Summary
אנו מציגים מבחן אמריקאי כדי לחשוף את ההשפעה של ניחוחי על התנהגות דרוזופילה באמצעות assay Y-מבוך.
Abstract
גילוי אותות מהסביבה הוא חיוני לבעלי חיים כדי להבטיח את הישרדותם. למטרה זו, הם משתמשים ברמזים סביבתיים כגון ראייה, mechanoreception, שמיעה, וchemoperception דרך טעם, באמצעות מגע ישיר או דרך חוש ריח, המייצג את התגובה למולקולה נדיפים הפועלת בטווח ארוך יותר. מולקולות כימיות נדיפים הן אותות חשובים מאוד עבור רוב בעלי החיים בזיהוי של סכנה, מקור למזון, או לתקשורת בין אנשים. melanogaster דרוזופילה הוא אחד המודלים הביולוגיים הנפוצים ביותר למדענים לחקור את הבסיס התאי ומולקולרי של חוש ריח. על מנת להדגיש את יכולות חוש הריח של חרק קטן זה, אנו מתארים פרוטוקול בחירה שונה המבוסס על בדיקת Y-המבוך קלסי בשימוש עם עכברים. נתונים המתקבלים עם Y-מבוכים לתת מידע בעל ערך כדי להבין טוב יותר כיצד בעלי חיים מתמודדים עם הסביבה תמיד המשתנה שלהם. אנחנו מציגים את פרוטוקול צעד אחר צעד כדי ללמוד אתהשפעה של ניחוחי על תגובת גישוש לטוס באמצעות assay Y-המבוך הזה.
Introduction
Chemoreception דרך טעם או חוש ריח הוא שיטה חושית מפתח להישרדות של בעלי חיים. זה נותן רמזים חיוניים נחוצים לצורך זיהוי של סכנה או מקורות מזון, כמו גם לאינטראקציות חברתיות. זה גם עוזר בעלי חיים למצוא בן זוג לצורך הרבייה שלהם. במשך יותר מ 20 שנים, מחקר אינטנסיבי, כולל פרס נובל עבודה על ידי ריצ'רד אקסל ולינדה באק ב2004 "על תגליותיהם של קולטנים odorant והארגון של מערכת חוש הריח", בוצע כדי לחשוף את הבסיס המולקולרי ותאי של לחוש ריח 1,2.
אחד מהמודלים של בעלי החיים האהובים למדענים לנתח את תפיסת ריח הוא ד melanogaster. חרק זה חולק אסטרטגיה דומה קידוד ריח תאית ומולקולרית ביונקים. הקהילה המדעית משתמשת בפרדיגמות התנהגותיים מגוונות כדי ללמוד את התפקיד של ניחוחי בזבוב הפירות הזה. בדיקות אלה כוללות מבחני מולטי כגון courtshiבדיקות עמ 'שבו שיטות שונות חושיות, כוללים לחוש ריח, חשובות לעורר חיזור זכר 3. מבחני אחרים יש גם פותחו כדי להתמודד עם התפקיד של ניחוחי ליתר דיוק; אלה כוללים T-מבוכים, Y-מבוכים, מבחני מלכודת, זירות ארבעה שדה ו4,5,6,7,8 רוח מנהרות.
במאמר זה אנו מציגים assay פשוט הותאם Y-מבוך, המספק תשובות חוש הריח חזקות באמצעות ד melanogaster. ההגדרה שלנו משתמשת קצה טיפים בניגוד לשיטה שתוארה לעיל 9. לפיכך, יש Y-המבוך שלנו שני יתרונות. ראשית, זה ימנע כל החזר במערכת פעם אחת הזבוב עשה את הבחירה שלה. שנית, שהוא מגביל את חילופי הניחוח בכל תחומי ה-Y המבוך. היתרון האחרון הוא חשוב מאז דרוזופילה רגישה מאוד לזרימת אוויר המשמש לעתים קרובות כדי למנוע הרוויה odorant. כדי להתאים את ניסיוני הגדרה עם זרימת אוויר יהיה זמן וצרכנות עלות. לכן, assay Y-המבוך שלנו מייצג EFficient ודרך מהירה לבדוק את ביצועי חוש הריח של דרוזופילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לפני שמתחיל
- השתמש מניית התייחסות isogenized נושאות פנוטיפים התנהגותיים יציבים וחזקים. אין חוק כללי לבחירת המניה זו, שכן כל הבקרות האפשריות עשויות לשאת אללים רקע הטרוגנית.
- השתמש בלחץ שליטה זו להכלאה לאחור כל מניות אחרות הדרושים לצעדים מאוחר יותר. צעד backcrossing זה מיוצג בדרך כלל על ידי לפחות 5 צלבים רצופים של נקבות בתולה יחידה (כדי לאפשר מעבר מעל בין כרומוזומים הומולוגיים אפשרי) ל2-3 זכרים התייחסות isogenic 5. שלב זה חשוב לhomogenize הרקע הגנטי בין מניות זבוב השונות.
- לשמור על מניות דרוזופילה על קמח תירס סטנדרטי (9%), שמרים (10%), ובינוני אגר (1.5%) השלים עם (0.4% para-הידרוקסי-נזואט תיל) אנטיביוטיקה במחזור אור / חושך 12-HR ב25 ° C.
- להשיג ניסויי chemosensory בחדר בטמפרטורה מבוקרת (25 מעלות צלזיוס) תחת אור אדום רחוק(כדי למנוע את תרומתם של רמזים חזותיים, ולהתמקד באותות chemosensory). באופן קבוע לחדש את האוויר מהחדר כדי לאוורר את האזור שבין כל ניסוי.
2. תגובת חוש הריח באמצעות assay Y-מבוך
- להרעיב את הזבובים ל16-18 שעות ב25 מעלות צלזיוס בצינורות זכוכית המכילים מגבת נייר רטובה לפני הבדיקה.
- הצטרפות מחבר Y-צורה לשתי צלוחיות זכוכית ובקבוקון קטן מפלסטיק (בקבוקון טעינה). השתמש 1 טיפים פיפטה מיליליטר שעוברים דרך פקקי הקצף לקשר את המחבר לשלושה בקבוקונים, וכדי להשיג Y-מבוך סגור היטב. חותכים את הקצוות הצרים של שני טיפים פיפטה (~ 2 מ"מ קוטר, כדי להימנע מכל החזרה של הזבוב ברגע שהוא עשה את ההחלטה שלו) כדי ליצור שני בקבוקונים "מלכודת", וסופו של דבר גדול של פיפטה קצה אחד כדי ליצור את "ההעמסה" צינור (איור 1 א).
- רק לפני חיבור בקבוקוני "מלכודת" (איור 1), במקום אחד ~ 6 נייר סינון בקוטר מ"מכל בקבוקון. הוסף 40 μl של פתרון odorant על נייר מסנן אחד, ו40 μl של מקביל הממס על נייר הסינון השני.
- להציג את עשרה 4 עד 9 זבובים בן יומו לתוך הבקבוקון "טעינה". אל תשתמש בהרדמה 2 CO בהעברה זו, שכן יש לו השפעה חזקה על התנהגות 10. במקום זאת להשתמש בקירור קצר על קרח. מניפולציה נכונה של זבובים מורדמים חשובה להגביל את הלחץ על הנושאים עד כמה שניתן.
- לבצע סדרה של בדיקות Y-מבוך ב ° C25 תחת אור מרחיק האדום (שימוש בנורות LED להגביל מקור חימום אפשרי), כדי למנוע גירויים חזותיים ככל האפשר. היזהר חלופיים האוריינטציות של Y-המבוכים (צינור odorant המכיל בצד השמאל, או בצד הימין, וצינור טעינה בחזית או בגב; תרשים 1C).
- אפשר לכמה שעות לזבובים להיכנס בבקבוקון המכיל מלכודת odorant או הממס. לספור זבובים לאחר 24 שעות כדי להגדיל את participatiעל עד יותר מ 80% ולספק את ערך מדד חוש הריח המרבי (Simonnet, תקשורת אישית).
- לחשב את מדד חוש הריח וכתוצאה מכך שימוש בנוסחה הבאה: (מספר בצינור הריח - מספר בצינור הממס) / מספר כולל של זבובים טעונים.
- ההגדרה לשטוף Y-מבוך כדלקמן: להשרות את פירקה ההגדרה בMD RBS 35 לילה. לשטוף ביסודיות עם מים ברז. לבסוף לשטוף עם מים deionized ולתת להתייבש.
3. ניתוח סטטיסטי של נתונים
- לבצע מבחן t, ניתוח שונה חד כיווני או אנובה דו כיוונית בהתאם לנתונים ומשתנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1D איור מראה שתי תגובות נציג באמצעות assay Y-המבוך הזה. זכרים קנטון-S מאוד להימנע 10% חומצה אצטית מדוללת במים מזוקקים, ואילו הם לא להימנע 10% חומצת phenylacetic באופן משמעותי. מבחני אלה מבוססים על 10 זכרים ללשכפל מונחים ביחד בבקבוקוני הטעינה. פרוטוקול זה יכול לפעמים לגרום לשגיאה סטנדרטית גדולה של הממוצע. במידת הצורך, ניתן להפחית על חסרון זה באמצעות 20 זכרים למשכפל במקום רק 10. מבחינה מתמטית, בחירתו של אדם אחד יש לו משקל נמוך יותר על ערך המדד לגודל מדגם גדול יותר.
איור 1. תגובת חוש הריח זכר הוערכה עם הגדרת Y-מבוך.) מכשיר פיצול. B) מורכבכימות מכשיר. ג) הגדרה במצב עבודה תחת אור מרחיק אדום. ד ') של תגובות חוש הריח גבריות כלפי חומצה אצטית (AA) או חומצת phenylacetic (PAA) הן דילול במים מזוקקים (10% V / V) (N = 11, המייצג כולל של 110 זבובים). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t השוואת הנתונים ל0. 0 אומר שאין העדפה. ערך שלילי מצביע על סלידה odorant, וערך חיובי משיכה. ****: P <0.0001; NS:. שאינו משמעותי (p = 0.1680) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול Y-המבוך שלנו מבוסס על פרוטוקול שתואר לעיל 9. עם זאת, אנחנו מציגים שני הבדלים עיקריים. ראשית, עלינו להשתמש בטיפי פיפטה צרים כדי למנוע את הזבובים מלשוב ברגע שהם יחליטו להיכנס בבקבוקון המכיל ממס או הממס בתוספת odorant. טיפים צרים אלה הם שימושיים גם כדי להגביל את הדיפוזיה odorant בY-המבוך. שנית, אנו משתמשים בבקבוקון טעינה קטן יותר כדי לאלץ את הזבובים להיכנס בY-המבוך. חשוב לי השתתפות גבוהה של זבובים אלו (80% ל100% לאחר 24 שעות; Simonnet, תקשורת אישית).
assay Y-המבוך הזה מייצג בדיקה יעילה להעריך את תגובות chemosensory בדרוזופילה. ההקשר של המבחן, כולל לחץ על הזבובים (מזרימת האוויר, מניפולציה של הזבובים במהלך שלב הטעינה, וכו ') הוא פוטנציאל להשפיע על תגובות חוש הריח שלהם. הנושאים הסביבתיים הללו הם קריטיים ויכולים להסביר, לפחות חלקית, מדוע שוניםיש מחקרים יכולים תוצאות התנהגותיות שונות. לדוגמא חומצה אצטית מוצגת להיות דוחה בכמה תנאים 4,11, בעוד הוא מושך באחרים 12. לכן זה קריטי כדי לשלוט על כל הפרמטרים הללו עד כמה שניתן.
מגבלה אפשרית אחת של assay Y-המבוך הזה היא ההקשר המלאכותי שלה לזבובים מאז הם מוחזקים בעיצוב נעול. בנוסף, זבובים צריכים להזין במעברים צרים, אשר עלול להיות מלחיץ עבורם. הנסיין צריך לזכור את זה כאשר לפרש את הנתונים.
כדי לעקוף את המגבלות אפשריות אלה, ניתן היו לבצע את בדיקות ריח משלימים אחרות כדי לאשר את ההשפעה של ניחוחי על התנהגות. בדיקות אלה כוללות T-מבוכים 4, 4 מבחני שדה בזירה 7, או מנהרות רוח 8. עם זאת, בדיקות אלה גם לנצל סביבות מלאכותיות לזבובים, שיכול להיות יותר או פחות מלחיץ. לדוגמא, במהלך בדיקות T-מבוך זבובים הם הייghly הדגיש שכן הם מזועזעים במהלך שלב הטעינה 4. עם זאת, יתרון של T-מבוך לעומת assay Y-המבוך הזה הוא שזבובים צריכים לבחור בתוך דקות לאן ללכת (לodorant או הממס). לכן תגובת Y-המבוך מייצגת בחירה "רעיוני", ואילו תוצאות שהושגו עם T-מבוך מייצגות בחירה רפלקס במצב מלחיץ מאוד.
לבסוף שיפור אפשרי של assay Y-המבוך הזה יהיה להשתמש בצינורות זכוכית לכל אורך הדרך להקים במקום פלסטיק לחלק מרכיבים (צינור טעינה, מחבר, טיפים פיפטה). חלקי פלסטיק אלה יכולים, בתאוריה, יש לו ריח שכן הם עשויים מבנזין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ל4 ביקורות בעילום שם לעבודה שלהם כדי לשפר את כתב היד. אנו מודים למרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique לתמיכה הכספית שלה לMBG וי.ג., ואוניברסיטת דה בורגון והמשרד הצרפתי למחקר ל- MMS. מחקר במעבדה י.ג. ממומן על ידי המועצה האירופית למחקר (ERC החל גרנט, GliSFCo-311,403), Nationale de la משוכלל ונדיר סוכנות הידיעות (ANR-JCJC, GGCB-2010), Conseil האזורי דה בורגון (פייבר), וCNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
- Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y.
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
- Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
- Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).
