Summary
이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.
Abstract
세포 및 발달 생물학 모델로 초파리의 오랜 사용 도구의 배열을 굴복했다. 함께, 이러한 기술은 방법 론적 다양한 각도에서 세포 및 발달 생물학의 분석을 사용할 수있다. 라이브 영상은 세포 분열 또는 세포 운동성 동적 셀 프로세스를 관찰하기위한 새로운 방법이다. 그것은 실시간 이미징을 사용하여 반응계 내에서 유사 분열을 관찰하는 것이 필수적이되었다에 uncharacterized 추정 세포주기 단백질에 돌연변이를 갖는 격리. 초파리에있는 대부분의 라이브 영상 연구 때문에 그들의 작은 크기와 광학 선명도의 조작과 관찰에 액세스 할 수있는 배아 단계에 초점을 맞추고있다. 이 간극 단계 중 하나 또는 모두를 결여에 그러나, 이들 단계에서 세포주기가 드물다. 대조적으로, 초파리의 번데기 날개의 세포는 전형적인 세포주기를 가지고 번데기 전개 약 20 시간에 걸쳐 급격한 유사 분열주기를 겪는다. 내가 용이dentify 및 현장에서 유사 분열을 잡을 수있는 적절한 단계의 번데기를 분리. 설치 그대로 번데기 실험은 세포와 동물 생존에 미치는 영향을 최소화하면서 몇 시간 동안 실행할 수 있도록 이미징 동안 취급 용이성 및 내구성의 최상의 조합을 제공했다. 이 방법은 작은, 또는보다 작은 염색체를 비행 기능을 관찰 할 수 있습니다. 현미경 설정 및 설치의 세부 사항 조정, 준비의 확장을 막 인접 셀의 역학과 같은 튜 불린과 같은 형광 표지 단백질을 시각화 할 수있었습니다. 이 방법은 모든 시험 형광 단백질을 작동 시간 규모의 다양한 통해 서브 마이크론 규모의 기능을 캡처 할 수 있습니다. 기존의 공 초점 현미경으로 번데기의 외부 20 μm의 제한하지만, 생체 내에서 번데기 조직에서 단백질과 세포 역학을 관찰하는이 방법은 이러한 조직에서 세포 및 발달 생물학의 연구에서 일반적으로 유용 할 수 있습니다.
Introduction
식초 파리, 초파리 melanogaster의는. 초파리 연구를 표현, 최저 돌연변이 등의 유전자 조작의 세련된 형태를 허용 유전자 실험의 풍부한 역사를 가지고 생물학의 여러 측면을 연구하기위한 기초가 튼튼한 모델입니다. 형광 단백질 라벨의 도래와 함께,이 레퍼토리는 살아있는 동물의 세포와 단백질의 연구를 포함하도록 확장했다. 플라이 배아는 생체 내 1-3 깊은, 고해상도 영상을 허용 작은 광학적으로 알 수있는 바와 같이 이러한 연구를위한 훌륭한 시스템이다. 플라이 개발의 다른 단계 진통제 4, 해부 및 단기 문화 5,6, 또는 영상 7,8의 표피에있는 윈도우의 생성을 필요로하는, 덜 다루기 쉬운적일 수있다. 이러한 조작은 보통 장기 동물 발달을 손상 또는 짧은 기간에 촬상을 제한 방식으로 동물에 영향을 미친다.
대부분의 배아 줄기 세포주기가 절단되기 때문에 세포주기 규제 유사 유전자의 새로운 변이를 연구하는 엔트 ">, 그것은. 세포주기의 타이밍과 충실도를 연구하는 적절한 준비를 찾을 수 필수적이었다 (SM 또는 S-G2-M) 및 연구에서 돌연변이는 이후 단계까지, 그것은 번데기 조직에서 세포주기를 관찰하는 것이 중요하다고 결함을 표시하지 않습니다. 번데기에있는 상피 세포가 전형적인 G1-S-G2-M 세포주기와이 단계의 번데기가이 근육의 움직임 9 할 수 없다. 조작에 대한 초기 시작 지점 번데기 경우의 명백한 불투명도에도 불구하고 Histone2AV-GFP를 표현 그대로 전체 번데기를. 포함이 그대로 준비가 생체 내 이미징에서 장기적으로 우수한 것으로 판명.이 기술은 간단합니다 학부 연구원이 정기적으로 초파리에서 세포 및 발달 생물학의 측면을 연구하는 데 사용할 아직 해상도가 마이크로 미터 스케일 기능의 차별을 할 수 있도록 충분히 괜찮 충분히. 이 방법에서는, 시간, 분, 또는 초 이상의 이벤트의 관측은 단순히 시계열 파라미터를 조정함으로써 가능하다. 파란색, 녹색, 노란색, 오렌지색과 적색 형광 단백질, 또는 이들의 조합을 사용하여 비디오,되었습니다. 중요한 경우, 치료조차 장기간 이미징 동물의 개발이나 생존에 영향이 없으며 레이저의 강도를 최소화하도록 수행된다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 일 플라이
- 실내 온도 10에서 표준 옥수수 가루 한천-당밀 효모 매체에 파리를 유지한다.
- 십자가를 들어, 우화의 6 시간 내 처녀를 분리. 원하는 유전자형의 남성을 횡단 한 후, 변경 사항은 모든 3-4일 새로운 유리 병에 파리.
주 : 이들 실험의 경우, 인 Gal4 라인 A9는 날개에서 도입 유전자의 발현을 구동하는 데 사용 하였다. 플라이 주식 블루밍턴 주식 센터에서 얻을 수 있습니다. 이 실험에 사용 된 주식은 A9-인 Gal4 (BL 번호 8761), His2Av-GFP (BL 번호 5941), SCO는 / CYO HsCre (BL 번호 1092), UAS - ChRFP - 욕조 (BL 번호 25773), 11 lollibow 있습니다.
2. 선택 및 번데기의 장착
- 무대 번데기 하나 흰색 prepupae (WPP)로 수집하고 적절한 연령에 도달 할 때까지 25 ° C에서 그들을 유지하거나 형태 학적 기준 (12)을 사용하여.
- 세포 분열, 최근 머리 외전을받은 선택 번데기를 관찰하십시오.이 시점에서 때까지 그냥 우화 (에서> 96 시간) 전에, 번데기는 움직이지 장기간 경과 관찰을 허용하고 있습니다.
- 먼저 물을 붓에 그들을 괴롭히는 부드럽게 한 후 접착제를 느슨하게 할 수 있도록 잠시 대기, 물에 적신 붓으로 터치하여 유리 병에서 번데기를 제거합니다.
- 부드럽게 침샘 접착제와 음식 입자를 제거하기 위해 물에 붓으로 그들을 괴롭히는 선택한 번데기를 씻어.
- 커버 슬립 바닥 (번호 1 ½ 커버 슬립)와 25mm 페트리 접시에 깨끗한 번데기를 전송합니다.
- 그 조직이 coverslip에 가장 가까운 수 있도록 지원 등의 점토 또는 치과 왁스 하나의 얇은 스트립을 사용하여, 번데기를 탑재합니다.
참고 : 여기에 설명 된 연구에서, 번데기 날개, 다리, 복부 histoblasts 또는 지느러미 notum이 관찰되었다. 실제로, 번데기 케이스의 표면의 20 μM 내의 조직 관찰 가능하다. - 동양 번데기주의 깊게 있도록 Tissu은또한 E는 유리 커버 슬립의 표면에 평행하다.
- 번데기가 장착되면, 번데기 및 커버 슬립 사이의 공간에 티 오디 글리콜 (TDG)의 얇은 층을 전송하기 위해 붓을 사용합니다.
참고 : TDG는, 표면 산란을 감소 오일의 굴절률과 일치하고, 산소가 조직 (13)을 투과 할 수있다. 그들은 세포 행동의 빠른 중단의 원인이 산소의 조직을 박탈하는 경향 오일의 사용은 권장되지 않습니다.
3. 영상
참고 : 영상의 경우, 공 초점 현미경 confocality가 번데기 케이스의 강렬한 조명에 의한 어둡게 배경의 대부분을 제거 필수 될 가능성이 높습니다.
- 번데기 개발과 생존에 대한 조명의 영향을 최소화하기 위해 공 초점에 대한 설정을 조정합니다. 그렇게하려면, 여진 강도 및 컬렉션의 감도 간의 균형. 영상 위스콘신의 일반적인 구성라이카 SP5는 공진 스캐너 (8,000 Hz에서), 2 %로 설정 레이저 파워 (20 % 전력의 10 % 투과율), 120 μm의 작은 구멍 세트, 라인이 8로 설정 평균을 사용하는 일을. 설정 실험 조건에 따라 달라질 수 있습니다.
참고 : 미세 규모가 초점 심도를 제한하지만 성공적으로,이 방법에 사용 된 40X 및 63X 기름 침지 렌즈 (0.1 mm 작동 거리와) 같은 다양한 해결하려면.
4. 분석
프레임을 분석하기 위해, Z-스택이나 영화보기, 측정, 및 프리젠 테이션 (14) 파일을 수정하기위한 효과적인 도구가 피지에 데이터 파일을 가져옵니다. 예를 들어 유사 분열을 완료하는 시간은 telophase 할 의향로부터 셀을 보면서 단계별로 프레임 샘플링 간격 및 다차원 이미지 브라우저를 사용하여 측정 하였다. x-, Y-및 Z-치수 측정 도구를 사용하여 측정 할 수있다. 소프트웨어와 그 사용에 대한 자세한 지침은참조 : http://fiji.sc/Fiji을.
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Representative Results
이러한 현상 초파리 눈 또는 현상 척추 중추 신경계의 심실 층으로서 pseudostratified 상피 세포는, 핵 운동을 겪는, 세포주기에 맞춰, interkinetic 핵 옮기는 칭했다. 핵은 기저 표면 또는 근처에와 핵이 혀끝의 표면 (15, 16)에 도달하면 세포가 유사 분열을 입력 할 때 DNA 복제가 발생합니다. 번데기 날개 세포는 머리 외전 후 첫 몇 시간 동안 빠른 속도로 나누어 단층 상피 세포를 형성한다. 데이터는 섹션 1 분 간격으로 매 2 μm의 복용 초기 번데기 윙에서 xyzt 모드에서 수집되었다. 그 결과 3D 영화의 유사 분열 만 혀끝의 표면 (그림 1A)에서 관찰되었다. 더 기저 위치에서 찍은 부분은 유사 분열의 흔적 (그림 1B)를 보여 주었다 그러나 새로 분할 핵이 혀끝의 표면에서 반환 된 핵 움직임이 발생했습니다.
그림 1. 핵이 분열하는 상피 세포의 상단으로 이동합니다. 대표 섹션을 His2AvGFP을 표현 야생형 초파리의 번데기 날개의 xyzt 공 초점 이미지에서. 최상위 at 섹션 (A) 핵은 세포주기의 다른 단계에서 볼 수있다. 핵 telophase (화살촉)에 있기 때문에 중기 (화살표)의 핵이 현미경에 풍부합니다. DNA 복제의 상태를 나타내는 핵 직경의 변화가 있지만 섹션 (B)의 하부면에서 유사 분열의 증거는 명백하지 않습니다. 바 10 ㎛를 확장 할 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
분할 세포의 기능, His2AvGFP 발현 세포의 공 촛점 분석을 통해 초파리의 살아있는 번데기 날개의 유사 분열을 관찰하기위한 간단한 준비에 필요한 개발을 시각화, 측정, 정량화한다. 이 방법은 번데기 날개의 세포주기가 유사 분열을 입력 상피 세포의 꼭대기의 표면에 그 핵의 움직임에 pseudostratified 상피 세포의주기를 셀에 강한 유사성을 맺는 것을 문서화하는 데 사용되었다. telophase에 따라, 핵은 다시 상피 층에 놓습니다. 따라서,이 단층, 분명히 unstratified 상피 세포, 쇼의 세포는 핵 마이그레이션을 interkinetic 제한.
공개 주식과 초파리 11에서 17 종류의 라이브 영상을 brainbow 위해 만들어진 라인의 영상은,이 기술은 다른 생물학적 현상의 연구에 일반화 할 수 있음을 보여 주었다. 여기에 설명 된 기술은 보라의 생산에 사용되었다분에서 10 시간까지 배 이상 OS. 어느 정도, 현미경 파라미터는 실험으로 변화한다. 예를 들어, 시간 경과 영상의 샘플링 속도는 관찰에서 생물학적 현상의 본질을 준수해야합니다 : 일반적으로 매 순간이 적절한 이미지의 스택을 수집, telophase 할 의향에서 약 12 분을 세포 분열을 관찰. 같은 세포 filopodia의 행동을 관찰하기 위해, 섹션 또는 스택은 미세한 (3 초) 간격으로 수집해야합니다.
설명한 조건 하에서, eclosing 인원수의 생존 또는 형태에 아무런 영향에 관계없이 관찰 기간이 관찰되지 않았다. 형광 마커 낮은 풍요 건 때, 레이저 전력은 일반적으로 증가 하였다. 이러한 상황에서, 동영상의 재생 시간을 단축 또는 섹션 또는 Z-스택 최소화 노광의 수를 감소시킨다. 다른 실험에 대한 컨트롤에서 5 분 동안 최대 강도로 조직을 노출하면 더했다 Effec 없었다성인의 형태 또는 생존에 t. 시각화는 빨강, 녹색, 노란색, 오렌지색, 파란색 다른 단백질의 다양한 태그 형광 단백질, 막에 지역화 및 / 또는 세포질을 작성 포함하도록 확장되었다. 서브 마이크론 범위의 기능은 시간을 초에서 시간 척도에 관찰되었다. 이 방법은 (준비) 야생형과 돌연변이의 유사 분열의시기와 충실도를 관찰하고 측정하기 위해 광범위하게 사용되어왔다.
초파리 개발의 번데기 단계는 성인 양식 애벌레 몸의 골격을 개발하는 동안 애벌레 형태가 실질적으로 제거되는 놀라운 가소성의 기간입니다. 풍부한 역사에도 불구하고, 변형의 연구는 방법 론적으로 방해하고있다. 예를 들어, 프로세스 내부 변형을 연구하는 직접 관찰의 사용은 개조 동안 세포와 조직에 대한 생체 내에서 접속 신뢰성의 부족에 의해 제한되었다. 놀라 울 정도로여기에 제시된 간단한 방법은 초파리의 개발이 암호 같은 기간에 액세스 할 수 있습니다. 접근 방식은 학부생 쉽게 배우고 조직, 세포와 세포 내 조직의 관찰을 허용하도록 충분히 강력한을 사용할 수있을만큼 간단합니다. 이 실험에 사용 된 현미경은 깊은 조직 이미징에 최적화되지 않고, 그래서 우리의 관측은 주로 번데기의 외부 20 μm의 제한을받습니다. 그런 다 광자 현미경으로 깊은 조직 침투를 허용하는 기술은, 영상의 훨씬 더 깊이를 허용하고 변형을 기본 내부 구조 재 배열의 연구를 허용 할 가능성이 높습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 지적 지원, 물자 지원, 종목 아키라 치바을 인정하고 싶습니다. 덧글에 대한 줄리아 달만에 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
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