para minimizar o ruído e supersaturação, bem como a toxicidade, e ajustar o ganho eo deslocamento para modificar a relação sinal-ruído.Digitalização rápida (1.000 Hz), a fim de minimizar o tempo de exposição do laser (linha média 2, quadro médio 1). Se desejar, defina os parâmetros para a pilha Z para ser capaz de reconstruir a imagem em 3D (um passo Z de 1 mícron é geralmente bem com as células). Determine o tempo de intervalo entre cada uma das aquisições: intervalos menores permitem obter um filme mais coerente, mas isto pode provocar a fotodegradação e toxicidade (um intervalo de 20 segundos foi usado nas experiências descritas). Duração de aquisição total pode variar, dependendo do tipo de stress. Muitos SG contendo G3BP são formadas muito rapidamente sob tratamento arsenito e são bem visíveis após 1 hora do tratamento: nesse caso, escolher rapidamente as células para filmar e iniciar as aquisições logo após o stress, com uma duração total de aquisições de 15 - 20 min largamente suficientes para observar a montagem de vários GV.
- Salve as imagens e reconstruir as pilhas e filme usando o software ImageJ.
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Representative Results
A formação de grânulos de stress é importante na resposta de células ao stress, permitindo uma adaptação celular com tradução parada, até que a pressão foi eliminada, associado à prevenção de apoptose. Este ensaio permite estudar as SGS em células primárias, seguindo a localização dos principais componentes proteicos SGs (Figura 1). G3BP, um fator-chave de montagem SG, está presente, em vez difusamente no citoplasma das MEFs cultivadas ou neurônios (Figura 2A A e C), e está claramente presente em grânulos discretos em tratamento arsenito em MEFs, bem como os neurônios (Figura 2A e B d). As células primárias podem ser obtidas a partir de modelos de ratinhos transgénicos, por exemplo, permitindo que o estudo de grânulos de stress, na ausência de um dos seus componentes. Curiosamente, a deficiência de G3BP1 no rato conduz a graves defeitos do sistema nervoso central, nomeadamente uma atáxica phenotype caracterizada por uma incapacidade para coordenar os movimentos correctamente (como visto num teste apertando membro, Fig. 2B) e uma alteração da memória de trabalho espacial. G3BP1 está presente em grânulos de stress nas células neuronais, e isto é tanto mais interessante que SG ter sido mostrado, para formar o início de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer.
Este ensaio (Figura 1), assim, permite estudar SGS em células primárias, que são indispensáveis para estudar a sua composição e montagem in vivo. Além disso, permite o estudo de células vivas e podem, assim, ser utilizada para seguir as dinâmicas de SG, por meio da visualização de um ou vários dos seus componentes sobre-expresso em tempo real. Figura 3 mostra imagens representativas de lapso de tempo que permitam a seguir a montagem e dinâmica do SG em MEFs após tratamento arsenito contendo G3BP1. Na Figura 4A, a mesma experiência foi realizada com os neurónios do hipocampo de murino em culture. EGFP-G3BP1 localização vai de grandes estruturas subcelulares granulares para grânulos mais definidas e menores, o GV, após o tratamento arsenito. SG eram mais e mais definido, se as aquisições foram continuados (não mostrado), mas a morfologia da célula começou a mudar, provavelmente devido ao calor e à toxicidade induzida pelo laser de excitação.
Lapso de tempo permite a captura de um vídeo de observar diretamente a dinâmica do GV. Além disso, o uso de um microscópio confocal permite reconstruir uma imagem em pilha Z e assim seguir completamente a dinâmica dos corpos em toda a célula em três dimensões (como se ilustra por um neurónio com um tempo definido na Figura 4B).
Figura 1. Descritiva das principais etapas do protocolo. As células primárias são cultivadasa partir de embriões (18,5 DPC (dias pós-coitum) (ou filhotes recém-nascidos) para os neurônios (a), 13,5 dpc para MEFs (b)). Após transfecção de um plasmídeo contendo EGFP-G3BP1 cDNA, as células estão estressados e fotografada com um microscópio confocal de varredura a laser. Dinâmica de SG contendo G3BP1 são observados. Neurônios são visualizados através MAP2 (Microtubule Associated Protein 2) coloração em (a), MEFs por coloração G3BP1 em (b). Eles são dados como imagens ilustrativas, bem como EGFP-G3BP1 transfectadas neurónio murino (c) e de fibroblasto (d), que são imagens independentes e não correspondem às células dadas em (a) e (b).
Figura 2. (A). G3BP localização em MEFs cultivadas e os neurônios do hipocampo, não tratada ou estressado com arsenito de sódio. G3BP é principalmente citoplasmática com uma coloração difusa em MEFs (a) ou em grandes estruturas granulares na soma dos neurônios (c) quando as células não estão estressados. Depois de 1 hora de tratamento, arsenito de sódio, G3BP fica localizada em grânulos discretos citoplasmáticos (MEFs, B e neurónios, d). Aqui, as células foram fixadas e imunocoradas com um anticorpo anti-G3BP1. Licenças de coloração MAP2 para identificar neurônios em c) e d). DNA foi contra-coradas em azul com Hoechst. As barras de escala representam 2 mM (a e b) e 10 mM (c e d). (B). Quando levantou pelo rabo em direção ao chão (teste-apertando membro), os camundongos WT estender suas pernas (esquerda), enquanto que os ratos G3BP1 KO mostram um reflexo apertando-pata anormal perto de uma postura de morcego. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. Aquisições sucessivas no experimento de lapso de tempo obtidos com MEFs transfectadas com EGFP-G3BP1, utilizando um microscópio confocal de varredura a laser Leica SP5 (excitação a um comprimento de onda de 488 nm). Aquisições foi iniciado 10 minutos após a adição de arsenito de sódio, e obtidas durante 10 min com intervalos de 20 seg. Seis imagens representativas são dadas, com o tempo t em segundos após a adição de arsenito de sódio (0,5 mM). As setas mostram duas áreas onde podemos ver a montagem da SGS. Barra de escala = 2 m.
Figura 4. (A). Aquisições sucessivas no experimento de lapso de tempo obtida com neurônios do hipocampo murino transfectadas com EGFP-G3BP1, usando uma varredura a laser Leica SP5 microscópio confocal (excitaçãonum comprimento de onda de 488 nm). Aquisições foi iniciada 5 minutos após a adição de arsenito de sódio, e obtidas durante 40 min com intervalos de 20 seg. Seis imagens representativas são dadas, com o tempo t em segundos após a adição de arsenito de sódio (0,5 mM). As setas mostram duas áreas onde podemos ver a montagem da SGS. Barra de escala representa 5 mm d:. Dendrito; um: axónio. (B). 3-dimensão reconstrução de pilha Z (5 aquisições no eixo Z ao longo de um total de 10 mm) de um neurônio transfectadas com EGFP-G3BP1 e tratados com arsenito de sódio n:. Neurite (dendritos ou axônios). Clique aqui para ver uma maior versão desta figura.
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Discussion
Os passos mais críticos no protocolo preocupação a transfecção e mais particularmente as aquisições lapso de tempo, que devem ser cuidadosamente monitoradas a fim de baixar a citotoxicidade.
Cultura de células primárias não é uma parte difícil, desde que sejam mantidas condições estéreis e cuidado é tomado para evitar danos durante as etapas de dissecação e de dissociação celular. MEFs pode ser mantido congelado no início passagens. Neuron transfecção com fosfato de cálcio tem sido demonstrado que funciona bem e 21 deste protocolo adaptado a partir de Xia et al. 20 permite bom nível de transfecção, no entanto, pode induzir um certo morte celular. É importante para transfectar os neurónios dentro de poucos dias após a cultura, para verificar que o pH das soluções e para monitorar a incubação dos neurónios, com o precipitado de fosfato de cálcio-plasmídeo, que não deve ser superior a 1 hora. Verifique sob um microscópio de luz e remova o tranmédio sfection se agregados são observados. O número de lavagens com DMEM pode ser aumentada.
A sobre-expressão de certos componentes proteicos SGs conduz à montagem espontânea de grânulos, que parece envolver a oligomerização e RNA propriedades destas proteínas de ligação, como no caso de TIA-1/4 ou R G3BP 5. Assim, é importante definir o momento em que você pode começar a aquisição de lapso de tempo. Algumas SG são visível assim como 24 horas depois de EGFP-G3BP transfecção, quando a proteína é expressa. No entanto, a indução de uma tensão adicional, conduz à formação de grânulos adicionais, que podem diferir como diferentes tipos de SG com diferentes componentes principais foram identificados em diferentes tensões 1,22,23. Montagem de SG é rapidamente em células vivas (tão rápido quanto 10-20 min), e diversos grânulos são totalmente formados dentro de uma hora de tratamento, arsenito, é, assim, importante para iniciar as aquisições o mais rapidamente possível à réer a indução de estresse se o conjunto tem que ser estudado. Em fases posteriores no entanto, a dinâmica da SGS também pode ser estudado, como pequenos grânulos podem se aglutinar em estruturas maiores, e estas estruturas não são fixas: os seus componentes podem ser trocados com o citoplasma ou outros tipos de grânulos, como os P-corpos, sites de decadência RNA 3. Detecção ocular rápido de células transfectadas e monitorização rápidas dos parâmetros de aquisições (especialmente X, Y, Z) e coordena permitir obter um filme, incluindo a montagem de grânulos, assim como para limitar a fotodegradação e citotoxicidade induzida por laser, que é a outra etapa crítica em imagens ao vivo. Na verdade, em alguns casos, pode-se observar importantes mudanças na morfologia celular e mesmo a morte de algumas células, se as aquisições foram realizadas por um longo período de tempo (mais do que 1 hora após a indução do stress oxydative com tratamento arsenito). A fim de evitar estes fenómenos, é possível fixar a verificação e para aumentar os intervalosduração entre cada aquisição. No entanto, um intervalo mais curto permite seguir melhor a dinâmica da SGS contendo a proteína visualizada, e para se obter um filme mais completa. Assim, deve-se adaptar os parâmetros de cada experiência para se obter o melhor filme com a fotodegradação e toxicidade limitada, dependendo do tipo de célula primária, sobre o componente de grânulo que é seguido, e sobre a molécula associada fluoróforo.
Etiquetas de proteína fluorescente são geralmente suficientemente fotoestáveis para ser trabalhada para a duração da experiência. Diferentes proteínas fluorescentes pode funcionar bem, contanto que eles produzem um sinal forte, são lentos para branquear e não tóxico. Mais importante, elas devem ser suficientemente brilhante, a fim de dar o sinal acima da autofluorescência das células e ser, portanto, ser detectado com segurança. De fato, as células primárias podem induzir um sinal de fundo devido à autofluorescência de organelas (como mitocôndrias e lisossomos). No entanto, em nossas mãos, autofluorescência foimuito baixo quando comparado com o brilho da EGFP-G3BP, e era fácil distinguir o sinal de EGFP de células transfectadas contra células não transfectadas. Em geral, a escolha de filtros ideais e os níveis de intensidade de luz laser será fundamental para obter a relação de direito signal-to-noise, associada à baixa toxicidade. Finalmente, se as imagens têm de ser quantitativamente estudado, é importante ter a certeza de que a intensidade de fluorescência da proteína não é sensível a factores ambientais tais como componentes do meio de cultura.
Dinâmica SGs pode, efectivamente, ser comparada (a velocidade de montagem, o tamanho e número de grânulos) entre diferentes condições (a partir de células de tipo selvagem e animais knock-out, por exemplo). A fim de obter resultados estatisticamente significativos, deve-se células de cultura de pelo menos três animais diferentes de cada genótipo ou condição (a partir de três ninhadas diferentes), e imagem entre 10 e 50 células em cada experimento independente. É possível marcar várias posiçõesno software de aquisição de imagem e, assim, a várias células transfectadas, ao mesmo tempo, permitindo aumentar os dados obtidos num tempo relativamente curto. Imagiologia várias células simultaneamente é interessante, pois vai ser difícil de usar mais a mesma placa de Petri, uma vez que as células estão estressadas e fotografada (nos casos em que a montagem de SG é estudado, ou se as condições experimentais em aquisições longas induzir citotoxicidade). No entanto, ao quantificar o "número" e parâmetros de "tamanho" da SGS - e de modo a aumentar o número de células fotografada para obter mais relevância estatística (mais de 50 células de cada indivíduo) - As células podem ser fixadas, após o tratamento, arsenito, assim que mais células na mesma placa de Petri podem ser estudados. Vídeos ainda vai ser utilizado como resultados qualitativos neste caso.
O protocolo aqui descrito permite estudar contendo G3BP SGS em células vivas primárias, e pode ser adaptado para outros corpos celulares e outra amostra de proteínasonents desses órgãos (como TIA-1 / R para SG, FRMP e Staufen para SG e grânulos de transporte neuronal). A utilização de células primárias é particularmente interessante no contexto de estudos fisiológicos, envolvendo por exemplo, animais transgénicos. Na verdade, os ratinhos KO G3BP1 revelar, por exemplo, a função essencial de um factor de SG na sobrevivência e o desenvolvimento de um organismo, bem como no sistema nervoso central funcionando 14,15.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a plataforma Montpellier Rio (RM) onde foram realizadas as aquisições. Eles agradecem Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot, e Virginie Georget por sua ajuda em diferentes partes do protocolo. Este trabalho foi apoiado pela Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Prewarm at 37 °C |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Nonessential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Prewarm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Prewarm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0.1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
References
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