Summary
Hier beschreiben wir einen Arbeitsablauf für die schnelle Analyse und Erforschung von Sammlungen Fluoreszenzmikroskopiebilder mit PhenoRipper, eine kürzlich entwickelte Bild-Analyse-Plattform.
Abstract
Trotz der raschen Fortschritte in der Hochdurchsatz-Mikroskopie, quantitative Bild-basierte Assays stellen immer noch erhebliche Herausforderungen. Während eine Vielzahl von Fachbildanalyse-Tools zur Verfügung, die meisten traditionellen Bild-Analyse-basierte Workflows haben steile Lernkurven (für die Feinabstimmung der Analyse-Parameter) und führen zu langen Laufzeiten zwischen Abbildung und Analyse. Insbesondere Zellsegmentierung, der Prozess der Identifizierung einzelner Zellen in einem Bild ist ein Flaschenhals in dieser Hinsicht.
Hier präsentieren wir Ihnen eine alternative, zellfreie Segmentierung Workflow basierend auf PhenoRipper, einem Open-Source-Software-Plattform für die schnelle Analyse und Exploration von Mikroskopie-Aufnahmen ausgelegt. Die hier vorgestellte Pipeline für Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Aufnahmen von Zellkulturen optimiert und erfordert nur minimale Benutzereingriffe. Innerhalb einer halben Stunde können PhenoRipper Daten aus einer typischen 96-Loch-Experiment analysieren und Bildprofile. Benutzer könnendann visuell ihre Daten zu erforschen, führen die Qualitätskontrolle auf ihren Versuch sicherzustellen, Reaktion auf Störungen und überprüfen Reproduzierbarkeit der Wiederholungen. Dies ermöglicht eine schnelle Feedback-Zyklus zwischen Analyse und Experiment, das während der Assay-Optimierung entscheidend. Dieses Protokoll ist nützlich, nicht nur in einem ersten Pass-Analyse für die Qualitätskontrolle, sondern kann auch als End-to-End-Lösung verwendet werden, insbesondere für das Screening. Die hier beschriebene Arbeitsablauf skaliert, um große Datenmengen, wie sie durch Hochdurchsatz-Screens erzeugt und wurde zur Gruppe experimentellen Bedingungen Phänotyp genau über einen weiten Bereich von biologischen Systemen gezeigt worden. Die PhenoBrowser Schnittstelle bietet eine intuitive Rahmen, um die phänotypische Raum zu erkunden und beziehen Bildeigenschaften, biologische Anmerkungen. Zusammengenommen wird die hier beschriebenen Protokoll, die Hindernisse für die Annahme quantitative Analyse von Bild-Screens senken.
Introduction
In den vergangenen zehn Jahren haben rasche Fortschritte in der Bildgebung Technologie viele Labors angesichts der Möglichkeit, Hochdurchsatz-Mikroskopie durchzuführen. Die Herausforderung ist nun von einer der Abbildungs einem der Analyse verschoben. Wie können wir zu charakterisieren, zu vergleichen, und erkunden Sie die Flut von komplexen und doch subtil Phänotypen durch eine typische Hochdurchsatz-Imaging-Bildschirm erzeugt?
Eine Reihe von Bildanalyse-und Informatik-Plattformen haben die Nutzer anspruchsvolle Toolboxen 1-3 für das Extrahieren von Informationen aus großen biologischen Sammlungen von Bildern gegeben. Doch viele bleiben erhebliche Hindernisse bei der Analyse von Daten aus Hochdurchsatz-Image-basierte Bildschirme. Schwierigkeiten mit der Auswahl geeigneter Charakterisierungen der Bilder und die Feinabstimmung der algorithmischen Parameter (zum System der Zinsen) beteiligt oft in langen Rüstzeiten, insbesondere für Anwender ohne Bildanalyse-Know-how führen. Insbesondere Zellsegmentierung, der Prozess der Identifizierung von Einzelzellen imBild n, ist ein Engpass in dieser Hinsicht. Segmentierung kann sehr empfindlich auf experimentellen Parameter wie Zelltyp, Zelldichte und Biomarker sein und erfordert häufig wiederholte Einstellung für eine große Datenmenge. Aus diesen Gründen ist die Bildanalyse häufig eine unabhängige Terminal Schritt durch Spezialisten und nicht integrierter Bestandteil des Versuchsablauf durchgeführt. Dies schließt die schnelle Feedback-Zyklus zwischen Analyse und Experiment, ein entscheidender Teil der Assay-Entwicklung.
Hier beschreiben wir einen alternativen Workflow, der für Hochdurchsatz-Fluoreszenz-Mikroskopie optimiert ist und vermeidet viele der oben genannten Schwierigkeiten. Dazu nutzen wir PhenoRipper 4, einem Open-Source-Software-Plattform für die schnelle Erforschung und Analyse von Mikroskopie-Bilder. Bezeichnenderweise PhenoRipper vermeidet viele der Herausforderungen, mit Zell Segmentierung nach nicht versuchen, einzelne Zellen zu identifizieren beteiligt. Stattdessen teilt PhenoRipper Bilder in PixelBlöcke von subzellulären Größe und charakterisiert Bilder in Bezug auf die Blöcke, die sie enthalten. Insbesondere PhenoRipper Profile Blöcke in Form von Marker-Kolokalisation-basierten Funktionen und identifiziert vier repräsentativsten Blocktypen in den Trainings Bilder automatisch ein. PhenoRipper ordnet dann jedem Block am ähnlichsten repräsentatives Blocktyp und schließlich charakterisiert Bilder basierend auf den Typen der Blöcke, die sie enthalten.
Im Vergleich zu herkömmlichen Single-Cell-basierte Ansätze erfordert dieser Ansatz minimale Feinabstimmung und Know-how. Als solche müssen die Anwender lediglich zwei Parameter: die Blockgröße und eine Schwellenintensität (bis zellulären Teile eines Bildes zu verwerfen), die beide mit grafische Rückmeldung gesetzt. Wichtig ist, dass die hier beschriebene Arbeitsablauf hat sich gezeigt, 4 leicht, viel größere Datenmengen, bei denen die Geschwindigkeit und minimale Feinabstimmung bietet große Zeitgewinne und Zuverlässigkeit zu skalieren. In der Praxis finden wir, dass diese AppPlötze reduziert die Zeit sowohl für das Setup und läuft durch mehrere Größenordnungen 4 erforderlich.
Die primäre Ausgabe des PhenoRipper ist eine visuelle Darstellung von Bildähnlichkeit, die dem Benutzer ermöglicht, Gruppen von Versuchsbedingungen, die Zellen zu ähnlichen Phänotypen führen anzuzeigen identifizieren. Die Gruppierungen PhenoRipper findet typischerweise vergleichbare "biologische Interpretierbarkeit" zu den von zeitaufwendiger, zellbasierte Verfahren 4 erzeugt. In der Praxis bedeutet dies, dass häufig innerhalb einer halben Stunde von der Durchführung einer typischen 96-Well-Fluoreszenzmikroskopie Experiment, ein Experimentator ohne vorherige Bildanalyse-Erfahrung kann eine zuverlässige Anzeige über die Leistung seines Experiments zu bekommen. Der Experimentator kann dann beginnen die Erkundung der Beziehungen zwischen den verschiedenen Versuchsbedingungen und in Bezug auf diese Beziehungen Bild Phänotypen.
Wir zeigen diesen Workflow hier durch die Analyse der Auswirkungenvon Drogen in verschiedenen mechanistischen Klassen auf HeLa-Zellen für die DNA-und Zytoskelett-Marker gefärbt. Bilder von Zellen mit der gleichen Klasse von Medikamenten behandelt wurden, zusammengefasst und schlechte Bildqualität (Artefakte Färbung, unscharf Zellen und so weiter) erschien als Ausreißer, so dass sie leicht zu identifizieren und möglicherweise verwerfen.
Während dieser Arbeitsablauf ist für eine große Anzahl von bildbasierten Assays, sind offensichtlich viele Situationen, in denen ein anderer Ansatz könnte informativer. Zum Beispiel ist der Ausgang von PhenoRipper hauptsächlich ein relativer Vergleich der Fluoreszenzmuster in den experimentellen Bedingungen. Wenn ein Absolut Charakterisierung eines bestimmten Einzelzellan anstelle erforderlich ist (zum Beispiel die Anzahl der Flecken in einer Zelle) würde eine Einzelzell-basierte Analyse erforderlich. Dennoch, auch in dieser Art von Situation ist PhenoRipper wahrscheinlich Veränderungen in diesen Einzelzellen-Phänotypen erkennen und daher ein nützliches Instrument zur Analyse opti seinmierung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereiten Proben und Imaging
- Zellkultur
- Split Kulturen routinemäßig und zu halten, bei 20-70% Konfluenz. Einen Tag vor dem Experiment, wachsen HeLa-Zellen in DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle Medium, siehe Tabelle der Materialien) und mit 10% FBS (Fetal Bovine Serum) und 1x Penicillin / Streptomycin.
- Am Tag des Experiments geteilten Zellen, die in Kultur (ca. 50% konfluent).
- Waschen der Zellen mit PBS (Phosphate Buffered Saline) freizulegen, um etwa 2 ml Trypsin / EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) für einige Sekunden. Saugen Sie überschüssige Trypsin / EDTA und halten Zellen in einem dünnen Film von Trypsin / EDTA in der Kapuze bei RT für ca. 3 Min. gebadet.
- Mechanisch Kolben zweimal schütteln und lösen Zellen mit Serum Medien. Zählen von Zellen und verdünnt auf 5.000 Zellen/50 ul Medium und sofort Platte 50 ul / Vertiefung auf einer Bodenplatte 384-Well-Glas mit Hilfe eines automatisierten Liquid-Handling-Roboter (nur 30 guts der Platte verwendet werden, hier).
- Inkubieren Platte bei Raumtemperatur 30 min auf Randeffekte in den Vertiefungen 5 zu minimieren. Nach RT Inkubation Ort Platten in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator über Nacht.
- Jedes Medikament wird doppelt getestet werden. Hinzufügen von 25 ul Arzneimittel mit den entsprechenden Vertiefungen auf der Platte bereits enthaltenden Medien.
- Fix Platte mit 4% Paraformaldehydlösung in PBS bei 24 h nach der medikamentösen Behandlung.
- Die Färbung
Die spezifischen primären Antikörpern, fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper und andere fluoreszierende Flecken, die hier verwendet wurden, sind in Tabelle von Materialien aufgeführt.- Durchdringbar fixierten Zellen mit 0,2% Triton X-100-Lösung in TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung) für 3 min, und wasche mit TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung + Tween 20) 3x. Plus 5% BSA (Rinderserumalbumin) in TBST-Lösung zum Blockieren.
- Inkubieren Platte bei RT für 2 Stunden und dann mit TBST 3x waschen.
- Machen primären Antikörper DILUTIonen in 5% BSA in TBST (siehe Tabelle der Materialien) und fügen Sie 10 ul /. Inkubieren Platte bei RT für 2 Stunden, und dann waschen 3x mit TBST.
- Machen sekundären Antikörper dilutionin 5% BSA in TBST (siehe Tabelle der Materialien) und fügen Sie 10 ul /.
- Inkubieren Platte im Dunkeln bei RT für 2 Stunden und dann zweimal mit TBST waschen.
- Verdünnungen für Hoechst und Phalloidin (siehe Tabelle der Materialien) in PBS und fügen Sie 10 ul /.
- Die Platte in der Dunkelheit für 30 min bei RT.
- Nach 2 TBST Waschanlagen, Deckplatten in Folie und bei 4 ° CO / N.
- Imaging
Erwerben Sie Bilder mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskop mit einem 20fach-Objektiv mit 1x1 Binning-Kamera. Erwerben sechzehn Bilder für jeden gut, für insgesamt 480 Bilder (x3 Kanäle).
2. Analyse Images
Downloaden und installieren Sie PhenoRipper von phenoripper.org und starten PhenoRipper um die Analyse der ima beginnenges. PhenoRipper unterstützt derzeit TIFF, PNG und JPEG und alle anderen von MATLAB unterstützten Formate (Mikroskop-Software unterstützen in der Regel den Export in TIFF).
2.1 Laden von Daten
- Kein Standard-Namens / Organisation Konvention für Mikroskopie-Bilder, die das Laden von Bildern und Zuordnen von Metadaten machen existiert (dh experimentellen Annotation wie Art der Behandlung, gut Nummer und so weiter) der schwierigste Teil des Workflows. Wählen eines der vorgestellten Verfahren (unten beschrieben).
- PhenoLoader: Wählen Sie diese Option, um semi-automatisch zu laden, Daten, wenn der Dateiname und / oder Verzeichnisstruktur enthält genügend Informationen, um Gruppenbilder wie gewünscht (zB B16 HeLa_Drug5-DAPI.png könnte darauf hindeuten, dass das Bild von gut B16, werden die Zellen behandelt mit der Droge, deren ID 5, und das Bild fängt die Kern DAPI-Färbung - mit dieser Namenskonvention konnten alle Bilder von A1 oder auch mit Medikamenten behandelt, 5 leicht zusammengefasst werden). Der Assistent wirdführen den Benutzer Schritt für Schritt, um Metadaten mit Bildgruppen zuordnen und definieren die Marker wie folgt:
- Klicken Sie auf "Dateistruktur", um zum Fenster PhenoLoader zugreifen.
- Klicken Sie auf "Definieren Root Directory", um das Verzeichnis, das die Bilddatensatz zu wählen. Dann für die Analyse (optional, kann leer gelassen werden) die Dateien auswählen, die nicht verwendet werden (nicht verwendete Dateien).
- Klicken Sie auf "Definieren Marker", um die im Experiment verwendeten Biomarker geben und sie mit den Bildern. Insbesondere, klicken Sie auf eine Bilddatei und wählen Sie dann einen Teil des Dateinamens, die die Biomarker eindeutig identifiziert. Schließlich geben Sie einen Namen für die einzelnen Biomarker.
- Klicken Sie auf "Definieren von Metadaten", um Informationen mit jedem Bild zuordnen. Insbesondere, klicken Sie auf eine Bilddatei, und wählen Sie dann einen Teil des Dateinamens identifiziert Bildinformationen (zB "B16" für das Wohl Name). Ein Fenster fragt nach einem Gruppennamen (zB "Wirll ") erscheint, geben Sie einen Namen ein. Mitglieder der Gruppe aus dem Dateinamen extrahiert wird auf dem Gruppentisch (gezeigt werden, z. B. die vollständige Liste der gut Namen). Um nicht im Dateinamen vorhanden zusätzliche Informationen hinzuzufügen, klicken Sie auf" (optional) Weiter ". Klicken Sie auf" Hinzufügen von Metadaten-Gruppe ", geben Sie das zusätzliche Gruppennamen (z. B." Drug ") und für jeden Wert der vordefinierten Gruppe (zB" Gut "), geben Sie seinen Wert (zB" Taxol ") . Es gibt keine Begrenzung für die Anzahl der zusätzlichen Gruppen, die hinzugefügt werden können.
- Anschließend klicken Sie auf "Erstellen MetaDataFile", um die Metadaten-Datei zu erzeugen, und weiterhin die. Wenn eine Metadatendatei vorher erzeugt wurde, können die oben beschriebenen Schritte durch direkte Laden der Datei mit der Option "Metadaten Datei" (in 3 unten beschrieben) vermieden werden.
- Regular Expression Basierend Vorlagen: Reguläre Ausdrücke sind ein Standardansatz für die passenden Musternin Text. Wählen Sie diese Option, wenn der Dateiname und / oder Verzeichnisstruktur enthält genügend Informationen, um Gruppenbilder und die Namenskonvention mit einem der bereits vorhandenen Vorlagen. Benutzerdefinierte Vorlagen basierend auf regulären Ausdrücken können auch manuell definiert und wiederverwendet werden. Diese erweiterte Option ist nur für Benutzer mit regulären Ausdrücken vertraut empfohlen.
- Metadaten Datei: Wählen Sie diese Option für die ultimative Anpassbarkeit. Definieren und laden eine durch Komma getrennte Werte (CSV)-Datei mit Dateinamen und Metadaten mit jedem Bild zugeordnet. Ein Beispiel für das Dateiformat ist auf der Download-Teil der Website (phenoripper.org) zur Verfügung. Laden Sie einfach die Datei über die Schnittstelle, um die darin enthaltenen Informationen anzuzeigen.
- PhenoLoader: Wählen Sie diese Option, um semi-automatisch zu laden, Daten, wenn der Dateiname und / oder Verzeichnisstruktur enthält genügend Informationen, um Gruppenbilder wie gewünscht (zB B16 HeLa_Drug5-DAPI.png könnte darauf hindeuten, dass das Bild von gut B16, werden die Zellen behandelt mit der Droge, deren ID 5, und das Bild fängt die Kern DAPI-Färbung - mit dieser Namenskonvention konnten alle Bilder von A1 oder auch mit Medikamenten behandelt, 5 leicht zusammengefasst werden). Der Assistent wirdführen den Benutzer Schritt für Schritt, um Metadaten mit Bildgruppen zuordnen und definieren die Marker wie folgt:
- Wählen Sie das Feld Metadaten, die Wiederholungen definiert, in dem Versuch, um redundante Probenahme zu vermeiden. Für Datensätze, die Wiederholungen (zB alle Bilder in einem gut ähnlich sein sollten) enthalten, zusammen Gruppierung (zB durch gut) kann improve Leistung. In den meisten Fällen ist es sinnvoll, die Standardoption "Random (weiß nicht)", die eine Teilmenge wählt zufällig zu wählen.
2.2 Einstellen von Analyseparametern
Klicken Sie auf "Set Parameter", die erforderlich ist, um die Datenmenge zu verarbeiten Parameter definieren. Die Parameter zu definieren, sind auf der linken Seite durch. Das rechte Bild zeigt eine zusammengeführte Stichprobe des Datensatzes. Klicken Sie auf die Pfeile links / rechts, um zwischen den verschiedenen Bildern zu wechseln.
- Threshold Intensität: Wählen Sie einen geeigneten Schwellenwert auf rund identifizieren die Zellbereiche (statt der Hintergrund, zellulären Regionen) der Bilder. Ein Schwellenwert wird durch PhenoRipper vorberechnet, kann aber angepasst werden, um Hervorhebung von Zellregionen zu verbessern mit Hilfe der Bildlaufleiste auf der Oberseite des Bild werden. Wenn eine gewählte Schwelle nicht auf allen Bildern zu arbeiten, die Schwelle so zellulären Regionen anstatt abzufallen zellulären Regionen zu schließen.
- Block-Size: Wählen Sie eine geeignete Blockgröße (in Pixeln) der Netz das Bild. Blöcke der bestimmten Größe auf dem Bild überlagert werden. Passen Sie die Blockgröße auf einen Durchschnitt von 20 bis 30 Blöcke / Zelle zu erhalten. Um das Gitter auf das Bild, klicken Sie auf das Kästchen vor dem Feld "Block Size" überlagern.
- Optionale Parameter: Wenn die Auto-skalierte Bilder nicht Marker mit der gewünschten relativen Intensitäten (zB eine Farbe gesättigt ist) anzeigen oder wenn Markierungen müssen von der Analyse fallen gelassen werden, verwenden Sie das "Anpassen Kanal Intensity"-Option. Um zelluläre Regionen identifizieren auf einer Teilmenge von Markern benutzen Sie die "Kanäle für Threshold verwendet"-Option. Standard-Optionen der anderen Parameter sind in der Regel ausreichend, aber wenn nötig, mit Hilfe der "Advanced Analysis Options" anpassen.
- Führen Sie die Analyse durch Drücken von "PhenoRip" auf der Hauptplatte. PhenoRipper automatisch wiederkehrende Blocktypen in den Bildern zu identifizieren. Phänotypische Profile werden für erzeugt werdenjedes Bild auf der Basis der Anteile der verschiedenen Blocktypen darin.
3. Explo Ergebnisse
- Entdecken Sie die Beziehungen zwischen den phänotypischen Profile der Bilder mit der PhenoBrowser (Abbildung 1). Die PhenoBrowser Schnittstelle besteht aus vier Tafeln: die linke obere Platte ist eine grafische Darstellung (Streudiagramm) der relativen Ähnlichkeit zwischen verschiedenen Bilder / Bedingungen, die beiden Platten auf der rechten Display-Beispiel-Bilder von ausgewählten Bedingungen und der abschließenden Podiums (Balkendiagramm ) vergleicht deren phänotypische Profilen.
- "Verwerfen Leere Frames" über das Menü "Datenverarbeitung".
- Entfernen Bildern schlechter Qualität: Erstens, um zu studieren einzelne Bilder auszuschalten Gruppierung aus dem Menü "Datenverarbeitung". Weiter, klicken Sie durch die Ausreißerpunkte in der Punktwolke und entsorgen Bilder von niedriger Qualität (zB unscharf, Artefakt-Färbung).
- Entdecken Sie die Daten: Entscheiden Sie, welche Metadaten-Feld definierteine Grundeinheit des Vergleichs (zB Medikamente vergleichen, Bilder mit dem gleichen Wert des Feldes Metadaten "Arzneimittel" müssen zusammen gruppiert werden). Alles Bilder mit dem gleichen Wert dieses Metadatenfeld in einem einzigen Datenpunkt mit "Group By". So wird beispielsweise Gruppierung von Drogen die Bilder innerhalb jedes Medikament durchschnittlich einen Punkt pro Medikament zu erhalten. In der Nähe (oder fernen) Punkte in der Punktwolke reflektieren Bedingungen, die ähnlich (oder unähnlich) zellulären Phänotypen hervorrufen. Farbe oder Etikett Punkte (Datenanzeige-Menü) auf der Grundlage verfügbarer Metadaten Interpretierbarkeit unterstützen. Die 3D-Darstellung ist durch Klicken auf das "drehbar" Kontrollkästchen, und klicken Sie auf die linke Taste und Ziehen mit der Maus über sie drehbar.
- Wählen Sie zwei verschiedene Punkte, um sie direkt zu vergleichen. Die Bildtafeln werden Beispielbilder für jeden Punkt anzuzeigen, und das Balkendiagramm Panel werden die Blocktypen, deren Auftreten Frequenzen sind die meisten Unterschiede zwischen den beiden Punkten zu zeigen.
- Starten Sie die clustergram von der "Clustergram Menü", um eine globale Sicht der Beziehung zwischen Satzarten und experimentellen Bedingungen. Durch das Gruppieren beide Blocktypen und Bedingungen, hebt diese Darstellung der zellulären Phänotypen, die am besten zu unterscheiden Gruppen von Bedingungen (Abbildung 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier testeten wir die Fähigkeit dieses Workflow Gruppe Medikamente auf ihren Wirkmechanismus. HeLa-Zellen wurden in 30 Wells einer 384-Well-Platte ausgesät und DNA / Aktin / α-Tubulin gefärbt. Die spezifischen primären Antikörper, fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper und andere Fluoreszenzfarbstoffe, die verwendet wurden, sind in Tabelle aufgeführten Materialien. Wells wurden mit 15 Drogen zu drei mechanistische Klassen (Histon-Deacetylase-hemmende, Mikrotubuli-Targeting und DNA-schädigende) für 24 h und abgebildet mit einem Epifluoreszenzmikroskop bei 20X Objektivvergrößerung gehört, behandelt. Sechzehn Bilder wurden für jede gut erworben, für insgesamt 480 Bilder (x3 Kanäle). Die hier beschriebenen Daten können von www.phenoripper.org heruntergeladen werden.
Wie oben beschrieben, wurde PhenoRipper verwendet, um diese Bilder zu analysieren. Der Vordergrund Schwelle wurde auf 5% (dh 5% der maximal möglichen Intensität) und die Blockgröße auf 20 Pixel (Figur eingestellt e 2). Die Analyse dieses Datensatzes dauerte etwa 10 Minuten auf einem Standard-Desktop-Computer (64-Bit-, 8-Core-Maschine mit 3,2 GHz mit 16 GB RAM). Die PhenoBrowser Schnittstelle (Abb. 3) wurde verwendet, um die Ergebnisse zu untersuchen. Imaging-Artefakte wie schlechte Färbung und leere Rahmen waren leicht zu identifizieren, da sie stand als klare Ausreißer (Abbildung 4). Die relativen phänotypischen Ähnlichkeiten zwischen den Bildern werden in der oberen linken Teil von Abbildung 3 mit multidimensionalen Skalierung visualisiert. Jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Bild von der eigenen Medikamentenwirkmechanismus gefärbt. Dieser Plot zeigt, dass die phänotypische Profile können Gruppen von Medikamenten ihres Wirkmechanismus verwendet werden. Ein clustergram der Daten (Fig. 5) bezieht sich diese Anordnung auf die phänotypische Profile.
s/ftp_upload/51280/51280fig1.jpg "width =" 600px "/>
Fig. 1 ist. Workflow für die Fluoreszenzmikroskopie mit PhenoRipper. Zelllinien sind in einer Platte ausgesät, dann werden Störungen in jede Vertiefung gegeben und die Platte wird inkubiert. Die Bilder werden mit einem automatisierten Mikroskop erworben und dann schnell mit PhenoRipper analysiert. So werden Ergebnisse der aktuellen Experiment kurz nach Bildgebung bekannt und können, falls erforderlich, verwendet, um das Setup für künftige Iterationen verfeinern. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. Einstellen PhenoRipper Parameter: Blockgröße und Schwellenintensität sind über eine grafische Oberfläche mit Echtzeit-visuelle feedbac eingestellt k. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. PhenoBrowser Schnittstelle für PhenoRipper Ergebnisse zu entdecken: PhenoBrowser Schnittstelle ist in vier Bereiche unterteilt: die linke obere Panel ist ein Streudiagramm die Anzeige der relativen Ähnlichkeiten zwischen verschiedenen Bilder / Bedingungen, die zwei Platten auf der rechten Display-Beispiel-Bilder von ausgewählten Bedingungen und der linken unteren Panel vergleicht deren phänotypische Profilen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
load/51280/51280fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51280/51280fig4.jpg "width =" 600px "/>
4. Beispiel für einen Ausreißer in der Punktwolke (markiert), die ein Artefakt-Färbung (siehe Video). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
5. Clustergram Darstellung PhenoRipper Profilen: Jede Zeile steht für ein einziges Medikament, und jede Spalte ein Bausteintyp. Die Grauwerte spiegeln die phänotypische Profile, also der Anteil der verschiedenen Blocktypen für jede Droge. Ein Feuerzeug Wert bezeichnet eine höhere Bruchteil dieser Blocktyp. Hierarchical Clustering der verschiedenen Drogen durch Drogenklasse (rot / blau / gr weitgehend trennteen Farbe auf der rechten Seite). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die hier beschriebene Workflow ermöglicht eine schnelle und einfache Charakterisierung und Vergleich der Mikroskopie-Bilder. Wir haben zuerst gezeigt, wie dieser Workflow kann Experiment Optimierung, beispielsweise helfen, indem sie schnell die Qualitätskontrolle auf Mikroskopie-Aufnahmen. Weiter haben wir gezeigt, das Potential für die Analyse von Hochdurchsatz-Screening-Daten: Wir konnten Gruppe Medikamente auf ihren Wirkmechanismus. Die Gruppierung von Medikamenten vergleichbar war gefunden mit komplexeren Methoden 6, obwohl PhenoRipper war Grßenordnungen schneller.
Obwohl wir diesen Ansatz robust gegen sporadische experimentellen Schwankungen gefunden haben, als mit jedem Bild basierten Ansatz wird Anzeigen durch die systematische nichtbiologischen Effekte beeinflusst sein. Zum Beispiel kann die Platte zu Platte Variation Marker Intensität die biologischen Effekte von Interesse maskieren. Die Auswirkungen derartiger Artefakte können durch entsprechende Korrekturen 7, 8 reduziert, wie pspät, um Platte Normalisierung und Hintergrund-Subtraktion. Die von PhenoRipper erzeugten Profile können auch durch Änderungen in der Zelldichte beeinflusst werden. Während dieses Verhalten ist in der Regel erwünscht (reflektierend Überleben oder Wachstum), kann seine Wirkung durch un-Auswahl der Option "Hintergrund-Informationen" unter "Erweiterte Parameter" reduziert werden.
Bei der Wahl der geeigneten Methode für die Analyse, müssen die Benutzer den Kompromiss zwischen Geschwindigkeit, Benutzerfreundlichkeit und das Niveau der analytischen Detail zu betrachten. Segmentierung freie Verfahren wie PhenoRipper 9-11 sind in der Regel schneller und einfacher zu bedienen als einzelne Zell-basierte Methoden wie CellProfiler 2. Der Nachteil der Segmentierung freie Verfahren ist die Unfähigkeit, bestimmte Einzelzelleigenschaften zu quantifizieren. Der Benutzer muss daher auf die entsprechende Ansatz, der auf seine oder ihre Bedürfnisse zu entscheiden. Wenn genauer Vergleich oder Gruppierung der Versuchsbedingungen ist das Hauptziel haben wir gefunden, dass die Höhe derDetail PhenoRipper gefangen ist mehr als ausreichend. Insbesondere untersuchten die Forscher Hochdurchsatz-Experimente werden stark von der Fähigkeit, die Bilddaten schnell und einfach zu erkunden profitieren. Abschließend wird die hier vorgestellte Workflow ermöglichen Bank Wissenschaftler leicht nach Erwerb erkunden ihre Fluoreszenzmikroskopiebilder und bald einen schnellen Turn-around zu erleichtern zwischen Analysen und Bildgebung. Wir glauben, dass dieser Workflow wird die Barriere der Durchführung quantitativer Bildanalyse senken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Adam Coster und alle anderen Mitglieder der Altschuler und Wu Labors für hilfreiche Rückmeldungen und Diskussionen. Diese Forschung wurde durch das National Institute of Health gewährt R01 GM085442 und CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW) und die Welch Foundation I-1619 (SJA) und I-1644 (LFW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used: 20 μM | ||
| Colchicine | concentration used: 0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used: 0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used: 0.2 μM | ||
| M344 | concentration used: 20 μM | ||
| MS-275 | concentration used: 5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used: 0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used: 0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used: 0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used: 70 μM | ||
| Taxol | concentration used: 0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used: 0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used: 0.3 μM |
References
- Collins, T. J.
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J.
- Shamir, L., et al. Wndchrm - an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).
