Summary
Apresenta-se um teste de escolha para revelar a influência de odorantes sobre o comportamento de Drosophila, utilizando um ensaio de Y-labirinto.
Abstract
A detecção de sinais a partir do ambiente é essencial para animais para garantir a sua sobrevivência. Para este fim, eles usam estímulos ambientais, tais como a visão, mechanoreception, audição e chemoperception através de gosto, através de contato direto ou através do olfato, que representa a resposta a uma molécula volátil atuando em uma escala mais longa. Moléculas químicas voláteis são sinais muito importantes para a maioria dos animais na detecção de perigo, de uma fonte de alimentação, ou para comunicação entre indivíduos. Drosophila melanogaster é um dos modelos biológicos mais comuns para os cientistas a explorar a base molecular e celular do olfacto. A fim de destacar as habilidades olfativas deste pequeno inseto, nós descrevemos um protocolo escolha modificado com base no teste Y-maze classicamente utilizada com camundongos. Dados obtidos com Y labirintos dar informações valiosas para entender melhor como os animais lidar com seu ambiente perpetuamente mudando. Introduzimos um protocolo passo-a-passo para estudar oimpacto de odores sobre a resposta exploratória mosca com este ensaio Y-labirinto.
Introduction
Quimiorecepção através de gosto ou olfato é uma modalidade sensorial chave para a sobrevivência animal. Dá sinais vitais necessários para a detecção de um perigo ou fontes de alimentos, bem como para as interacções sociais. Ela também ajuda os animais a encontrar um parceiro necessário sexo para a sua reprodução. Por mais de 20 anos, a pesquisa intensiva, incluindo Nobel premiado trabalho de Richard Axel e Linda Buck, em 2004, "por suas descobertas de receptores olfativos ea organização do sistema olfativo", foi realizado para revelar as bases moleculares e celulares da olfato 1,2.
Um dos modelos animais favoritos para os cientistas para dissecar percepção olfativa é D. melanogaster. Este inseto compartilha uma estratégia de codificação odor-celular e molecular semelhante com mamíferos. A comunidade científica utiliza diversos paradigmas comportamentais para estudar o papel dos odores nesta mosca da fruta. Estes ensaios incluem ensaios multimodais, tais como courtshitestes p onde várias modalidades sensoriais, incluindo o olfato, são importantes para suscitar namoro masculino 3. Outros ensaios também foram desenvolvidos para lidar com o papel de odores mais especificamente; estes incluem t-labirintos, Y labirintos, ensaios de armadilha, arenas de quatro de campo e vento túneis 4.5.6.7.8.
Neste artigo apresentamos um ensaio simples modificado Y-labirinto, que fornece respostas olfativas robustas usando D. melanogaster. O nosso set-up usa finais dicas em contrário a um método previamente descrito 9. Assim, o nosso Y-maze tem duas vantagens. Primeiro, ele evita qualquer retorno no sistema uma vez que a mosca fez sua escolha. Em segundo lugar, limita a troca de odores em todas as áreas do Y-labirinto. Esta última vantagem é importante uma vez que a Drosophila são muito sensíveis ao fluxo de ar, que é muitas vezes utilizado para evitar a saturação do odorante. Para ajustar o set-up experimental com um fluxo de ar seria o tempo eo custo de consumir. Por isso, o nosso ensaio de labirinto Y-representa um efciente e maneira rápida de testar o desempenho olfativo de Drosophila.
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Protocol
1. Antes de Começar
- Use um estoque de referência isogenized tendo fenótipos comportamentais estáveis e robustos. Não existe uma regra geral para a escolha deste estoque, uma vez que todos os controles potenciais podem levar fundo heterogêneos alelos.
- Use esta estirpe de controlo para todos os outros retrocruzamento estoque necessário para etapas posteriores. Esta etapa retrocruzamento é normalmente representado por pelo menos cinco cruzamentos sucessivos de uma única fêmea virgem (para permitir possível crossing-over entre cromossomos homólogos) para 2-3 machos referência isogênicos 5. Este passo é importante para homogeneizar o fundo genético entre as diferentes ações de voar.
- Manter stocks de Drosophila em uma farinha de milho normal (9%), levedura de cerveja (10%), e meio de agar (1,5%) complementado com antibióticos (0,4% metil-para-hidroxi-benzoato de metilo) num ciclo de luz / escuro de 12 horas a 25 ° C.
- Alcançar experimentos quimio em uma sala com temperatura controlada (25 ° C) sob luz vermelha extrema(Para eliminar a contribuição de sugestões visuais, e se concentrar em sinais de quimio). Regularmente renovar o ar do quarto para ventilar a área entre cada experimento.
2. Olfatório resposta utilizando um Ensaio Y-maze
- Starve as moscas de 16-18 horas a 25 ° C em tubos de vidro contendo uma toalha de papel húmido antes do teste.
- Junte-se um conector em forma de Y para dois frascos de vidro e de um frasco de plástico inferior (carregamento frasco). Use 1 ml pontas de pipeta que passam as rolhas de espuma de ligação do conector para as três taças, e para obter um hermeticamente fechado Y-labirinto. Corte as pontas estreitas de dois pontas de pipeta (~ 2 mm de diâmetro, para evitar qualquer retorno da mosca uma vez que tenha feito a sua decisão) para formar dois frascos "armadilha", e um grande fim de uma ponta de pipeta para formar o "carregamento" tubo (Figura 1A).
- Pouco antes de conectar os frascos "trap" (Figura 1B), coloque uma ~ 6 milímetros de diâmetro em papel de filtrocada frasco. Adicionar 40 ul de solução de odorante sobre um papel de filtro, e 40 ul de solvente correspondente sobre o segundo papel de filtro.
- Apresente dez 4-9 moscas dias de idade para o frasco "carregamento". Não use dois anestesia CO durante esta transferência, uma vez que tem um forte efeito sobre o comportamento 10. Prefere usar breve resfriamento em gelo. Manipulação adequada de moscas anestesiados é importante limitar o estresse sobre os assuntos, tanto quanto possível.
- Realizar uma série de testes de Y-maze, a 25 ° C sob luz vermelha distante (usando lâmpadas LED para limitar possível fonte de aquecimento) para evitar estímulos visuais, tanto quanto possível. Tenha o cuidado de alternar as orientações dos Y labirintos (odorante contendo tubo à esquerda, ou à direita, e tubo de carga na frente ou na parte de trás; Figura 1C).
- Permitir várias horas para as moscas a entrar na armadilha frasco contendo o odorante ou o solvente. Contagem moscas após 24 horas para aumentar a participatina-se a mais de 80% e fornecer o valor máximo do índice olfactiva (Simonnet, comunicação pessoal).
- Calcular o índice olfactiva resultante utilizando a seguinte fórmula: (número no tubo odor - número no tubo de solvente) / número total de moscas carregados.
- Wash Y-maze set-up da seguinte forma: mergulhe a desmantelado set-up na RBS 35 MD durante a noite. Lave bem com água da torneira. Lavar com água deionizada e deixar secar.
3. Análise estatística dos dados
- Realizar um teste t, um one-way ANOVA ou ANOVA de duas vias, dependendo dos dados e variáveis.
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Representative Results
A Figura 1D mostra dois respostas representativas utilizando este ensaio Y-labirinto. Canton-S machos evitar fortemente a 10% de ácido acético diluído, em água destilada, enquanto eles não evitar significativamente o ácido fenilacético 10%. Estes ensaios são baseados em 10 machos por repetição colocados juntos nos frascos de carregamento. Este protocolo pode levar a grande erro padrão da média. Se necessário, é possível reduzir este inconveniente, usando 20 machos por repetições em vez de apenas 10. Matematicamente, a escolha de um indivíduo tem um peso menor no valor do índice para um maior número de amostras.
Figura 1. Masculino resposta olfativa avaliada com um Y-maze set-up. A) dispositivo Split. B) montadodispositivo. C) Set-up em condições de trabalho sob luz vermelha distante. D) Quantificação de respostas olfativas masculinas em relação ácido acético (AA) ou ácido fenilacético (PAA), ambos diluídos em água destilada (10% v / v) (N = 11, representando um total de 110 moscas). A análise estatística foi realizada utilizando um teste t comparando os dados para 0. 0 significa nenhuma preferência. Um valor negativo indica uma aversão ao odor, e um valor positivo uma atração. ****: P <0,0001; ns:. não significativa (p = 0,1680) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nosso protocolo Y-maze baseia-se num protocolo anteriormente descrito 9. No entanto, apresentamos duas grandes diferenças. Primeiro, usamos pontas de pipeta estreitas para evitar que as moscas de retornar uma vez que eles decidem entrar no frasco que contém o solvente ou o solvente mais o odorante. Estas pontas estreitas também são úteis para limitar a difusão odorante no Y-labirinto. Em segundo lugar, nós usamos um frasco menor carga para forçar as moscas para entrar no Y-labirinto. É importante ter uma elevada taxa de participação destas moscas (80% a 100% depois de 24 horas; Simonnet, comunicação pessoal).
Este ensaio Y-labirinto representa um teste eficiente para avaliar as respostas quimio em Drosophila. O contexto do teste, incluindo o stress sobre as moscas (a partir de fluxo de ar, a manipulação das moscas durante o passo de carregamento, etc) é potencialmente influenciar as respostas olfativas. Essas questões ambientais são fundamentais e podem explicar, pelo menos em parte, por que diferentesestudos podem ter diferentes resultados comportamentais. Por exemplo, o ácido acético é mostrado para ser repulsivo em algumas condições de 4,11, que é atraente em outros 12. Por isso, é crítico para controlar todos estes parâmetros tanto quanto possível.
Uma possível limitação deste ensaio Y-labirinto é o seu contexto artificial para moscas, uma vez que são realizadas em um projeto bloqueado. Além disso, as moscas tem que entrar em passagens estreitas, o que pode ser estressante para eles. O pesquisador tem que lembrar disso na interpretação dos dados.
Para contornar essas possíveis limitações, outros testes olfativos complementares poderiam ser realizados para confirmar o impacto dos odores no comportamento. Estes testes incluem t-labirintos 4, 4 ensaios de campo de arena 7 ou 8 túneis de vento. No entanto, estes testes também utilizar ambientes artificiais para as moscas, o que pode ser mais ou menos stressante. Por exemplo, durante os testes de T-maze moscas são oighly sublinhou, uma vez que são agitadas durante a etapa de carregamento 4. No entanto, uma vantagem de um labirinto em T em comparação com este ensaio Y-maze é que tem que escolher moscas dentro de minutos onde ir (para o odorante ou ao solvente). Portanto, a resposta Y-labirinto representa uma escolha "reflexivo", enquanto que os resultados obtidos com uma T-maze representar uma escolha reflexo em uma condição altamente estressante.
Finalmente uma possível melhora deste ensaio Y-labirinto seria a utilização de tubos de vidro ao longo de toda a configuração em vez de plástico para alguns componentes (tubo de carga, conector, pontas de pipeta). Estas peças de plástico pode, em teoria, ter um odor, uma vez que são feitas a partir de gasolina.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos 4 revisores anônimos por seu trabalho para melhorar o manuscrito. Agradecemos ao Centre National de la Recherche Scientifique pelo apoio financeiro para MBG e YG, ea Université de Bourgogne e do Ministério da Investigação francês para MMS. Pesquisa no laboratório YG é financiado pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC Começando Grant, GliSFCo-311403), a Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), o Conseil Régional de Bourgogne (Faber), eo CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
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