Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выделение мРНК, связанных с митохондриях дрожжей для изучения механизмов локализованных перевода

Published: March 14, 2014 doi: 10.3791/51265
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

Многие мРНК, кодирующих митохондриальные белки связаны с внешней мембраны митохондрий. Мы описываем субклеточную процедуру фракционирования, направленную на изоляцию митохондриях дрожжей и связанные с ним мРНК и рибосом. Этот протокол может быть применен к клеток, выращенных в разнообразных условиях с целью выявления механизмов локализации мРНК и локализованный перевод около митохондрий.

Abstract

Большинство митохондриальных белков закодированы в ядре и должны быть импортированы в органеллы. Импорт может произойти в то время как белок синтезируется около митохондрий. Поддержка этой возможности является производным от недавних исследований, в которых были показаны многие мРНК, кодирующие митохондриальные белки, которые будут локализованы в митохондриях близости. Вместе с ранее демонстраций ассоциации рибосомы "с наружной мембраны, эти результаты предполагают, локализованный процесс перевода. Такие локализованные перевод может повысить эффективность импорта, обеспечить уникальные сайты регулирования и минимизировать случаи эктопической экспрессии. Различные методы были использованы, чтобы охарактеризовать факторы и элементы, которые опосредуют локализованного перевода. Стандартный среди них внутриклеточного фракционирования дифференциальным центрифугированием. Этот протокол имеет преимущество изоляции мРНК, рибосом и белков в одной процедуры. Они могут характеризоваться различными молекулярными и Biрадиохимический методы. Кроме того, транскриптомику и протеомики методы могут быть применены к полученного материала, тем самым позволяют генома Insights. Использование дрожжей в качестве модельного организма для таких исследований имеет преимущества скорости, расходов и простоты. Кроме того, передовые генетические инструменты и доступные штаммы удаления облегчить проверку факторов кандидатов.

Introduction

Эукариотические клетки организованы в различных отсеках, имеющих определенные функции. Чтобы выполнить свою функцию, каждый отсек содержит уникальный набор белков, которые необходимы для его деятельности. Возможным механизмом, посредством которого эти белки подходят к своей отсек является локализованной перевода 1,2. В этом процессе, белок синтезируется в пункт назначения по рибосом и мРНК, которые расположены там. Среди несомненных преимуществ локализованного перевода увеличивается эффективность таргетинга белка, уменьшается потребность в белковых сопровождающих, и позволяет механизмы регулирования по каждому конкретному объекту. Кроме того, локализованные мРНК и рибосомы могут быть уединенный резервуар перевода машин в случаях клеточного стресса, когда вообще перевод тормозится.

Митохондрии стал в последние годы центральным моделью для изучения локализованных перевод. Большинство митохондрии белки кодируются в ядре, переведенной в цитозоле,и импортируются в органеллы. Различные линии доказательств указывают, что многие из этих белков производятся через локальную процессе перевода. Изначально электронная микроскопия и биохимические фракционирования исследования обнаружены рибосомы, связанные с митохондрий 3-5. Эти исследования, где затем подтверждено в естественных условиях работы по конкретным мРНК, которые были найдены, которые будут импортироваться только в cotranslational образом 6,7. Генома исследования мРНК ассоциации с митохондриях показали, что значительная часть мРНК локализованы в митохондриях вблизи 8-10. Некоторые из этих мРНК были дополнительно характеризуется ин виво флуоресценции методов, таких как рыба или Мечел Трейдинг АГ 9,11. Прямо вперед интерпретация этого объединения является то, что эти мРНК служить в качестве шаблонов для локализованной перевода.

Механизмы, с помощью которых эти мРНК подойти к митохондрии неизвестны. Некодирующие домены (наиболее significantlу 3'-НТО) было показано, что участие в мРНК ассоциации в митохондрии 12. Эти домены, скорее всего, чтобы служить в качестве сайта связывания с РНК-связывающих белков, которые опосредуют их транспорт. Исследования на дрожжах показали, что член PUM семейства белков (Puf3) поддерживает мРНК ассоциацию с митохондриями 8,13. Правдоподобным роль Puf3, которая основана на функциях других членов семьи, является ингибирование перевод в то время как мРНК находится в пути 14. Таким образом, мРНК могут перевозиться в нетранслируемой статуса, РНК-связывающих белков, которые взаимодействуют с некодирующих регионах. Кроме того, большой объем работы предполагает, что перенос осуществляется в то время как белок синтезируется. В частности, ингибиторы перевод показали повлиять мРНК ассоциацию 8,13. Кроме того, переведенные функции, такие как август, митохондриальная последовательность таргетинг (МТС) или ORF регионы были показаны для оказания помощи в локализации 8,11,15. Белок ч Hsp70-семьяaperone и белок рецептора на внешней мембраны митохондрий также показали поддерживать связь мРНК, далее означает, что характеристики закодированный-белковые важны для локализации мРНК 16. Это согласуется с моделью, согласно которой рибосома возникающие белок служит в качестве элемента распознавания для ориентации мРНК-рибосома-белкового комплекса в митохондрии 17.

Локализованная перевод вблизи митохондрий изучали с помощью различных методов, в том числе электронной микроскопии (визуализировать рибосомы) 3, рыба 9, зеленый РНК (выявления конкретных мРНК) 11, и биохимической фракционирования (для обнаружения как РНК, так и рибосом) 10,18. В то время как прежние методы обнаружения локализации в естественных условиях и может позволить визуализацию динамики транспортных, последний позволяет обнаруживать множество различных мРНК в одном эксперименте. Кроме того, для биохимического фракционирование кодирования или некодирующих областей не должны быть др.убито, поэтому их конкретные роли могут быть оценены. Биохимический фракционирование успешно используется на протяжении многих лет, для изоляции различных клеточных отсеках. Ее принципы и ограничения, хорошо известны, и можно легко изменять существующие протоколы для различных целей. Необходимая аппаратура является стандартом во многих лабораториях, поэтому, как правило, первым методом выбора для изучения внутриклеточную локализацию. Опишем протокол, который был оптимизирован для выделения мРНК в то время как рибосомы связаны с митохондрий. Этот протокол является поэтому оптимальным для изучения факторов, участвующих в локализованной перевода ближайшее митохондрий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Митохондрии Очистка

Взвесьте осадок клеток. Примерно 0,6 г получают из 100 мл клеток.

  1. Расти 100-150 мл дрожжевых клеток в OD 600 = 1-1,5 на 30 ° С на среде роста nonfermentable, таких как галактоза основе ростовой среды, с тем чтобы обогатить для митохондрий.
  2. Центрифуга клетки при 3000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
  3. Вымойте гранул с дважды дистиллированной воде и центрифуги снова. Удалите супернатант.
  4. Ресуспендируют осадок в 1 мл буфера на DTT 0,5 г клеток. Важно, чтобы лечить клетки с восстановителем, чтобы разорвать дисульфидных связей в клеточной стенке, тем самым улучшая гидролиза.
  5. Инкубируйте клетки в течение 10 мин при 30 ° С при осторожном встряхивании. Между тем, весят 6 мг zymolyase на 1 г клеток и приостановить его в Zymolyase буфера.
  6. Центрифуга клетки при 3000 мкг в течение 5 мин ат при комнатной температуре и отбросить супернатант.
  7. Ресуспендируют осадок в 1 мл буфера на Zymolyase 0,15 г клеток. Не вихрь.
  8. Измерение оптической плотности 600 10 мкл аликвоты клеток в 990 мкл воды.
  9. Добавить Zymolyase (этап 1.5) к клеткам для гидролиза полимеров глюкозы в β-1 ,3-глюкана связей и генерировать сферопластов. Из этой стадии сферопласты следует иметь в изотоническом растворе во избежание лизиса.
  10. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при 30 ° С (для оптимальной активности zymolyase) при осторожном встряхивании. Для проверки гидролиз клеточной стенки и генерации сферопластов, смешать 10 мкл клеток с 990 мкл воды. Сферопласты, как ожидается, лизировать из-за осмотического разницы, и OD 600 следует по крайней мере, в 10 раз меньше, чем значение, полученное в этапе 1.9. Если нет, то продолжать инкубацию с zymolyase еще 15 мин.
  11. Центрифуга клеток при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Тщательно раскарта супернатант, как гранулы могут быть нестабильными.
  12. Вымойте сферопластов с Zymolyase буфера и отбросить супернатант.
  13. Ресуспендируют сферопластов 100 мл восстановления среды. Передача сферопластов в колбу Эрленмейера и инкубируют в течение 1 ч при 30 ° C при встряхивании. Этот шаг восстановления необходимо, так как при переводе лечения Zymolyase арестован и локализация мРНК нарушается (рис. 1В).
  14. Добавить 0,1 мг / мл СНХ и передачи сферопластов в предварительно охлажденном 50 мл коническую трубку. СНХ дополнение важно, чтобы заморозить ассоциацию рибосомы "с мРНК. Таким образом, рибосомы-зависимые РНК ассоциация с митохондриями поддерживается.
  15. Центрифуга сферопласты в 3000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить супернатант.
  16. Промыть дважды холодным буфером маннита.
  17. Ресуспендируют сферопластов с 4 мл холодного маннитол буфера и передавать их на Dounce гомогенизатор 15 мл мощности, оснащенных обтягивающиепестик. Аккуратно разбить сферопластов с 15 ударов и передать лизата к 13 мл трубки.
  18. Центрифуга лизата при 1500 х г в течение 6 мин при 4 ° С для осаждения ядер и неразрушенных клеток.
  19. Тщательно передачи супернатант в новую пробирку. Отложите 1 мл (25%) образца как нефракционированного образца ("Всего" образца). Передача 50 мл этого образца в новую пробирку и добавить 15 мл 4X LSB для вестерн-блот анализа. Осадок РНК из остальной части "Total" образца (см. Протокол 3, РНК осадков).
  20. Центрифуга супернатант при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения митохондрии.
  21. Передача супернатант (~ 3 мл) в новую пробирку и держать его на льду. Это доля "цитозольного". Передача 50 мл этого образца в новую пробирку и добавить 15 мл 4x LSB для вестерн-блот анализа. Осадок РНК от остальной части "цитозольного" образец (см. Protocol 3, РНК осадков).
  22. Промыть гранулу с 3 мл маннита буфера и центрифугируют снова при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  23. Ресуспендируют гранул с 3 мл маннита буфером. Этот образец содержит митохондрии, и называют фракции "митохондрий". Передача 50 мл этого образца в новую пробирку и добавить 15 мл 4x LSB для вестерн-блот анализа.

2. Экстракция РНК

  1. Добавить в каждого образца одним объемом 8 М гуанидина-HCl и двух объемов 100% этанола. Vortex и инкубировали в течение по крайней мере 2 ч при -20 ° C.
  2. Центрифуга образцов при 10000 мкг в течение 20 мин при 4 ° C. Удалите супернатант. Будьте осторожны, как осадок может быть неустойчивым.
  3. Вымойте гранул с 70% этанола.
  4. Ресуспендируют гранул с 400 мл РНКазы без воды и переноса образца в новую пробирку Эппендорфа.
  5. Осадок РНК снова добавлением 0,1 объема 3 М ацетат натрияэ рН 5,2 и два тома 100% этанола. Vortex и инкубировали в течение по крайней мере 2 ч при -20 ° C.
  6. Центрифуга образцов при 20000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и мыть с 70% этанола.
  7. Воздух сухой гранул и ресуспендируют с РНКазы воды. Образцы магазин РНК при -80 ° C. Образцы могут быть использованы для северной анализа 19 или микрочипов анализа 18 (см. Протокол 3).

3. Подготовка РНК для Microarray анализа

  1. Ресуспендируют мРНК с шага 2.2 с 650 мл РНКазы свободной воды.
  2. Чтобы удалить остатки ДНК или белки, добавить равный объем (650 мл) кислого фенола: хлороформ (5:1, рН 4,7) и вихрь энергично. Центрифуге при максимальной скорости в течение 2 минут.
  3. Передача 500 мл верхней фазы (водной фазы) в новую пробирку. Избегайте интерфазу, так как она содержит ДНК. Также будьте осторожны с фенол, который может ингибировать реакции обратной транскрипции. </ Li>
  4. Образец РНК содержит значительное количество гепарина, который является мощным ингибитором обратной транскриптазы. Таким образом, для RT-PCR или микрочипов маркировки она должна быть удалена. Удалить гепарин по LiCl осадков: добавить LiCl до конечной концентрации 2 М, а нагрев образцов в течение ночи при -20 ° C.
  5. Оттепель образцов при 4 ° C и центрифугируют при 20000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
  6. Осторожно удалите супернатант и мыть гранул с 80% этанола. Центрифуга снова, как описано на стадии 3.5.
  7. Жидкость над осадком сливают, высохнуть на воздухе и вновь суспендируют таблетку в 150 мл РНКазы воды.
  8. Чтобы удалить остатки LiCl, осадок снова с 0,1 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,3 и 3 объемов 100% этанола. Выдержите при -20 ° С в течение не менее 2 часов.
  9. Центрифуге при максимальной скорости в течение 20 мин при 4 ° C. Промыть тщательно прозрачную гранул с 80%-ным этанолом и сушат на воздухе.
  10. Ресуспендируютосаждения с 25 мл РНКазы без воды и сохранить образцы при -80 ° C.
  11. Следуйте инструкциям для РНК маркировки и гибридизации, описанной в 18,20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол позволяет разделение на митохондрии, содержащие фракции из цитозольных компонентов. Лучший способ проверить свой ​​успех является выполнение северную анализ и западную анализ (рис. 1) с образцами из разных стадий выделения. Три параметры качества изоляции являются производными от этих анализов. Во-первых, является ли целы РНК или белки в образцах - это будет обнаружен как отдельных полос в анализах. Деградация события будут вызывать появление дополнительных, более короткие полосы или мазков. Во-вторых, сравнивая сигналы от каждого шага с сигналом от входа (т.е. Total) обеспечивает важную информацию относительно потерь при подготовке. Тяжелые потери будут наблюдаться как существенной разницы между общей и относительного количества сигнала. Наконец, и самое главное, качество разделения между митохондриальной и цитозольных компонентов может быть определена. Выделение интактных mitochondriприведет сигнала для митохондриально-транскрибируемой стенограмма только в митохондриях фракции, а не в цитозольной фракции (рис. 1А). Кроме того, белки, которые митохондрий, связанные появится помощью вестерн-блоттинга только в митохондрии фракции и цитозольных белков в цитозольной фракции (рис. 1В).

На рисунке 1 показано два дополнительных результатов, которые являются стандартными для этого протокола: во-первых, объединение ядерных кодировке мРНК с митохондриями колеблется между генами. Можно видеть, что ACO1 мРНК, которая кодирует белок митохондрий, появляется в основном в митохондриях фракции, в то время как мРНК, кодирующей белок цитозольного актина (С1) в основном в цитозольной фракции (рис. 1в). Генома анализы показали вариации среди многих генов 8,10,21,22 и основы для этого разнообразия находится под обширных исследований. Во-вторых, значительное количество ER связанных материил являются coisolated в митохондриальной фракции. МРНК, кодирующей Sec61, что ER-связаны, детектируется Нозерн-блот (рис. 1А) и ER-мембранного белка Cue1 обнаружении помощью вестерн-блоттинга (фиг. 1В). Это может быть результатом известных физических контактов между ЭР и митохондрий. В то время как дальнейшая очистка митохондрий можно, это может ввести некоторые ограничения; они обсуждаются в обсуждении.

Рисунок 1
Рисунок 1. . Проверка качества изоляции Качество проверяется на образцах, взятых в трех представительных этапов процедуры: Перед фракционирования (Всего [шаг 1,20], Т; цитозольный фракция [шаг 1,22], С, а также митохондриальная фракция [шаг 1,24], М). Образцы подвергали Нозерн-анализ (. A, C) или вестерн-анализ (B)) Нозерн-анализ по следующим мРНК: ХОБ является РНК, которая транскрибируется в митохондриях, следовательно, его сигнал должен быть исключительно в митохондриях. Его появление во фракции C укажет митохондрий лизиса во время подготовки. ACT1 является мРНК, которая кодирует белок цитозольную, и, следовательно, переведена на цитозольными рибосом и появляется в основном на C фракции. ACO1 является мРНК, которая кодирует белок, который импортируется в митохондрии, и появляется в основном на митохондрии фракции. Sec61 является мРНК, которая кодирует белок ER резидента; его присутствие во фракции М указывает на присутствие компонентов ER в этой фракции. Нижняя панель представляет метиленового синего окрашивания северной мембраны, является которой два рРНК (18S и 25S) обнаруживаются. Эта панель показывает, что значительное количество рибосом появляются в M фракции. Б) Западная анализа для followiнг белки: Por1 является митохондрии белок наружной мембраны, следовательно, его сигнал ожидается только во фракции М. Сигнал во фракции C предложит диссоциации митохондриальных компонентов в процессе приготовления. Hxk1 является цитозольный белка и Cue1 является белок ER. Оба доклад о copurification этих фракций с митохондрий фракции. Rpl39 является рибосомных белков, снова демонстрируя наличие рибосом в обеих фракциях. Панель "Rpl39 без восстановления", представляет фракционирование рибосом, когда протокол исключается на стадии восстановления (шаг 1,14). C) Северная анализа для CCP1, мРНК, которая кодирует белок, который импортируется в митохондрии. Весь гель представлены для демонстрации отсутствие коротких, деградация-возникла полос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Технологические достижения в визуализации уступил инструменты с высоким разрешением для изучения локализации мРНК. Сегодня можно измерить движение даже одной молекулы мРНК в мс масштабе времени 23-26. Тем не менее, традиционные биохимические методы, как описана выше, также информативным и являются предпочтительными в некоторых случаях. Биохимические изоляция позволяет очистку большого репертуара мРНК и белков, и, следовательно, предпочтительным для генома исследования. В одном изоляции, можно получить достаточные уровни мРНК чтобы позволить характеристику тысяч генов, либо микрочипов ДНК или РНК-SEQ 18,27. Параллельно можно выделить белки и выполнить протеомный анализ для характеристики протеома на митохондрии 28. Биохимические фракционирование может быть приспособлен, чтобы отделить митохондрии от других клеточных органелл, в частности ER 29. Это может быть предпочтительным в некоторых типах клеток были высокое пространственное перекрытиемежду ЭР и митохондрий препятствует микроскопическая локализация анализов. Важным преимуществом биохимических фракционирования является их низкая стоимость, что позволяет анализ различных образцов. Связанный с этим преимуществом является их простота - биохимические фракционирование, как описана выше, как правило, не требуют трудоемкого флуоресцентного мечения мРНК, как это имеет место в в естественных условиях исследования изображений. Наконец, много подводных камней и артефакты уже диагноз для этих традиционных протоколов, поэтому необходимые элементы управления хорошо известны.

Представленный протокол влечет за собой шаг восстановления (шаг 1,14), который следует за лечение zymolyase. Этот шаг имеет решающее значение, потому что стресс, вызванный во время лечения zymolyase приводит к почти немедленному поступательного ареста и диссоциации рибосом »от мРНК. Фактическая триггером для рибосом диссоциации может любой из шагов, которые включали в этом лечении, а именно удаления источника углерода, выставкахЮр высокой г во время центрифугирования, обработки восстановителей (DTT), удаление клеточной стенки на zymolyase или внедрения высоких осмотических условий, каждый из них, как известно, вызывают поступательное арест. Это поступательное сердца, вероятно, влияет на ассоциацию с рибосомами митохондрий. Соответственно, мы обнаружили, что мРНК объединение митохондрий с низка после zymolyase обработки, и увеличивается во время восстановления (не показан).

Митохондриальной фракции, которые выделяют этого протокола содержит значительное количество ER, как это видно из присутствии различных маркеров ER (например, рисунок 1). Очевидным является желание дальнейшего удаления компонентов ER и получить чистый митохондрии, с использованием одного из нескольких стандартных протоколов, которые используют градиенты 29-33. Тем не менее, эти протоколы требуют зачистки рибосом митохондрий, либо в связи с напряженной лечения zymolyase (рис. 1В (т.е. когда рибосомы реассоциировать с митохондрии), оба ER и митохондрии маркеры осаждали в той же фракции. Это, вероятно, потому что соответствующие рибосомы скрывать различия в их плотности (данные не показаны). Таким образом, для исследования рибосомы ассоциации, альтернативные методы изоляции митохондрий будет необходимо разработать.

Для многих исследований, однако, присутствие компонентов ER не обязательно проблематичным. Ассоциация мРНК, которые кодируют устоявшихся митохондриальные белки (например,Аконитазы, ATP2, Oxa1), вероятно, будет с митохондриями и не компонента ER в этой сырой подготовки. Поэтому рекомендуется использовать один из этих типичных митохондриальных мРНК как показаний для воздействия на митохондрии. Белки, которые не были проверены в качестве митохондриального не следует использовать в качестве репортеров, что важно, в частности, когда генома мРНК исследования проводятся (например, анализ микрочипов), а MIS-назначенные мРНК может вводить ошибку.

Основной технической задачей этого протокола минимизации деградации мРНК. При использовании РНКазы реагенты всегда советовал, следует помнить, что при лизиса клеток огромное количество РНКазы которые развязали в раствор. Гепарин является очень эффективным ингибитором РНК-азы и добавляется в значительных количествах. При больших объемах экстракт готовят, его относительно низкая стоимость обеспечивает дополнительное преимущество по сравнению с другими ингибиторами РНКазы. Гепарин однако, также ингибирует обратный транскриптазы, и, следовательно, должен быть удален по исследований, включающих такую ​​ферментативную активность (например, RT-PCR или ДНК-микрочипов маркировка). Здесь мы представляем процедуру удаления, основанный на LiCl осадков (шаги 3.4-3.10). Это осадков эффективно удаляет гепарин, но, видимо, также значительное количество мРНК, будут потеряны. Кроме того, существуют различные спин-колонки, которые должны снять гепарин из образцов РНК, но у нас был ограниченный успех с этим.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим доктора. Эрез Элиягу, Даниэль Меламед, Ophry Сосны и Дорон Рапапорт за помощью и комментарии во время создания этого протокола. Эта работа финансируется ISF (грант № 1193/09).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose Do not autoclave Galactose
Growth medium For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T 20,000 U/g
Recovery medium Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparin
1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8 M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate, pH 5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Bromophenol blue
4x LSB 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
  2. Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
  3. Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
  4. Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
  5. Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
  6. Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
  7. Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
  8. Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
  9. Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
  10. Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
  11. Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
  12. Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
  13. Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
  14. Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
  15. Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
  16. Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
  17. Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
  18. Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
  19. Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
  20. Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
  21. Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
  22. Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
  23. Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
  24. Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
  25. Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
  26. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
  27. Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
  28. Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
  29. Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
  30. Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
  31. Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
  32. Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. 8, (2001).
  33. Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).

Tags

Биохимия выпуск 85 митохондрии локализация мРНК дрожжи, Микрочипов локализованы перевод биохимические фракционирования
Выделение мРНК, связанных с митохондриях дрожжей для изучения механизмов локализованных перевода
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lesnik, C., Arava, Y. Isolation of… More

Lesnik, C., Arava, Y. Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation. J. Vis. Exp. (85), e51265, doi:10.3791/51265 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter