Summary
La medida de resultado primaria en los ensayos clínicos de trastornos neuromusculares en general se mejoró la función muscular. Por lo tanto, la evaluación del efecto de los compuestos terapéuticos potenciales sobre el rendimiento muscular pre clínica en modelos de ratón es de gran importancia. Se describen varias pruebas funcionales para abordar esta cuestión.
Abstract
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es un músculo severa y progresiva perder trastorno para el que no hay cura disponible. Sin embargo, varios compuestos farmacéuticos potenciales y estrategias de terapia génica han progresado en los ensayos clínicos. Con la mejora en la función muscular es el punto final lo más importante en estos ensayos, mucho énfasis se ha puesto en la creación de fiable, reproducible y fácil de realizar pruebas funcionales de comprobar la validez clínicamente evaluar la función muscular, la fuerza, la condición y la coordinación en la modelo de ratón mdx de la DMD. Ambas pruebas invasivas y no invasivas disponibles. Los exámenes que no agraven la enfermedad pueden ser usados para determinar la historia natural de la enfermedad y los efectos de las intervenciones terapéuticas (p. ej. Prueba de la fuerza de agarre de la extremidad anterior, dos pruebas que cuelgan diferentes utilizando ya sea un cable o una rejilla y rotarod ejecución). Alternativamente, forzada la cinta rodante puede ser utilizado para mejorar la progresión de la enfermedad y / o evaluarefectos protectores de las intervenciones terapéuticas en patología de la enfermedad. Se describen cómo realizar estas pruebas funcionales más utilizadas de una manera fiable y reproducible. El uso de estos protocolos basados en procedimientos operativos estándar permite la comparación de datos entre diferentes laboratorios.
Introduction
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es la enfermedad neuromuscular más común que afecta a 1:5.000 varones recién nacidos. Esta enfermedad pérdida de masa muscular severa y progresiva es causada por mutaciones en el gen de la DMD que alteran el marco de lectura abierto y previenen la síntesis de la proteína distrofina funcional. Las fibras musculares que carecen de distrofina son vulnerables al daño inducido por el ejercicio. En caso de agotamiento de la capacidad de regeneración del músculo, y debido a la inflamación crónica del músculo dañado, fibras son reemplazadas por tejido conectivo y grasa, que posteriormente conducen a una pérdida de la función. En general, los pacientes con DMD pierden la deambulación de los miembros inferiores primeros en la segunda década. Más tarde, también los músculos de los brazos y la cintura escapular son afectados y los pacientes a menudo desarrollan escoliosis toracolumbar debido al debilitamiento asimétrica de los músculos que sostienen la columna vertebral. La ventilación asistida se requiere generalmente en la adolescencia o veinteañeros. Respiratorio y el corazón de plomo fracasoa la muerte en la tercera o cuarta década 1.
Aunque el gen causante se ha descubierto hace más de 25 años 2, no existe una cura disponible para la DMD. Sin embargo, la mejora de la atención de salud y el uso de corticosteroides han aumentado la esperanza de vida en el mundo occidental 3. Con el uso de modelos animales como el ratón mdx, grandes avances en el descubrimiento de posibles estrategias terapéuticas se han hecho. El ratón mdx es el modelo de ratón DMD más utilizado. Tiene un punto de mutación en el exón 23 del gen murino Dmd y, en consecuencia carece de distrofina 4. Durante el último par de años, muchas de las estrategias propuestas han progresado en los ensayos clínicos 5-9. En estos ensayos, la mejora de la función muscular es el criterio principal de valoración, que subyace a la importancia de probar el beneficio de los compuestos sobre la función muscular en ratones durante la etapa de pre clínica de las pruebas.
Como DMDpacientes, también las fibras musculares negativas distrofina de ratones mdx son vulnerables al daño inducido por el ejercicio y la función muscular se deteriora en comparación con los ratones de tipo salvaje C57BL/10ScSnJ. Este deterioro se puede evaluar con una variedad de pruebas funcionales. Algunas de estas pruebas son no invasivos y no interfieren con la patología muscular (por ejemplo, la fuerza de prensión de la extremidad anterior, las pruebas que cuelgan y rotarod ejecución). Por lo tanto pueden ser utilizados para controlar la historia natural de la enfermedad o para determinar los efectos de los compuestos sobre la progresión de la enfermedad. Para obtener una imagen en profundidad de la influencia de los compuestos sobre la función muscular en ratones mdx, un régimen de ensayo funcional que no interfiera con la progresión de la enfermedad que consiste en todas estas pruebas se puede utilizar 10.
Alternativamente, forzada la cinta rodante puede ser utilizado para exacerbar intencionalmente progresión de la enfermedad y probar las capacidades de protección de compuestos 11. La cinta también puede serutiliza como medida de resultado en el que tiempo de funcionamiento hasta el agotamiento se mide 12, o como una herramienta para los ratones mdx de fatiga para que rinden menos en una prueba de funcionamiento posterior garantizar mayores diferencias en el rendimiento entre los grupos de tratamiento 13. Al elegir las pruebas funcionales, su efecto sobre la progresión de la enfermedad se debe tener en cuenta especialmente cuando se prueba los ratones distróficos como el ratón mdx 14.
Se describen en detalle cómo realizar las pruebas funcionales más utilizadas de una manera fiable y reproducible sobre la base de los procedimientos de operación estándar disponibles de la red TREAT-NMD. Haga clic aquí para visitar TREAT-NMD .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los experimentos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Ética Animal (DEC) del Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC). Los ratones fueron criados por el animalario del LUMC y se mantienen en jaulas ventiladas individualmente con 12 ciclos de oscuridad luz hr. Tenían acceso ad libitum al agua y al pienso estándar.
Al realizar alguna de las pruebas funcionales se describen a continuación, las condiciones experimentales tienen que ser estrictamente controlada para reducir la variación. Preferiblemente, edad y sexo ratones emparejados deben utilizarse, como el rendimiento se diferencia entre la edad y sexos. Los ratones pertenecientes a la misma camada deben ser asignados al azar en los grupos experimentales. Los animales deben ser probados por el mismo operador, que está ciego a los grupos experimentales. Las pruebas deben realizarse en el mismo momento del día y día de la semana, la misma sala para igualar olores, ruidos, etc 14 gran variación entre los ratones individuales y puntos de tiempo se observa para todospruebas funcionales, por lo tanto / deberían utilizarse grupo experimental 6-8 ratones. Rendimiento de la prueba funcional también puede diferir en gran medida entre las diferentes cepas de tipo salvaje endogámicas. Por lo tanto, los ratones de tipo salvaje experimentales y de control deben siempre han fondos correspondiente (en el caso de los ratones mdx utilizar el C57BL/10ScSnJ cepa de tipo salvaje). Todos los datos que se describen aquí se han obtenido con la C57BL/10ScSnJ cepa de tipo salvaje, al cual nos referimos como el tipo salvaje de aquí en adelante. Los ensayos descritos aquí se pueden utilizar longitudinalmente desde al menos 1-19 meses de edad en los ratones de tipo salvaje y mdx. Las pruebas no deben repetirse más de una vez por semana para evitar que los ratones de la pérdida de interés y voluntad para llevar a cabo la tarea.
1. Prueba de fuerza de agarre Miembro Anterior
Utilice la prueba de fuerza de agarre de la extremidad anterior para medir la fuerza de las extremidades anteriores. La prueba se basa en la tendencia de un ratón para captar instintivamente una cuadrícula cuando se suspenden por la cola 15, y ADAPTEd de DMD_M2.2.001.pdf .
- Aparato creó: Coloque una cuadrícula a un transductor de fuerza, que mide la fuerza máxima aplicada por el ratón en la parrilla durante el tirón. Asegúrese de que el ajuste es el modo de tensión máxima (T-PK) para tirar. Las unidades de fuerza puede ajustarse en cualquiera de oz-de-force, gramos-de-force, libras-de-force, kilogramos-de-force, o Newtons.
Nota: Nosotros preferimos trabajar con gramos como unidad de valores. Metros múltiples están disponibles comercialmente, pero sólo transductores axiales dan resultados confiables como transductores de fuerza del tipo de palanca son influenciados negativamente por las leyes físicas del efecto palanca. Cualquiera de una rejilla o un triángulo no flexible se pueden utilizar con las barras que son de 1-2 mm de diámetro. - Antes de la prueba, evaluar el peso corporal del ratón, para permitir la normalización de peso corporal.
- Utilice gramos como unidad de valores. Restablecer el contador al inicio de cada recording.
- Retire el ratón de su jaula por el acaparamiento de la cola y se mueve horizontalmente hacia la rejilla.
- Compruebe que el ratón agarra la rejilla firmemente con ambas patas delanteras.
- Tire del ratón fuera de la cuadrícula de modo que su alcance se ha roto, la fuerza máxima aplicada a la red se mostrará en la pantalla del transductor, que puede ser de forma manual o automáticamente registrado.
- Sólo tome tirones en cuenta en la que el ratón muestra resistencia al experimentador. Rechazar medidas en las que sólo una pata delantera, o los miembros posteriores se utilizan y en el que el ratón se convirtieron durante el tirón.
- Deje que el ratón tirar la red tres veces en una fila y luego regresar en la jaula por un período de descanso de al menos un minuto Nota:. Entre las series de tira de un periodo de descanso es necesario para que el ratón para recuperarse y evitar la formación de hábitos.
- Entonces deje el ratón realizar cuatro series de intentos, cada uno seguido por un breve periodo de descanso. De esta manera el mouse ha retirado un total de 15x (3 tirones x 5 veces = 15 tirones).
- Determinar la fuerza máxima de agarre y normalizar para el peso corporal tomando el promedio de los tres valores más altos de los valores recogidos 15.
- Opcional: Determinar la fatiga mediante el cálculo de la disminución entre la media de las dos primeras y las dos últimas series de tirones 1 2 3 = A, 4 5 6 = B, 10 11 12 = C y 13 14 + 15 = D. La fórmula: (C + D) / (A + B) da un valor de 1 para los ratones que no están fatigados. Esto puede ser expresado en porcentajes de manera que un ratón sin fatiga tiene un valor de 0% y un ratón que extremidades anteriores están completamente fatigado tiene un valor de 100%.
2. Colgando Pruebas
Con las pruebas de colgantes, el equilibrio, la coordinación y la condición muscular puede evaluarse. Estas pruebas se basan en el conocimiento de que los ratones están deseosos de permanecer colgado de un alambre o rejilla hasta el agotamiento 16. Hay dos pruebas colgantes distintivos en el que en el inicio de la prueba, ya seasólo se utilizan los dos miembros delanteros o las cuatro extremidades, utilizando un alambre o rejilla, respectivamente. La prueba de clasificación utilizando el cable y la red son el método de tiempo de suspensión más largo adaptado de DMD_M.2.1.004.pdf y DMD_M.2.1.005.pdf respectivamente. Un límite colgando fijo se utiliza de 600 seg. La mayoría de los ratones de tipo salvaje puede colgar de 600 seg, mientras que los ratones distróficos no puede. Para reducir el gasto de tiempo de realizar esta prueba, un tiempo máximo colgante se puso en su lugar. Los ratones que caen del alambre o rejilla hasta entonces se les da un máximo de dos intentos más. Esto se hace para reasegurar que los ratones son realmente incapaces de pasar el rato y no se caen debido a la torpeza.
- Colgando de prueba con dos extremidades
- Aparato establecido: Asegure firmemente a 2 mm de espesor de metal percha de paño a un estante con cinta y mantener la suspensión de alrededor de 370; cm por encima de una capa de ropa de cama. Nota: como alternativa, a 55 cm de ancho mm de alambre metálico 2 de espesor que está bien conectado entre 2 soportes verticales se podrían utilizar. La distancia de 37 cm es suficiente para alentar a los ratones permanecer colgante, pero también suficientemente baja para evitar que los ratones de lesiones al caer hacia abajo. El alambre no debe vibrar o desplazar durante la prueba ya que esto podría interferir con el rendimiento del ratón.
- Manejar el ratón a través de la cola y llevarlo cerca del alambre.
- Deje el ratón Tome el alambre con los únicos dos patas delanteras, y bajar las patas traseras de una manera tal que el ratón solamente cuelga con las dos patas delanteras en el alambre (Figura 2B).
- Directamente en marcha el cronómetro cuando se suelta el ratón. Después de la liberación, los ratones fuertes tratan de atrapar el cable con las cuatro extremidades y la cola, que se permite (Figura 2C).
- Cuando un ratón muestra un comportamiento inadecuado (como el equilibrio sobre o deliberadamente saltar el alambre como shcompra en las Figuras 2D y 2E), abordar directamente esta reemplazando el ratón sobre el alambre sin detener el temporizador.
- Cuando un ratón cae del alambre, parar el cronómetro y registre el tiempo que cuelga.
- Cuando los ratones son capaces de pasar de 600 seg, apáguelo el alambre y devolverlos a la jaula. Los ratones que caen antes de que este límite se les da un máximo de dos intentos más.
- Registre el tiempo máximo de clasificación (es decir, el más largo de los ensayos) y utilizar este para su posterior análisis.
- Colgando de prueba con cuatro extremidades
- Aparato creó: Utilice una mano hecha cuadrado o la tapa de una jaula grande para una rata o conejo para esta prueba. Coloque la rejilla de 25 cm por encima de la ropa de cama suave para evitar que los ratones se dañen al caer, sino también para disuadir a los ratones para saltar intencionalmente fuera de la red. Asegure firmemente la rejilla de modo que el experimentador no tiene que sostener manualmente la red durante el experimento, ya que estos movimientos podría yonterfere con el rendimiento del ratón.
- Coloque el ratón sobre la cuadrícula para que se agarra con sus cuatro patas.
- Invierta la cuadrícula de modo que el ratón está colgando y empezar directamente el temporizador.
- La sesión de prueba termina para los ratones que son capaces de colgar para una duración de 600 seg. Dale ratones que caen fuera de la red a principios de un máximo de dos intentos más.
- Utilice el tiempo máximo de clasificación (es decir. El más largo de los ensayos) para su posterior análisis.
3. Ejecución de Rotarod
Con la fuerza muscular rotarod prueba, la coordinación, el equilibrio, y el estado se pueden determinar 17.
- Aparato de configurar: Para esta prueba, ratones tienen que ejecutarse en un tubo giratorio. Asegúrese de que la velocidad constante se ha fijado en 5 rotaciones por minuto (rpm), y que la velocidad aumenta 5-45 rpm en los primeros 15 segundos cuando comenzaron. Después de esto, tiene que mantener su velocidad.
- Coloque el ratón sobre el tubo del rodillo giratoriocuando se gira a una velocidad lenta y constante de 5 rpm. Cinco ratones se pueden probar simultáneamente.
- Inicie la carrera una vez que todos los ratones se colocan. Dentro de los primeros 15 segundos de la velocidad del tubo acelera 5-45 rpm después de lo cual se mantiene esa velocidad.
- Supervisar la ejecución. El tiempo de ejecución se registra de forma continua por el software. Tiempo de proyección se detiene automáticamente cuando un ratón se cae del tubo, ya que activa la barra de tiempo de posicionado por debajo del tubo. Volver a colocar los ratones que giran alrededor de frente a la dirección opuesta en el tubo mientras se ejecuta sin detener el tubo para girar.
- Finalice la sesión de pruebas para los ratones que son capaces de correr durante un tiempo de 500 seg. Dale ratones un máximo de dos intentos más lo que les permite mejorar su tiempo de funcionamiento, cuando se caen antes.
- Utilice el tiempo de funcionamiento máximo (es decir, el más largo de los ensayos) para su posterior análisis.
4. De esfuerzo
Lacinta de correr se puede utilizar de tres maneras como una herramienta en la investigación clínica previa. En primer lugar, obligó a la cinta rodante se puede utilizar para agravar la patología de la enfermedad tal como se describe en este protocolo (véase también: DMD_M2.1.001.pdf ). En segundo lugar, la capacidad de funcionamiento máxima de los ratones y los efectos de los tratamientos sobre este se puede evaluar (Véase, por el método de dejar que los ratones se ejecutan hasta el agotamiento DMD_M.2.1.003.pdf ). Por último, la cinta rodante se puede utilizar antes de la otra prueba de funcionamiento de agotar el ratón para que realice menos bien en la segunda prueba 13. Esto se hace mediante el ejercicio de los ratones dos veces o tres veces a la semana como se describe a continuación, seguido directamente por cualquiera de una de las pruebas funcionales descritos en el protocolo de 1-3.
- Aparato creó: Hay varias máquinas disponibles en el mercado en el que varios ratones puede ruN simultáneamente y para el cual se puede ajustar la elevación, la duración y la velocidad. Algunas cintas de correr están equipados con una rejilla para suministrar descargas de baja intensidad para estimular los ratones a correr. Sin embargo, los ratones mdx son sensibles al estrés y pueden ser fácilmente motivados de una manera más amigable con un suave empujón con la mano en el sentido de la marcha. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente a NO utilizar la cuadrícula de shock. En general, la estimulación con la mano sólo es necesaria durante la primera sesión en ejecución.
- Coloque el ratón en la cinta horizontal.
- Inicie la cinta de correr a una velocidad de marcha de 12 m / min. Las velocidades más bajas (8 m / min) deben ser utilizados en ratones viejos (> 15 meses), donde las velocidades más altas conducen fácilmente al agotamiento.
- Durante la primera sesión, alentar a los ratones para ejecutar presionando suavemente cuando están cerca del final de la cinta.
- Cuando los ratones se han quedado con una duración de 30 minutos, colocar de nuevo en su jaula.
- Repita esto dos veces por semana durante por ejemplo 12 semanas. Permitir períodos de descanso cuando sea necesario. Por ejemplo, algunos ratones mdx tienen que dejar de correr y se les debe permitir descansar durante unos minutos. Si esto ocurre, apague la correa para sacarla, dar todos los ratones de un período de descanso de dos minutos, gire el cinturón durante dos minutos a 4 m / min. Después de esto, aumentar la velocidad a 12 m / min y permiten a los ratones para terminar el protocolo. Es importante que todos los ratones completar todo el protocolo de funcionamiento.
Nota: En el caso de los ratones mdx necesitan períodos de descanso, considere un calentamiento antes del protocolo de ejercicio de 30 min. Esta sesión de calentamiento consta de: un período de aclimatación de 2 min a una velocidad de 4 m / min, inmediatamente seguido por un calentamiento 8 min a 8 m / min.
En nuestras manos 4-16 semanas de edad ratones mdx hembras son capaces de completar el protocolo de ejercicios de 30 minutos sin descanso. Otros han informado de que en la edad coincide ratones mdx masculino 45% de los ratones no necesitan periodos de descanso para terminar el ejercicio. El protocolo de calentamiento a reducirs la cantidad de paradas 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La fuerza de agarre de la extremidad anterior de tipo salvaje y ratones mdx aumenta entre la edad de 4-12 semanas y reduce de nuevo en ratones de más edad. Deficiencias en vigor ya se pueden observar en los ratones mdx jóvenes. Los datos representativos de 9 semanas de edad ratones hembra se muestran en las Figuras 1A y 1 B. Aunque la fatiga no difiere entre las cepas aún a esta edad, los ratones mdx son más débiles que los ratones de tipo salvaje. No tenemos datos aún sobre fatigabilidad en mdx de edad avanzada y los ratones de tipo salvaje.
Para obtener resultados fiables y reproducibles, múltiples evaluaciones deben llevarse a cabo por el mismo investigador. Se describen a tirar 15 veces / individual, sin embargo los números más pequeños de tirones (tan bajo como 5 veces) también proporcionan datos fiables. La atención cuidadosa debería señalarse a la colocación de las patas en la red ya que esto puede influir en gran medida los resultados. Durante la extracción, sólo las dos patas delanteras deben ser utilizados y que tienen que be colocado muy bien junto a la otra (Figura 1C). Cuando el ratón no muestra la resistencia a la tracción, el valor no debe ser tomado en cuenta.
Para las dos pruebas de las extremidades y cuatro colgantes extremidades, sobre todo jóvenes (4-16 semanas de edad) ratones de tipo salvaje pueden llegar fácilmente al tiempo máximo colgante de 600 seg. En contraste, el desempeño de los ratones mdx jóvenes se ve afectada (que casi nunca alcanzan el máximo tiempo de colgar) y también se deteriora con la edad, a pesar de que ambas cepas poner todo el esfuerzo en la realización de estas pruebas cuelgan en sus mejores habilidades (Figuras 2A y 3A). Las mayores diferencias en los tiempos que cuelga entre los ratones de tipo salvaje y mdx se obtienen con el alambre. Por lo tanto, incluso los pequeños tamaños del efecto de los compuestos sobre la función muscular pueden ser detectados utilizando esta prueba. Rendimiento de suspensión (o cualquier otro tipo de rendimiento) difiere dentro de y entre los individuos en el tiempo resultantes en bares alta desviación estándar. Nonetheless, los ratones mdx realizan sistemáticamente peor que la edad coincide con ratones de tipo salvaje (Figura 2A). La realización de varias evaluaciones puede dar una idea más detallada de las mejoras funcionales sobre el tratamiento que sólo mediciones de punto final. Se debe tener en cuenta que en la primera sesión de animales aprenden a realizar una prueba de funcionamiento. Esta curva de aprendizaje, que está presente en todas las pruebas, es claramente visible entre 4-6 semanas de edad. Sin embargo, porque los ratones crecen rápidamente también en este período de edad, una distinción entre la mejora debido al aprendizaje y / o el crecimiento no puede ser hecho. También se han encontrado diferencias de género en el rendimiento para colgar las dos extremidades colgar prueba. Rendimiento de ratones mdx hembra supera a la de los machos de ~ 100 seg, y el rendimiento de la cinta de correr desafiado hembra ratones mdx es casi comparable a la de los machos no impugnados (compárense las Figuras 2A con 4A). Este hallazgo subraya la importancia de utilizar una edadnd género coincide ratones para evitar el sesgo. Tenemos datos preliminares que sugieren que las diferencias en el rendimiento en las dos pruebas que cuelgan entre tipo mdx y silvestres incrementos en ratones muy vieja (18 meses) ratones.
Algunos ratones muestran una conducta inapropiada para evitar que cuelga en el alambre; mantener el equilibrio sobre el alambre, saltando del alambre deliberadamente etc (Figuras 2D y 2E), aunque la mayoría de los ratones cumplir con la prueba y pasar el rato con dos o cuatro extremidades ( Figuras 2B y 2C). De vez en cuando, los ratones fuertes saltan del alambre intencionalmente. Cuelgan antes de saltar con sólo las dos patas traseras y la cola en el cable y mirar hacia abajo para estimar la distancia al suelo. El comportamiento inadecuado que de vez en cuando se ve en la red durante la prueba de cuatro extremidades colgando consiste en saltar deliberadamente fuera de la red o la escalada en la parrilla. Todas las formas inadecuadas de comportamiento pueden ser easily distinguido y no debe permitirse. Los ratones que evitan que cuelga en una de estas formas deben ser colocados directamente de vuelta en el alambre o rejilla sin detener el temporizador.
Por rotarod, ratones mdx casi nunca funcionan para el tiempo de funcionamiento máximo de 500 segundos, mientras que una mayor proporción de los ratones de tipo salvaje do (Figura 3B). Con la edad, el rendimiento de carrera de ambas cepas disminuye. Algunos ratones son capaces de sujetar firmemente en el tubo giratorio y evitar correr por "rueda de carro" alrededor. Esto no se puede corregir y es una limitación grave de la prueba cuando varios ratones empiezan a hacer esto durante períodos prolongados, lo que aumenta la variación dentro de los grupos experimentales. Especialmente para algunos ratones que en parte se ejecutan y rueda de carro en parte, y durante la transición de volteretas en caída correr. Algunos ratones se dan la vuelta en el tubo giratorio mientras se ejecuta. Este comportamiento debe ser dirigida por el reposicionamiento directamente a los ratones en el tubo, cona detenerlo. También este tipo de comportamiento limita la utilidad de esta prueba.
Caminadora forzado correr es un ejercicio fácil y efectivo para exacerbar la patología de la enfermedad en ratones mdx no tratados, mientras que los ratones de tipo salvaje sometidos al mismo protocolo no se ven afectados. En general, los ratones se familiaricen con la cinta de correr después de una sesión de formación inicial y están dispuestos a correr, sobre todo cuando varios ratones se ejecutan simultáneamente. Ratones mdx viejos (más de 15 meses de edad) tienen dificultades en la marcha y no pueden hacer frente a la misma velocidad de desplazamiento de 12 m / min durante 30 min se utiliza para los ratones jóvenes. Por lo tanto, se recomienda una velocidad de marcha más lenta de 8 m / min durante 30 minutos que permite a todos los ratones que terminar todo el protocolo. Los ratones mdx son especialmente vulnerables a las contracciones excéntricas, sólo se puede utilizar para una corta duración, por lo tanto correr cuesta abajo.
Por otra parte, otras pruebas funcionales como la de dos hilos extremidad cuelga tEst. puede realizarse directamente después de ejecutar (Figura 4A). El uso de este diseño del estudio, las diferencias entre las cepas o los brazos de tratamiento son propensos a aumentar a medida que los ratones mdx no tratados caminadora impugnadas son menos capaces de realizar estas pruebas que los ratones mdx sedentario 13.
Como se mencionó anteriormente, en el estudio de la función muscular en ratones mdx, el C57BL/10ScSnJ cepa de tipo salvaje tiene que ser utilizado que es el antecedente genético correspondiente. Aconsejamos a este, ya que incluso entre cepas puras de tipo salvaje caminadora corriendo rendimiento difiere 18,19. Pero también en las pruebas funcionales no invasivas, el rendimiento funcional se ve influida por los antecedentes genéticos. Figura 5 ilustra esto en tres gráficos de representación donde el desempeño de los ratones mdx sobre un fondo BL/10 y sobre un fondo mixto formado por BL/10, BL/6J, DBA2 y 129OLA se comparan. Como se puede apreciar los ratones fondo mixtoun mejor desempeño en las pruebas de cables que cuelgan y peor en el cilindro giratorio.
Figura 1. La fuerza de agarre Extremidad anterior, los resultados representativos y el correcto posicionamiento de las patas. Fuerza de agarre A. Miembro Anterior normalizado para el peso corporal del mdx hembra 9 semanas de edad (n = 5) y de tipo salvaje (n = 4) ratones. La fuerza de agarre ya está alterada en los ratones mdx jóvenes. Los asteriscos indican p <0,05 y los datos se presentan como media ± st.dev. B. La fatiga de los mismos individuos, como se muestra en A, fue, en promedio, menos del 10% y no varía entre las cepas. C. Para obtener datos fiables, la atención debe ser pagado a la colocación de las patas durante el análisis de la fuerza de agarre del miembro anterior. La colocación correcta del ratón, dos patas delanteras están uno junto al otro, miembros posteriores are sin tocar la red y el ratón está tirando en línea recta D. La colocación incorrecta de las patas delanteras;. el ratón no está tirando en línea recta. Cuando esto sucede, o cuando se utilizan sólo una de las patas delanteras o también los miembros posteriores, el ratón se da la vuelta durante la extracción o carece de mostrar resistencia, los datos serán descartados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Dos pruebas extremidad colgantes, resultados representativos y comportamientos colgante apropiado e inapropiado. A. Un ejemplo representativo de la prueba de dos colgante extremidad realizado una vez por semana en MDX varones (n = 18, 4-10 semanas, n = 13, 11 y 12 semanas, n = 10, 13 semanas) y la edad y el género coincide con ratones de tipo salvaje (n = 6). Una curva de aprendizaje es visible para ambas cepas en las primeras semanas de la prueba. Rendimiento de ratones mdx era peor en comparación con la de los ratones de tipo salvaje. Los datos se presentan como media ± st.dev. El tiempo máximo permitido para colgar se indica por la línea de puntos. B. La posición correcta de inicio de esta prueba es con las dos patas delanteras. C. Dependiendo de la capacidad funcional del ratón también puede utilizar las extremidades posteriores y la cola. D y E. Un pequeño subconjunto de los ratones, especialmente fuertes ratones de tipo salvaje, de vez en cuando se puede evitar que cuelga por la escalada en las barras laterales o mantener el equilibrio sobre el alambre. Algunos ratones saltar intencionalmente por el cable. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
files/ftp_upload/51303/51303fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figura 3. Cuatro extremidades para colgar y rotarod ejecutar la prueba. A. Cuatro rendimiento extremidad cuelga evaluado una vez por semana en mdx masculino (n = 18, 4-10 semanas, n = 13, 11 y 12 semanas, n = 8 a 13 semanas) y de tipo salvaje ( n = 6) ratones. Con el tiempo, los ratones mdx cuelgan menos largo que los ratones de tipo salvaje. B. rotarod veces seguidas no difirió entre mdx jóvenes de sexo masculino (n = 18, 4-10 semanas, n = 13, 11 y 12 semanas, n = 10, 13 semanas ) y ratones de tipo salvaje (n = 6). Los datos se representan como media ± st.dev.
Figura 4. El efecto de la cinta de correr forzada corriendo protocolo de ejercicio en el rendimiento funcional y de la patología músculo esquelético en ratones hembras. Patología muscular fue deliberadamenteexacerbado por dejar que los ratones se ejecutan en una cinta de correr horizontal tres veces a la semana a 12 m / min durante 30 min para una duración de 12 semanas. Directamente después de ejecutar, los ratones tuvieron que participar en la prueba de dos extremidad colgante. Mientras que todos los ratones de tipo salvaje (n = 5) permanecen colgando hasta el máximo permitido, todos los ratones mdx (n = 6) se caen el alambre antes (p <0,001, datos que se presentan como media ± st.dev.). B. La presencia de daño de la membrana se determinó mediante la evaluación de los niveles plasmáticos elevados de creatina quinasa (CK) que se escapan de las fibras musculares a través de las lágrimas en la membrana. Los niveles de CK fueron elevados en los ratones mdx en comparación con ratones de tipo salvaje antes del ejercicio. De esfuerzo aumento inmediato los niveles (p <0,01 indican con asterisco, los datos se presentan como media ± st.dev.) En ratones mdx, mientras que se mantuvieron bajas en ratones de tipo salvaje. CD. Músculos de ratones mdx son muy vulnerables a la rueda de ejercicio, el empeoramiento patología de la enfermedad ampliamente unespués de varias semanas de funcionamiento. Estas tinciones hematoxilina y eosina de los cuádriceps de un nonexercised 16 semanas de edad (C) y la cinta de correr ejercido (D) mdx espectáculo ratón que extensa fibrosis y necrosis se desarrollan. E. Los músculos de los ratones naturales sometidos al mismo protocolo de funcionamiento no se ven afectados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Efecto de un fondo mixto en el rendimiento funcional en ratones mdx. Las diferencias en el rendimiento funcional genética influencia fondo. Para ilustrar esto, el rendimiento de MDX macho (BL/10 fondo, n = 18, 4-10 semanas, n = 13, 11 y 12 Weeks, n = 10, 13 semanas) y mdx (BL/10 mixto, BL/6J, DBA2 y 129OLA fondo, n = 5) ratones se comparó con el tiempo. rendimiento de la prueba extremidad cuelga A. Dos difirió significativamente entre las dos cepas. B. Cuatro resultados de las pruebas extremidad colgantes fueron ligeramente superiores en el fondo mixto ratones mdx. C. rotarod tiempos de funcionamiento también difieren ligeramente entre las cepas. Los datos se presentan como media ± st.dev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las pruebas funcionales que se presentan aquí son reproducibles, fácil de realizar y aplicable a la de tipo salvaje y ratones distróficos con independencia de su edad. Las pruebas proporcionan herramientas útiles para pre clínicamente evaluar la función muscular, la fuerza, condición, y la coordinación. Al probar los efectos de un compuesto sobre la historia natural de la enfermedad, las pruebas no invasivas describen aquí (fuerza de agarre de la extremidad anterior, ambas pruebas colgantes y la prueba de rotarod) puede ser muy bien combinarse en un régimen de prueba funcional donde se llevan a cabo estas pruebas en días consecutivos . Estos protocolos no son perjudiciales para los ratones mdx y se pueden utilizar de una manera longitudinal 10. Se debe tener en mente que los resultados de cada una de estas pruebas se generan por diferentes o se solapan parcialmente los grupos de músculos en lugar de un músculo individual. Por lo tanto, se recomienda el uso de una combinación de varias pruebas para obtener una imagen más completa y por lo tanto un mejor conocimiento de la funcionalidad de la experienciagrupos mentales. Alternativamente, las mejoras funcionales de un músculo único pueden evaluarse usando mediciones de fisiología muscular 20.
Al igual que las pruebas de comportamiento, también pruebas funcionales pueden mostrar una amplia variación entre los diferentes ratones, o dentro de un ratón entre las diferentes evaluaciones. Para reducir la variación, todas las pruebas deben ser realizadas por el mismo investigador que esté familiarizado con los ratones. Las variables externas, como los olores y los sonidos de la habitación, la hora del día y el día de la semana en que se realiza el examen debe mantenerse lo más constante posible. Los ratones deben ser de género y emparejados por edad. Al utilizar carrera en cinta rodante para exacerbar la progresión de la enfermedad, es imprescindible el uso de un protocolo estandarizado en el que todos los parámetros de deslizamiento (tiempo de funcionamiento, la velocidad y la pendiente) se mantienen constantes en el tiempo para todos los grupos experimentales, de modo que todos los ratones son tratados por igual. Aunque la mayoría de los ratones están dispuestos a participar en las pruebas funcionales y la mayoría de los animales muestran altaniveles de disposición, algunos ratones (principalmente fuerte ratones de tipo salvaje) de vez en cuando a evitar la realización de la conducta de prueba y demostración de evitación. Cuando este comportamiento no se corrige, falsas conclusiones se pueden extraer 21. Afortunadamente, este tipo de comportamiento sólo se observan ocasionalmente y pueden ser corregidos por colocando el ratón de nuevo en el alambre, rejilla o rotarod, o tirar otra vez en el metro de la fuerza de agarre.
Las mejoras en una prueba de funcionamiento (por ejemplo, colgando la función muscular evaluar la prueba) no necesariamente tienen que cooperar ocurre con las mejoras en la otra prueba (fuerza de agarre de la extremidad anterior evaluación de la fuerza muscular única). En ratones mdx, las mejoras en la función muscular pueden distinguir antes que en la fuerza muscular. Esto también se observa en los pacientes con DMD que participan en ensayos clínicos en los que las mejoras clínicamente significativas en la prueba de marcha de 6 min no co-ocurrir con las mejoras en la fuerza muscular 6,7. Sin embargo, esto puede, en parte, dependen sobre el mecanismo de trabajo del compuesto probado y es posible que otros compuestos mejorar la fuerza y no la función. Por lo tanto, los resultados de las pruebas deben ser interpretados con el mecanismo de acción del compuesto en mente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Margriet Hulsker por su ayuda fotográfico y ayudar en la obtención de imágenes de los ratones y los revisores por sus comentarios muy constructivos. Este trabajo fue apoyado por ZonMw, TREAT-NMD (número de contrato LSHM-CT-2006 hasta 036.825) y el Proyecto de Padres de Duchenne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse grip strength meter | Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) | # 80529 | |
| Hanging wire 2 limbs device | Cloth hanger or custom made device | ||
| Hanging wire 4 limbs device | Lid of rat cage or custom made device | ||
| Rotarod | Ugo Basil | # 47600 | |
| Treadmill for mice Exer 3/6 | Columbus Instruments | # 1055SRM |
References
- Blake, D. J., Weir, A., Newey, S. E., Davies, K. E. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 9, 77-93 Forthcoming.
- Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A., Moore, K. J. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81, 1189-1192 (1984).
- Bowles, D. E., et al. Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Mol. Ther. 20, 443-455 (2012).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 Forthcoming.
- Goemans, N. M., et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 364, 1513-1522 (2011).
- Malik, V., et al. Gentamicin-induced readthrough of stop codons in Duchenne muscular dystrophy. Ann. Neurol. 67, 771-780 (2010).
- Skuk, D., et al. First test of a "high-density injection" protocol for myogenic cell transplantation throughout large volumes of muscles in a Duchenne muscular dystrophy patient: eighteen months follow-up. Neuromuscul. Disord. 17, 38-46 (2007).
- van Putten, M., et al. A 3 months mild functional test regime does not affect disease parameters in young mdx mice. Neuromuscul. Disord. 20, 273-280 (2010).
- De Luca, A., et al. Gentamicin treatment in exercised mdx mice: Identification of dystrophin-sensitive pathways and evaluation of efficacy in work-loaded dystrophic muscle. Neurobiol. Dis. 32, 243-253 (2008).
- Radley-Crabb, H., et al. A single 30min treadmill exercise session is suitable for 'proof-of concept studies' in adult mdx mice: A comparison of the early consequences of two different treadmill protocols. Neuromuscul. Disord. , (2011).
- van Putten, M., et al. The effects of low levels of dystrophin on mouse muscle function and pathology. PLoS.One. , (2012).
- Willmann, R., et al. Enhancing translation: Guidelines for standard pre-clinical experiments in mdx mice. Neuromuscul. Disord. 1, 43-49 (2011).
- Connolly, A. M., Keeling, R. M., Mehta, S., Pestronk, A., Sanes, J. R. Three mouse models of muscular dystrophy: the natural history of strength and fatigue in dystrophin-, dystrophin/utrophin-, and laminin alpha2-deficient mice. Neuromuscul. Disord. 11, 703-712 (2001).
- Rafael, J. A., Nitta, Y., Peters, J., Davies, K. E. Testing of SHIRPA, a mouse phenotypic assessment protocol on Dmd(mdx) and Dmd(mdx3cv) dystrophin-deficient mice. Mamm. Genome. 11, 725-728 (2000).
- Chapillon, P., Lalonde, R., Jones, N., Caston, J. Early development of synchronized walking on the rotorod in rats. Effects of training and handling. Behav. Brain Res. 93, 77-81 (1998).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Lerman, I., et al. Genetic variability in forced and voluntary endurance exercise performance in seven inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 92, 2245-2255 (2002).
- Sharp, P. S., Jee, H., Wells, D. J. Physiological characterization of muscle strength with variable levels of dystrophin restoration in mdx mice following local antisense therapy. Mol. Ther. 19, 165-171 (2011).
- Klein, S. M., et al. Noninvasive in vivo assessment of muscle impairment in the mdx mouse model--a comparison of two common wire hanging methods with two different results. J. Neurosci. Methods. 203, 292-297 (2012).
