Abstract
C型肝炎ウイルス（HCV）は、世界の人口の3％に影響を及ぼし、慢性肝炎、肝硬変、および肝細胞癌を含む重篤な肝疾患を引き起こす。 HCVは、 フラビウイルス科に属するエンベロープRNAウイルスである。現在の治療は、十分に有効ではなく、有害な副作用を引き起こす。利用可能なHCVワクチンはありません。このように、継続的な努力は、ワクチン、より良い治療法を開発するために必要です。 HCV細胞培養系は、ウイルスの侵入、ゲノム複製、パッケージング、および出口を含むHCV増殖の様々な段階を研究するために重要である。提示現在の手順では、野生型intragenotype 2aのキメラウイルス、FNX-HCV、およびウイルス複製を研究するために、 ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を担持する組換えFNX-Rlucをウイルスを使用した。ヒト肝癌細胞株（ホ-7ベースの） インビトロでのトランスフェクションのために使用したのHCVゲノムRNAを転写した。無細胞培養上清を、タンパク質溶解物およびtotal RNAは、HCVの増殖を評価するために、トランスフェクション後様々な時点で採取した。 HCVゲノムの複製の状態は、定量的RT-PCRおよびHCVの存在を可視化する二本鎖RNAにより評価した。 HCVタンパク質の発現は、HCV NS3およびNS5Aタンパク質に特異的な抗体を用いてウェスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイによって確認した。培養上清およびウイルス力価に感染性HCV粒子を放出するRNAトランスフェクトされた細胞を測定した。ルシフェラーゼレポーターアッセイはHCVの複製レベルと感染性を評価するために利用した。結論として、我々は、HCVの複製サイクルの異なる段階を特徴付けるための種々のウイルス学的アッセイ法を提示する。
Introduction
C型肝炎ウイルス（HCV）は、肝硬変および肝臓癌を引き起こす。それは35万人が毎年1-3死んで全世界1.7億人々に影響を与えます。 HCVは、9.6kbのゲノムサイズを有するプラス鎖RNAウイルスである。 HCVゲノムは、タンパク質分解的に10ポリペプチドに様々な細胞およびウイルスのプロテアーゼによって切断され〜3,000アミノ酸残基の単一ポリタンパク質として翻訳される。 HCVはヘパシウイルス属に原型ウイルスで、 フラビウイルス科 4に属しています。暴露されると、HCVは、個人の80％に慢性感染を確立します。感染は、診断が肝劣化を防止する治療的介入を可能にすることができる主に無症候性かつタイムリーである。現在の治療は、部分最適で、ワクチンは5,6ありません。
C型肝炎の病因は1989年7に記載した。HCVの複製を研究するC型肝炎ワクチンおよび治療 の研究のために重要であるが、それがあった長い効率的なウイルス培養系の欠如によって妨げ。 HCVの分子クローンは、肝内接種8時チンパンジーにおける感染であることが示された。続いて、HCVサブゲノムレプリコンは、細胞培養系9,10におけるウイルスゲノムの複製段階を分析させ、これについて説明した。遺伝子型2aのHCVの発見は、JFH-1（日本劇症肝炎-1）を単離、細胞培養に感染することができる、HCV複製の研究11月13日のための新たな道を開いた。感染培養系をベース遺伝子型2a株JFH-1ベース間および内遺伝子型キメラウイルス遺伝子型1のHCVにも14〜18用意されています。
我々が正常タンパク質ドメインおよびシス作用RNAエレメント19,20の高分解能機能プロファイリングマップを得るために、JFH-1株およびHCV intragenotype 2aのキメラウイルスを使用している。これによれば、ここでは慣用的に使用可能にする効果的な培養システムを記載HCVの複製サイクルと宿主 - 病原体相互作用の様々な段階を研究。私たちは、ウイルスゲノムの複製とintragenotype 2aはHCVおよびウミシイタケルシフェラーゼに基づくレポーターHCVの新規の感染性を評価するために、ウイルス学的ア ッセイを提示する。
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Protocol
プロトコルの概要を図1に示されている。
1。細胞
- 10〜15％ウシ胎児血清（FBS）、10 mMの非必須アミノ酸、10mMのHepes、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100 mg / ml）を、および2mM L-グルタミンを含有する完全増殖培地を調製する。
- C型肝炎ウイルスの複製サイクルのインビトロ分析のための上記のサプリメントを含む完全な増殖培地中でホ- 7.5.1細胞の13を維持する。
- 5％のCO 2、37℃で指定された補足の増殖培地とホ- 7.5.1細胞で培養したウイルス株。
2ウイルスやプラスミド構築
- HCV RNAの相補DNA（cDNA）の形態を生成し、遺伝子操作を容易にするためのプラスミドベクターにクローニングする。注：日本の劇症肝炎1の発見は、JFH-1（遺伝子型2aのHCV）、HCVの研究のための批判的とされている単離主にHCVの複製サイクル11から13を研究するために使用。 JFH-1のHCVに基づく間およびintragenotypicキメラウイルスは、一般的に、研究14〜18で使用されています。合成intragenotype 2aのキメラウイルス、FNX-HCV、およびモノシストロンキメラレポーター株の構築は、19と建設の詳細は、このプロトコルの範囲を超えて先に説明した。
- それは（ヌクレオチド1から2878）J6CF親株（NCBIアクセッション番号AF177036）の、よう5'NTR、構造領域とP7とNS2非構造領域の一部が含まれてpFNX抗HCV intragenotype 2aのウイルスを使用して、よくJFH-1ウイルス株（NCBIアクセッション番号AB047639）の非構造部材として。注：FNX-HCVは、以前に報告された15 Jc1にintragenotype 2aのキメラHCVの配列に基づいて合成した。
- Rを挿入することで（ステップ2.2以上）pFNX-HCV株に基づいて、モノシストロニックキメラレポーターウイルス構築、pFNX-Rlucをを生成（NT 388と389の間）5 'NTRとコア遺伝子との間enillaルシフェラーゼ遺伝子。続いて、切断シグナルとして働くだろう口蹄疫ウイルス2A（F2A）ペプチド配列を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子およびその構築物のコア遺伝子を接続する。
- pFNX-HCVまたはpFNX-Rlucをウイルス背景のいずれかを使用して、RNAポリメラーゼ-ヌル（ポル·）ウイルス構築エンジニア。 、AAGのアミノ酸残基とこれらのウイルスの主鎖のいずれかの、NS5Bポリメラーゼ触媒残基、GDD（8615から8623をntのAA 2759年から2761年）を交換します。
3 インビトロのHCV RNA転写
- intragenotype 2aのキメラウイルスFNX-HCVおよびFNX-HCVルポールヌルウイルス複製（ 図2A）の評価のための（ポル·）は、HCVを使用してください。
- XbaI制限酵素でウイルスプラスミドを直線化して、平滑末端を生成するために、緑豆ヌクレアーゼで処理する。陰イオン交換クロマトグラフィーによって消化プラスミドを精製する。 oを整合性を検証fは、ゲル電気泳動（ 図2B）をアガロースにDNAを施すことにより、プラスミドを線状化。
- T7-RNAポリメラーゼを用いて線形化されたウイルスのプラスミドを転写。
- RNA精製キットを用いて新たに合成されたDNase処理RNAを精製する。
- アガロースゲル電気泳動（ 図2C）により、RNAの生産を確認してください。
- 分光測光法によりRNAを定量化する。
- 10μgの作業アリコートで-80℃で生成したRNAを保管してください。注：同じ時に各ウイルスのサンプルおよびコントロールのためのすべてのRNAを転写することにより、各実験計画の中にRNAの品質のばらつきを最小限に抑えます。
4。のHCV RNAのトランスフェクションおよび検体採取
- トリプシンを用いたHuh-7.5.1細胞を採取する。
- 細胞、遠心分離機をすすぎ、冷たい低血清培地で二回、サスペンションを再懸濁し。 ml当たり1×10 7個の細胞で低血清培地で細胞を再懸濁します。
- 10＆＃合計を混ぜる956; 0.4 cmのエレクトロポレーションキュベット中に再懸濁細胞（4×10 6細胞）を400μlの転写されたウイルスRNAのG。 、270 Vでエレクトロポレーションを介して細胞をトランスフェクト100Ω、および950μF。
- 15％FBSと10ミリリットル完全増殖培地中でエレクトロポレーションした細胞を再懸濁。注：許-7.5.1細胞は15％ウシ胎児血清中で培養したときにエレクトロポレーションした細胞生存性の増大が見られる。
- 4、48及び96時間：両方のT-25フラスコ（フラスコあたり〜1.2×10 6細胞）を、48ウェルプレートに以下の時点の各々について（ウェル当たり1×10 4細胞）で細胞をプレート。
- 培養されたフラスコおよびプレートから死細胞破片を除去し、10％FBSを新鮮な増補増殖培地で4-8時間のトランスフェクション後にメディアを交換してください。
- 収穫細胞培養上清48、96時間の時点で、4℃で10分間、1500rpmで細胞を遠心分離によって収集したサンプルから細胞破片を除去 ºCの
- -80ºCで無細胞上清を保存する溶解ウエスタンブロットによるタンパク質およびRNA分析のために、示された時点で転写定量的PCRリバース細胞。
5。HCVゲノムコピーを評価するための転写定量PCR（RT-qPCRの）をリバース
- HCVゲノムRNAコピー数を決定するために、ツーステップRT-定量PCRを行う。
- またはハウスキーピング遺伝子のペプチジルイソメラーゼG（PPIG R特異的なプライマー：逆、逆転写酵素と5'NTR（5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 'JFH RTQ R）に結合し、HCVのセンス鎖特異的なプライマーを用いて、全細胞RNAの1μgのを転写：5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '）。また、HCVのセンス鎖プライマーを用いて、既知のゲノムコピー（1月 10 日から9月 10 日までの標準）の（ステップ3で生成された）FNX-HCV RNAを逆転写。
- （HCV JFH RT特異プライマーを用いて得られた転写されたcDNA 50ngのを用いて定量PCRを行うことQF：5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R：5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 '）およびDNAの定量PCRスーパーミックスを含むグリーン色素を結合。だけでなく、ハウスキーピング遺伝子PPIGための定量PCRを行う（プライマーPPIG F：5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R：5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3'）注：サンプル間で正確な細胞内のHCV RNA量を計算するため、細胞のハウスキーピング遺伝子、PPIGを使用正規化のため、発現量（Ctの周期）。コピー数の決定のための標準としてFNX-HCVゲノムのコピー数を使用してください。
- 15秒95ºCと60：のHCV RNAコピー数を決定するために、定量PCRを実行するときに、以下の条件を使用してください リアルタイムPCRシステムを用いて30秒（40サイクル）ºC。
- ゲノム複製の結果を得るために、図3Aと図3Bを参照してください。
6。ウェスタンブロッティング分析HCVタンパク質の発現（図3C）を検出する
- 細胞溶解物のFRを使用して、OMウイルスRNAは、タンパク質ウェスタンブロッティング解析のための96時間後、トランスフェクションでトランスフェクトした。
- SDS-PAGE及びポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜に転写を用いて細胞溶解物を解決する。
- 5％スキムミルク、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.2％Tween 20を含むブロッキング溶液を用いて膜をブロックする。
- 一次マウスモノクローナル抗体のNS3（1千倍希釈）およびβ-アクチン（1 5000倍希釈）を有する膜をインキュベートする。
- 西洋ワサビペルオキシダーゼ（1 5000倍希釈）に結合したヤギ抗マウスIgGを加え、化学発光によって検出します。
7。免疫蛍光アッセイ（IFA）
- 免疫蛍光アッセイのため-20℃で30分間メタノールを使用してHCV感染およびトランスフェクトされた細胞を固定します。
- PBSで三回細胞を洗浄し、IFAはブロッキング緩衝液でブロックする。
- ウサギポリクローナル抗NS5Aは、主に抗体（親切に博士ダスグプタ、UCLAによって提供される）またはマウスモノクローナル抗DSR使用NA抗体1:200（1μg/ ml）を希釈でJ2と5時間に一晩4でインキュベート ºCの
- 3回の一次抗体の後、PBSで細胞を洗浄。
- ヤギ抗ウサギIgG-488ポリクローナル二次抗体または1:1,000希釈（1μg/ ml）を少なくともヤギ抗マウスIgG-594ポリクローナル二次抗体を添加し、室温で1時間インキュベートする。
- 蛍光顕微鏡（ 図3D）を使用して、ヘキスト染料とビューを用いてPBS 3回染色核で細胞を洗浄。
8。測定ウイルス力価
- プレートナイーブホ-7.5.1細胞を、約3×10 3細胞/ウェルで96ウェルプレートを用いて。翌日、増殖培地を用いて、HCVのRNAトランスフェクトした細胞から採取し、無細胞培養上清の10倍段階希釈を実施したHuh-7.5.1細胞の上に三重で接種する。
- -20℃で30分間、メタノールを（使用して72時間の感染後、細胞を固定
- NS5A陽性病巣のためにカウントしミリリットル当たり焦点形成単位の平均数（FFU）を計算するために最高希釈を使用しています。 HCV力価については、図4を参照してください。
ウイルスゲノム複製および感染のため9。 ウミルシフェラーゼレポーターアッセイ
- ウイルスゲノムの複製、48ウェルプレート中で三連でプレートHCVのRNA電気穿孔たHuh-7.5.1細胞（1×10 4細胞/ウェル）を評価する。
- 溶解6時間での受動溶解緩衝液75μlを、48時間、および96時間後にトランスフェクションした細胞。
- -80ºCで室温店で15分間穏やかプレートを揺する
- ウミシイタケルシフェラーゼ酵素活性を測定するために、室温にタンパク質溶解物およびウミシイタケルシフェラーゼアッセイ試薬を解凍する。
- 96-WELウェル当たりタンパク質溶解液20μlを追加 Lホワイト発光プレートルミノメーターでプレートを置き。
- ウェルあたり2秒先読み遅延の後にウミルシフェラーゼアッセイ試薬（セレンテラジン基質+バッファ）の100μLを分注する。 10秒間照射された光を統合する。
- 生物学的な三連のルシフェラーゼ値から、各試料の平均値と標準偏差を計算し、統計的分析（ 図5）にデータを供する。
- 感染性を評価するため、48ウェルプレートにナイーブホ - 7.5.1細胞の上に三重に指示された時点（48時間および96時間）のためのHCV RNAトランスフェクトした細胞から得られた無細胞上清500μlを接種。
- 6時間後に感染した後、ウェルあたりの新鮮な培地500μlのウイルス接種を交換してください。
- 溶解ウミシイタケルシフェラーゼアッセイと48時間後に感染し、対象の細胞のステップ8.2から8.7（ 図5）で説明したように。
- グラフ中のエラーバーは標準偏差（SD）を示す。 P値は、対応のないt検定により計算した。
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Representative Results
C型肝炎ウイルスはRNAウイルスである。このように遺伝子操作の目的のために、HCVゲノムcDNAを、細菌プラスミドベクターにクローニングされている。 T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列は、HCVゲノムの5 '末端の直前に導入した。 HCV分析ワークフローの概要を図1に示す。正確な3 '末端とHCVゲノムRNAを生成するために、プラスミドを含むHCVゲノムは、XbaI制限酵素で切断され生成した一本鎖オーバーハングは、マングビーンヌクレアーゼ消化で平滑化した。線形化されたHCVプラスミドの品質は、アガロースゲル電気泳動（ 図2B）により評価した。 HCV DNAは、インビトロ転写により媒介されるT7 RNAポリメラーゼを施し、得られたRNAは、9.6キロベース（ 図2C）で単一の生成物を得た。
我々はintragenotype 2aは、HCV（ 図の成長速度をテスト60、3）。許-7.5.1細胞は、野生型（WT）およびポリメラーゼヌルウイルスのインビトロ転写されたRNAでエレクトロポレーションした。我々は、RT-qPCRによりウイルスセンスゲノム複製を評価した。結果は、WTウイルスゲノムを効率的に（ 図3Aおよび3B）をレプリケートすることを示した。野生型ポルウイルスに比べゲノム複製の3つのログ一つのより高いレベルを示した。 WTウイルスは、ウイルスのタンパク質切断（プロテアーゼ活性）に関与するNS3タンパク質（ 図3C）、およびゲノム複製（ヘリカーゼ活性）を生成する。免疫蛍光アッセイ（ 図3D）により評価されるようにもWTウイルスNS5Aタンパク質を発現した。 NS5Aタンパク質は、HCV RNAレプリカーゼ複合体の一部である。ウイルスゲノムの複製を視覚化するために、我々は、具体的なdsRNAを認識する抗体を用いて二本鎖（ds）のHCV RNAの存在を調べた。 HCVゲノム増幅の間、センス鎖RNAはcアンチセンスゲノムにopied、従って、二本鎖RNA中間体は、感染細胞の細胞質中に存在する。 NS5Aタンパク質とdsRNAは、アクティブなウイルス複製を示唆し、WTトランスフェクトされた細胞の細胞質（ 図3D）に局在する。一緒になって、WTウイルスは、トランスフェクト許-7.5.1細胞において活性の複製を設立しました。
HCVの研究の進捗状況は、感染細胞培養システムの欠如に限定されていた。 JFH-1 HCVの株を、私たちはウイルスの侵入、RNA翻訳、RNA複製および感染性ウイルス子孫の形成を含む細胞培養で全体のHCV複製サイクルを調査するために許可されたキメラ実験室株のその後の特性評価の発見。 HCV力価およびデノボ感染性を評価するために、我々は、HCV RNAトランスフェクトした細胞から回収し、細胞培養上清を接種した。 HCV感染は、HCV NS5Aタンパク質を検出することにより可視化し、計算された感染病巣（ 図4）をカウントしてウイルス力価。我々は一つの焦点として、NS5Aに陽性（2セル以上）細胞の単離されたクラスターを検討した。結果は、WTウイルスが感染性であり、感染性粒子の単位/ mlを形成する4 10上の病巣を生じることが示された。
また、 ウミシイタケルシフェラーゼ（RLuc）レポーター遺伝子（ 図5A）を保有するのHCVレポーターウイルスを設立しました。リポーターHCVは、ハイコンテントスクリーニングアッセイのために、ならびに変異体ウイルスの大多数を試験するために使用することができる。ここでは、WTおよびPol-レポーターウイルスの成長表現型の評価を提示します。ウイルスゲノムが複製した場合、ルシフェラーゼ活性が残業ポストトランスフェクションを増加させるであろう。増大したゲノム複製レベルが増加したルシフェラーゼ活性から推定することができる。したがって、ルシフェラーゼ活性を間接的ゲノム複製のレベルの測定を提供する。 WTまたはpol-VIから収穫溶解物示された時点における梅毒RNAトランスフェクト細胞をルシフェラーゼ活性について試験した。 6時間後、トランスフェクションでは、WTおよびPol-ウイルスの両方が（ 図5B）に翻訳されていたトランスフェクションされたRNAの同様の入力レベルを示す、類似したルシフェラーゼ活性を持っていた。しかし、48時間および96時間トランスフェクション後に、WTウイルスはポルウイルスのそれと比較して増加し、ゲノムの複製レベルを示した。ウェスタンブロット分析（ 図5C）によって確認されるように、また、WTウイルスは、ウイルスのNS3タンパク質を産生した。その後、我々は48時間と96時間後にトランスフェクションした細胞培養物から採取した無細胞上清と共にナイーブホ-7.5.1細胞に接種することにより、WTおよびPol-レポーターウイルスの感染性をテストしました。 WTウイルスはポルレポーターウイルス（ 図5D）のものと複製の2〜3ログ高いレベルを有していたのに対し、ポルウイルスは、基本レベルのルシフェラーゼ活性を有していた。その結果、我々は強固なHCV感染細胞を持っていることを示しているcultuシステム再。
図1 HCV複製分析ワークフローの一般的なアウトライン。 インビトロ転写に供T7のRNAポリメラーゼプロモーター（T7P）を含む線形HCVプラスミド構築物。精製されたHCV RNAゲノムハァッ-7.5.1細胞にエレクトロやフラスコおよび48ウェルプレートにプレーティングされている。 4時間後、48時間、および96時間トランスフェクション後に、細胞RNAおよび培養上清をフラスコから収集している。 48ウェルプレートからの細胞を収穫するタンパク質溶解のために利用されており、免疫蛍光アッセイのために固定されている。ゲノムコピー数のRT-qPCRにより分析、ウェスタンブロット法およびウイルス力価を測定するには、HCVの複製を評価するために行われています。
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図2構築したプラスミドDNAのインビトロ転写によるHCVゲノムRNAの製造。 J6CF/JFH-1のintragenotype 2aのキメラウイルス、FNX-HCVおよびFNX-HCVポルヌルのA）のゲノム構成。 J6CF株の領域（NS2の部分に5'NTR）は濃い灰色で示されており、JFH-1株の領域（3'NTRにNS2の一部）ライトグレーで表示されます。 （AAGへGDD）NS5Bポリメラーゼの触媒ドメイン変異アスタリスクで示されます。線形化されたHCVプラスミドを生成に関与し、B）手順。ゲル画像はXbaIおよびインビトロ転写のための準備ができて緑豆ヌクレアーゼ消化によって産生される線形化され、平滑末端プラスミドDNAを示しています。 0.8％アガロースゲルは、DNAを解決するために使用した。C）ゲル画像はインビトロ転写T7 RNAポリメラーゼ系を用いて製造されたHCVゲノムRNAを示す。 WT：野生型; POL-：ポリメラーゼNULL; M：マーカー。
図3。HCV構築物の成長表現型の評価。 A）野生型（WT）およびポリメラーゼヌル（ポル-）ウイルスのゲノムの複製動態を評価する。 RT-qPCRにより評価されたセンスRNA鎖のゲノムコピー数をバーグラフで表示されます。ポルウイルスのウイルスゲノムコピーが複製欠損表現型を示す、ある期間にわたって減少した。B）野生型HCVの相対的なゲノム複製レベルがHCVタンパク質の発現のポルウイルスの。C）ウェスタンブロット分析と比較される。 HCV NS3タンパク質を検出し、β-アクチンの細胞を対照として使用される。D）ウイルス複製を調査するための免疫蛍光アッセイ。 96時間後にエレクトロポレーションで細胞を固定し、IMMを受けるHCVのNS5Aタンパク質および二本鎖RNA（dsのRNA）、HCV RNAの複製中間体のためのマーカーunostaining。核はヘキスト染色（スケールバーは50μm）を用いて可視化した。 HPT：。時間トランスフェクション後、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。野生型HCVの感染性を調査し、ウイルス力価を測定する。 A）ナイーブたHuh-7.5.1細胞を、感染の研究のために使用した。 HCV RNAの48および96時間後にトランスフェクション（HPT）で収集し、無細胞上清を10倍連続希釈にかけ、三連で96ウェルプレート中の細胞に添加した。 72時間感染後、細胞を固定し、HCVのNS5Aタンパク質について免疫染色した。 Nを持つ細胞S5A陽性染色（赤）ウイルスに感染している。病巣形成単位（FFU）を評価するために、最も高い希釈で陽性病巣を計数した。画像の代表的なパネル（スケールバーは100μm）に示されている。ミリリットルあたりFFUにおけるB）の平均値およびウイルス力価の標準偏差をグラフに示す。ポリメラーゼヌル変異体は、感染性粒子を生成しなかった。 WT：野生型; POL-：ポリメラーゼはnullを返します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5。ゲノム複製とレポーターHCVの感染性を評価する。 A）intragenotype 2aのキメラレポーターウイルスの漫画が提示されている。 ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子が挿入されinfram5'NTRおよびコア。、B）は、野生型と指示された時にはポル変異レポーターウイルスのゲノム複製の動態は、トランスフェクション後の点の間のEはグラフに示されている。タンパク質溶解物を、 ウミシイタケルシフェラーゼ酵素活性を測定するための6時間、48時間および96時間の時点で回収した。各ウイルスについて3回ウミシイタケルシフェラーゼ値（RLV）から計算した平均と標準偏差をグラフに提示されている。C）ウェスタンブロッティングパネルは、HCV NS3タンパク質の発現を示す。 NS3一次抗体によって検出された非特異的抗原をローディング対照として働く。野生型（WT）レポーターウイルスは、NS3タンパク質の高レベルを生成する。D）ウイルス感染性の分析。ナイーブたHuh-7.5.1細胞を、48時間および96時間の時点でトランスフェクトされた培養物から得られた細胞を含まない上清を接種した。感染細胞のウミシイタケルシフェラーゼ活性を48時間感染後に測定した。標準偏差が平均値をグラフに示す。 WTレポーターウイルスは、感染性の高いレベルを示したのに対し、ポル - レポーターウイルス感染細胞は、ルシフェラーゼ活性のバックグラウンドレベルのみを有していた。
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Discussion
この図は、C型肝炎ウイルス複製サイクルを分析するための方法を記載している。 HCVはヒトの病原体であり、所定の生物学的安全性プロトコルは、必ず守っていただきます。感染性HCV細胞培養系は、以前に11-13,16,17記載されている。示されたプロトコルを以下のときに我々が実装し、いくつかの重要なポイントがあります。まず、下流の研究のために無傷の完全長ウイルスゲノムRNAの良好な品質を有することが非常に重要である。ウイルスcDNAを運んで入力プラスミドを直線化し、慎重に平滑化する必要があります。のXba Iオーバーハングを鈍らするために採用緑豆ヌクレアーゼは、非特異的なヌクレアーゼで、長時間のインキュベーションは、ウイルスゲノムの3 '末端の損傷や劣化が発生します。ヌクレアーゼは、フェノール - クロロホルム抽出、または陰イオン交換カラム精製によって指定された30分間のインキュベーションの直後に除去されなければならない。ヌクレアーゼ処理したDNAのゲル抽出のように、推奨されない場合があります酵素は、ゲル電気泳動プロセスの間アクティブである。
インビトロ RNA転写段階でのその後のために、一般的には、1にもリボヌクレアーゼ（RNアーゼ）の混入を最小限にするための広域スペクトル予防措置を講じます。使用されるすべての試薬および材料は無しRNaseする必要があります。最小のRNA鎖の切断で高品質のゲノムRNAを生成するために、RNAは、精製および下流処理工程中に過酷なボルテックスを繰り返しピペッティングを避けることによってより少ない物理的なストレスに供される必要がある。 RNA転写の終了後、入力されたプラスミドDNAテンプレートは、デオキシリボヌクレアーゼ（RNaseを含まない）処理することにより転写されたRNA混合物から除去しなければならない。不完全な除去は、トランスフェクト細胞へのプラスミドDNAのキャリーオーバーが生じ、複製されたウイルスRNAの絶対ゲノムコピー数の定量化に影響を与えることができる。したがって、DNAのマイクログラム当たり1単位の濃度でDNアーゼ酵素を使用しても37でDNase反応の余分な15分を持つ ºCすることができ助けて。転写されたRNAをフェノール - クロロホルム抽出、または陰イオン交換カラムのいずれかによって精製することができる。ケアは細胞毒性であり、分子アッセイを妨害する可能性が精製されたRNAサンプルにフェノールまたは他の試薬のキャリーオーバーを避けるために行使しなければならない。
エレクトロポレーションのために、精製されたRNAは、RNaseフリーの滅菌水に溶解されなければならない。 RNAペレットを5分間65℃まで試料を加熱、溶解しにくい場合に役立つ。転写が完了すると、それは-80ºCでのRNaseを含まない水で行われた作業分量の10μgの中ですぐにRNAを保管しておくことが重要ですアリコートの目的は、繰り返し凍結/解凍媒介RNAの分解を防止するためである。一貫性のある実験結果のためには、同時にすべてのサンプルとコントロールを転写することをお勧めします。高品質のRNAが高いウイルス力価収量をお勧めします。 Bまた、HCVゲノムRNA、ポリマーおよび脂質ベースのトランスフェクション試薬をトランスフェクトすることができますEは、21,22を使用していました。
ウイルス及び宿主因子が大きくHCV株の増殖速度に影響を与える。ヒト肝癌細胞株（ホ-7）誘導体たHuh-7.5は、ホ-7.5.1とのHuh7-Lunet細胞株は、一般的にウイルス増殖の11-13,15を評価するために使用される。ホ- 7.5.1細胞ではそれが21日、トランスフェクション後13,15であるのに対したHuh7-Lunet細胞中のJFH-1株のピークウイルス産生は、3〜4日後、トランスフェクションである。 JFH-1株由来の非構造遺伝子を持つintragenotype 2aのキメラウイルスFNX-HCVハァッ-7.5.1細胞19,20における4日間のトランスフェクション後にピーク力価を持っています。 インビトロ転写されたRNA 中のウイルスの産生のために、初期継代ヒト肝癌細胞株が好ましい。継代数20の上にホ - 7.5.1細胞を使用している。エレクトロポレーション後に増加した細胞生存性を確保するためにウイルスの生産が大幅に削減され、解凍されたHuh-7.5.1細胞は、実験や舞を行う前に2週間の回復期間を与えている12％-15％FBS中ntained。この基準に伴い、直ちにエレクトロポレーション後、15％FBSを含有する増殖培地中の細胞の再懸濁は、より良好なウイルス産生を可能にする細胞の生存を増加させる。最初の8時間の時点の後、細胞を10％FBSを含有する培地に交換する。細胞破片キャリーオーバーを最小化するために、ウイルス培養上清を4ミクロンのフィルターを通して遠心分離および濾過に供される。未濃縮または濃厚ウイルス上清は-80に等分され、記憶される ºC in vitroおよびin vivo実験のさらなるため。これらの予防措置や提案が正常HCV複製サイクルの分析を行うための研究者を助けることができる。
このような蛍光タンパク質とガウシアルシフェラーゼ（Glucを）の分泌型のようなマーカー遺伝子を有するレポーターHCVの別のバリエーションは、HCV研究18,23,24に記載されている。 HCVを調査に焦点を当てた研究者のためのゲノム複製、HCVサブゲノムレプリは（NS2に遺伝子のコアを欠く）の貴重なツール9,10です。 HCVレプリコンは、このように少ないバイオ安全規制や感染細胞培養HCV及び臨床分離株に比べて扱いやすいが必要で、非感染性である。 NS5Bポリメラーゼの活性が欠損したHCVは、HCVの複製サイクル11,12を研究するための重要な制御である。エンベロープ糖タンパク質（デルタE1E2）、またはP7-NS2活性を欠くHCVはHCVエントリー、ビリオンの形態形成および出力12,19,25-27を含む研究のための有用な管理することができます。
制限事項については、現在、感染細胞培養系は、HCV遺伝子型1および2で利用可能である。本物のウイルス株を同定することがまだ細胞培養において効率的に増殖し得る3〜6の遺伝子型に属する。遺伝子間の組換えウイルスは、様々な遺伝子型の複製サイクルを研究するための有用な代替である。複製能をキメラウイルスharbori遺伝子型1〜7及びJFH-1遺伝子型2aゲノムからの配列の残りの部分15,18に記載されたからNS2領域へngのコア。別の制限は、JFH-1およびその誘導体、キメラ株のウイルス収量は、ポリオおよびインフルエンザのような他のRNAウイルスに比べて相対的に低い3月 10日から6月 10日までのミリリットルあたりの範囲であることである。力強い成長とHCV株を開発する必要がある。今後の研究は、強力な抗ウイルス剤を同定し、HCV感染を予防するためのワクチン候補の開発に集中するためのハイスループットライブラリースクリーニングのためのレポーターHCVの使用を含む。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M.
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
