Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Nanosurgery הלייזר של האקסונים Cerebellar Published: July 28, 2014 doi: 10.3791/51371
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2,3,4
1European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, University of Florence, 2National Institute of Optics, National Research Council, 3Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 4International Center for Computational Neurophotonics (ICON Foundation)

Summary

שני פוטונים הדמיה, מצמידים את nanodissection לייזר, הם כלים שימושיים ללמוד תהליכים ניווניים ומשובים במערכת העצבים המרכזית עם הרזולוציה subcellular. פרוטוקול זה מראה כיצד לתייג, תמונה, ולנתח סיבי טיפוס בודדים בקליפת המוח הקטן in vivo.

Introduction

חיתוך רוחב אקסון כתוצאה מפגיעה מכאנית, עלבון רעיל או מחלות ניווניות בדרך כלל על ידי ניוון של החלק הדיסטלי של האקסון שמנותק מהגוף התא 10-13. עם כמה יוצאים מן הכלל 2,7,14,15, אקסונים ניתקו במערכת העצבים המרכזית של בעלי חיים המבוגרים הם בדרך כלל מסוגלים להפעיל תכנית לצמיחה מחודשת 16.

מעט מאוד ידוע על הדינמיקה של אירועים ניוונית ברמה התאית וsubcellular בזמן אמת. הפיתוח של אסטרטגיות חדשות להגבלת נזק עצבי וקידום צמיחה מחודשת עצבית דורש, כצעד ראשון, מבהיר את המנגנון שבאמצעותו תאים עצביים להפליא פצועים להידרדר ולהתחדש. מחקר זה התייחס באופן ישיר ביותר על ידי ניטור הדינמיקה של נוירון בודד in vivo. בעוד טכניקות דימות פלואורסצנטי אחד פוטון מוגבלות על ידי פיזור אינטנסיבי של אור הנראה, שני פוטונים עירור מגיע לשכבות בקליפת המוח עמוקות בliיש עכברים עם רזולוציה 3,4,17 subcellular. ניצול של עכברים הטרנסגניים שבו חלבוני ניאון באים לידי ביטוי באופן סלקטיבי בתת אוכלוסיות של נוירונים 18-20, מיקרוסקופיה TPF יושמה לחקר פלסטיות הסינפטית והתארכות אקסון במהלך פיתוח in vivo 21,22. T הוא היכולת של הנוירונים שנפגעו באופן מיוחד כדי לגדל מחדש לאחר פציעה יכולה להיחקר על ידי צימוד בניטור vivo על ידי הדמיה שני פוטונים עם מודל של פגיעה הממוקד במיוחד להאקסון של עניין. קליטה רב פוטון של פולסים femtosecond נעשתה שימוש כדי לשבש דנדריטים בודדים או אפילו קוצים בודדים 5,23. יתר על כן, הפרדיגמה פגיעה זו מאפשרת חיתוך ענפי אקסון בודדים מבלי להפריע לדנדריט הפנייה 6. בהקשר של לנתח את התכונות המאפשרות אוכלוסייה עצבית ספציפית להתחדש האקסונים שלהם מרגע שנפגעו, סיבי המוח הקטן טיפוס (CFS) הם si מודל שימושיNCE הם שומרים על תכונות פלסטיק מדהימים לאחר פציעה אפילו בבעלי חיים מבוגרים 24,25. לאחרונה, הדמיה לטווח ארוך של CFS הראתה כי אקסונים אלה מסוגלים Regrowing בימים שאחרי axotomy לייזר 6.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לתייג נוירונים olivocerebellar והתארכות אקסון באמצעות התחקות אנטרוגרדית. ברגע שתאי העצב של עניין שכותרתו fluorescently, הם יכולים להיות במעקב שוב ושוב בנקודות זמן שרירותיות במשך שבועות או חודשים מתחת לחלון גולגולתי. ההליך לנתח סניפי אקסון בודדים על ידי axotomy לייזר in vivo לאחר מכן ניתן יהיה מאויר.

הטכניקות המוצגות כאן מספקות תובנות חדשות על המנגנון של שיפוץ אקסון in vivo ועשויות לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות להגביל ניוון עצבי ולקדם לצמיחה מחודשת עצב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תיוג axonal

  1. יכולים להיות מתויגים סיבים מטפסים על ידי הזרקה או צבעים אורגניים מצומדת לdextrans משקל המולקולרי הגבוה או פלסמיד / וירוסים שיגרמו לביטוי של חלבוני ניאון 26-29. בפרוטוקול זה, צבען האורגני אלקסה פלואוריד Dextran 488 מוזרק לתוך הזית הנחותה לתייג סיבי טיפוס ולדמיין אותם בקליפת המוח הקטן (איור 1). כל ההליכים שתוארו כאן כבר אושרו על ידי משרד בריאות האיטלקי.
  2. הכן את צינור נימי זכוכית על ידי משיכתו על חולץ micropipette. חתוך את קצה צינור זכוכית הנימים במספריים עד הקוטר החיצוני הוא כ 30 מיקרומטר.
  3. טען את הנימים עם 1-2 μl של הצבע dextran מצומדות.
  4. לפני שמתחיל, לעקר את כל מכשירי הניתוח בחיטוי. במהלך ההליך, להפחית את הסיכונים של זיהום על ידי שימוש מעקר חרוז זכוכית.
  5. להרדים את העכבר (9-12שבועות) על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין (90 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (9 מ"ג / קילוגרם). להבטיח את החיה מורדמת באופן מלא באמצעות זנב ו / או צובט הבוהן. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
  6. לגלח את השערות מעל לצוואר עם או סכין גילוח או קרם להסרת שיער. ספוגית האתר כירורגית פעמיים עם בטאדין, לסירוגין עם 70% אתנול.
  7. הנח את העכבר על בעל stereotaxic. שמור חם של בעלי החיים עם כרית חימום.
  8. דחף בעדינות את earbars על העצם ליד האוזניים, כך שראשו בחוזקה. לסובב את הראש כדי ליצור זווית 140 ° עם הגוף. ניתן להשיג את הכיוון הרצוי בעדינות על ידי שינוי הגובה של מוט בעל האף על בעל stereotactic.
  9. להחיל כמה טיפות של לידוקאין על העור בין האוזניים. שימוש במלקחיים או סכין גילוח לבצע חתך אנכי של כ 1 סנטימטר על העור מתחת לעורף.
  10. בעדינות להפריד את הרקמות ושרירים תת עורית על ידי פינצטה הקההים תחת מיקרוסקופ לנתיחה. לדחוף למטה את צרור השריר האופקי ולהחזיק בנפרד את שני fascicles השרירים האנכי במטרה לחשוף את הדורה על מגנום foramen.
  11. שימוש בזהירות רבה, לנתח את הדורה עם מחט מזרק או מלקחיים חדים מאוד כדי לחשוף את גזע המוח. כמות קטנה של נוזל מוחי שדרה עשויה לשפוך החוצה כאשר הדורה נחתכה.
  12. על micromanipulator stereotactic, לסובב את בעל ° נימי 45 מהאנכיים. הנח את הנימים על קו האמצע, בנקודת האמצע בין קצה הזנב של קליפת המוח הקטן וחוליית הצוואר הראשונה. הכנס את פיפטה בעומק של 2 מ"מ מעל פני השטח.
  13. לספק 0.5-1.5 μl נפח של צבע על 10-15 דקות. מערכת מחלק microinjection מאפשרת משלוח לחץ מבוקר של הנוזל בנימים (לחץ דופק = 20 psi; משך דופק = 3-4 אלפיות שנייה; תדירות משלוח = הרץ 12 דופק).
  14. השאר את הנימים במקום במשך 15 דקות, ולאחר מכן slowly (ב2-3 דק ') להסיר אותו. בעדינות מחדש ליישר את השרירים ולתפור את העור מעל. לשמור על השרירים hydrated היטב על ידי יישום חלק מלוח לאורך כל ההליך.
  15. כדי למנוע התייבשות, להזריק תת עורי 0.5 מיליליטר של .0.9% NaCl. שמור את החיה בכלוב מחומם עד להחלמה מלאה מן ההרדמה.
  16. תת עורי לנהל Carprofen (5 מ"ג / קילוגרם) ביום למשך 2-3 ימים לאחר הניתוח.

2. חלון אופטי בקליפת המוח הקטנה

הערה: הצבע מועבר ב 2 שבועות מהגרעין olivary הנחותים עד קליפת המוח הקטן למסופי CFS (ראה איור 1). ניתן דמיינו CFS כותרת הדלילות מתחת לחלון גולגולתי הקבוע שניתן לבצע באופן הבא:

  1. לעקר את כל מכשירי הניתוח.
  2. להרדים את העכבר כפי שתואר לעיל. השתמש צובט הבוהן כדי לבדוק את בעל החיים הוא מסומם באופן מלא.
  3. לגלח את השיער מעל לראשו, נגב את skבמשייכות לסירוגין של אלכוהול 70% ובטאדין ולהחיל משחת עיניים. מניחים את העכבר במסגרת stereotaxic ולמקם את סורגי אוזן כדי להחזיק את הראש בחוזקה.
  4. תת עורי לנהל דקסאמתאזון (0.2 מ"ג / קילוגרם) וCarprofen (5 מ"ג / קילוגרם) כדי למנוע התנפחות של המוח ודלקות אפשריות בחלון האתר גולגולתי.
  5. החל ירידה של לידוקאין על העור מעל הגולגולת וחתך כנף, מבין האוזניים למעל העיניים. החל פתרון לידוקאין שוב על גבי קרום העצם לפני מגרד אותו עם סכין מנתחים.
  6. השתמש במקדח השיניים לדק אזור חצי עגול של גולגולת מעל למוח הקטן. החלון ממוקם בדרך כלל מרכזי וכיוון גב התפר, כך עומק הגולגולת הוא כמעט קבוע לאורך כל ההיקף של חץ העיגול. מיצוב החלון קרוב מדי לתפר למבדה וקידוח חוזר ונשנה מעל האזור עבה מאוד זה עלול לגרום להתחממות יתר של המוח והיווצרות של בצקות.
  7. החל עוצר דמוםספוג בגולגולת במקרה של דימום.
  8. חותכים coverglass בשני חצאים בעזרת סכין גילוח ופינצטה. בדוק שcoverglass הוא מעט יותר גדול מהאי של עצם ויש לו צורה דומה לפני הסרת הכנף של עצם עם פינצטה; אם לא, לעצב מחדש את coverglass או בחר אחד אחר. אל תיגע בדורה מאטר עם פינצטה תוך כדי ציור את העצם. להניח בזהירות במורד coverglass על הדורה. הערה: הדבקות של פני השטח של הזכוכית על הדורה השלם הגדה של חלונות גולגולתי לאורך זמן.
  9. הסר בועות אוויר מתחת לזכוכית על ידי שטיפה שוב ושוב עם תמיסת מלח וייבוש עם מקלות צמר גפן. זה גם יעזור לי הסרת חלק דם שיורית שעלולות להישפך החוצה מנימי דם קטנות לאחר מיצוב הזכוכית. לאטום את החלון בתערובת של דבק אקרילי ומלט שיניים 30.
  10. שמור את החיה על כרית חימום בחדר התאוששות עד שהתאושש לגמרי מהרדמה. אל מחדשלהפוך את העכברים בכלוב בבית עד שהתאושש באופן מלא; לא להשאיר אותם ללא השגחה עד שהם חזרו להכרה מספיק כדי לשמור על עינת חזה.
  11. תת עורי לנהל Carprofen (5 מ"ג / קילוגרם) ביום למשך 2-3 ימים לאחר הניתוח.

3. בVivo Multi-פוטון הלייזר Axotomy

  1. חכה 2-7 ימים מהניתוח לפני ביצוע פגישת ההדמיה הראשונה. המותאם אישית שנבנה מיקרוסקופ שני פוטונים משמש כאן מסופק עם טי: מקור לייזר ספיר (פולסים רוחב 120 FS, שיעור החזרה 90 MHz) שנסרק לראשונה על ידי זוג מראות galvanometric ולאחר מכן התמקד על הדגימה על ידי טבילה במים 20X אובייקטיבי (NA 0.95, WD 2 מ"מ). שלב פיזואלקטריים לולאה סגורה מבצע התקות צירי עד 400 מיקרומטר של המטרה. צינורות מכפיל לאסוף את אות הקרינה.
  2. להרדים את החיה, ולאחר מכן למקם את הראש בבעל stereotactic כך שהחלון גולגולתי מניח במקביל לobjectiיש מישור מוקד.
  3. חקור עם TPF ההדמיה קליפת המוח מתחת לחלון גולגולתי. בחר את האקסון להיפגע בקרב המבריקים אלה.
  4. לרכוש Z-מחסנית (בדרך כלל שדה הראייה הוא 100 x 100 מיקרומטר 2, ב512 x 512 פיקסלים, 2 מיקרומטר צעד ציר z) כדי לקבל 3D-שחזורים של האקסון הממוקד. בתוך הנפח צילם, לבחור את אתר הנגע בסניף אקסון שנמצאת בעיקר במקביל למישור המוקד. נטייה זו מאפשרת להבקיע במהירות שינויים מורפולוגיים, אשר חזוי של נתיחה מוצלחת.
  5. להקרין עם אנרגיה במינון גבוהה הנקודה שנבחרה בחלק הדיסטלי של CF. הדבר נעשה באמצעות תוכנת Labview: להגדיל את כוח הלייזר 5-10x יותר הכוח המשמש להדמיה (≈ 300 mW, נמדד לאחר העדשה האובייקטיבית), לקבוע את המיקום של מראות galvanometric לעשות סריקת קו (~ 4 - 10 מיקרומטר) באתר הנגע ולפתוח את תריס הלייזר ל400-600 אלפית שניים. להתמצא קו הסריקהניצב למישור CF ויחצה לחלוטין את האקסון. הקרנת כתמים בהירים (לדוגמא., ורידים) בדרך כלל מסייעת לנתח את האקסון. אורך הגל לaxotomy לייזר הוא זהה המשמש להדמיה (920 ננומטר).
  6. בדרך כלל הקרינה של האקסון באזור המוקרן transiently יורדת עקב photobleaching. לרכוש ערימה של אותו אזור מספר דקות לאחר ההקרנה כדי להבטיח אבלציה שבוצעה היטב. אם האזור התחיל נפיחות והאקסון יצר מבנים דמוי חרוזים, נוירון כבר גזור בהצלחה. במקרה זה, בכמה שעות (מכמה עשרות דקות ל24hr) החלק הדיסטלי של האקסון יהיה מנוון וייעלם לחלוטין.
  7. למרבה הצער מנת האנרגיה הדרושה כדי לייצר axotomy מלא היא לא תמיד צפויה. אם התוצאה היחידה של ההקרנה היא photobleaching, הקרינה צריכה להיות התאוששה במהירות בשל לצבוע דיפוזיה, וההקרנה יש לחזור שוב ליעילהly לנתח את האקסון. כמו כן, במקרה של סימנים של נפיחות אינו מופיעים בתוך 5-20 דקות, או הנפיחות ואחריו התאוששות (. באנלוגיה למה שכבר תאר לdendrotomy לייזר, ראו אלגרה Mascaro אח' 23), נסה שוב עם סריקות חדשות להגדיל את להתעכב זמן ו / או כוח הלייזר.
  8. לפקח על שיפוץ הסופי של האקסון בימים שאחרי axotomy הלייזר עם שני פוטונים בתחום ההדמיה vivo (איורים 2 ו -3). דפוס כלי הדם משמש כדפוס התייחסות כדי לאחזר את האקסון גזור בימים הבאים.
  9. תת עורי לנהל Carprofen (5 מ"ג / קילוגרם) בכל פגישת הדמיה במשך כל תקופת הניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תיוג אקסון, in vivo הדמיה וaxotomy לייזר על נוירונים בודדים. ציר הזמן של הניסוי מוצג באיור 1.

דוגמא של CFS שכותרתו עם אלקסה פלואוריד 488 Dextran ודמיין תחת החלון גולגולתי ידי in vivo שני הפוטונים במיקרוסקופ היא דיווחה באיור 2. כפי שדווחו בעבר 6,27, הסניפים עולים להציג יציבות גבוהה לאורך כל תקופת התצפית של מספר ימים .

איור 3 מראה דוגמא של ניתוק אקסון ידי axotomy לייזר של סניף אחד של CF. כפי שתואר לעיל, הנזק בוצע על ידי הקרנת סניף דיסטלי (~ 30 מיקרומטר מתחת פיא) של CF עם מינון גבוה של אנרגיית אור אינפרא אדום. כפי שניתן לראות בפנל השני של איור 3, 15 דקות לאחר הקרנת לייזר החלק הדיסטלי של האקסון התחילו נפיחות וdegeneדירוג. היום אחרי, את החלק של דיסטלי האקסון לאתר הנגע נעלם לחלוטין (איור 3, D17). החלק המנוון מודגש על ידי ראשי החץ האדומים במהלך הזמן. שני הלוחות האחרונים גם להראות את היווצרות ההדרגתית של סניף חדש רוחבי (חץ ירוק) מהאקסון נפצע (ניתן למצוא פרטים נוספים על ההנבטה של סניפים חדשים לאחר axotomy לייזר in vivo ב6).

איור 1
איור 1. ציר זמן של ניסוי nanosurgery הלייזר. לאחר ההזרקה לתוך גרעין olivary הנחותים, שבועיים של התאוששות יאפשר לצבוע dextran מצומדות אנטרוגדית לתייג סיבי הטיפוס. המוח הקטן הקליפה חשופה לאחר מכן על ידי ביצוע חלון גולגולתי קבוע. מ2-7 בשלב מאוחר יותר, ניתן הדמיה CFS מתויג תחת MICR שני הפוטוניםoscope in vivo במרווחי זמן שרירותיים. Nanosurgery הלייזר על אקסונים שכותרתו יכול להתבצע בכל עת לאחר שחלון גולגולתי כבר מושתל.

איור 2
תיוג איור 2. סיבי טיפוס. הפנל מהשמאל מראה דוגמא של CF שכותרתו עם אלקסה פלואוריד 488 Dextran ודמיין in vivo על ידי מיקרוסקופ TPF. לוחות מימין מציגים תמונות של אותו CF מיום 16 (D16) לD18 זמן לשגות. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר.

איור 3
איור 3. Axotomy לייזר בסניף אחד של סיבי טיפוס. נוירון היה מוקרן בי נקודות חץ האדומות על D16. highlig ראשי החץ אדוםHT היעלמותם של החלק הדיסטלי של האקסון לאחר axotomy הלייזר (D18). סניף רוחבי שהוקם זה עתה הוא הצביע על ידי ראש החץ הירוק. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מראה כיצד לתייג את הנוירונים של הזית הנחותה עם פלורסנט לצבוע. כתוצאה מכך, השיטה לביצוע חלון גולגולתי בקליפת המוח הקטן מתוארת. טכניקה זו מספקת גישה אופטית לחלק המסוף של נוירונים olivocerebellar, סיבי הטיפוס. למרבה הצער, התוצאה של שני תיוג וניתוח פתיחת גולגולת היא נמוכה למדי גם בידיהם של המפעילים מיומנים (בדרך הכלל 1 מתוך 3 עכברים שכותרתו, ו1 מתוך 3 חלונות גולגולת נשארים ברורים אחרי 1-2 שבועות).

ההליך לבצע axotomy לייזר בעכברים חיים הוא הציג אז. שיטה זו מאפשרת לנתח נוירונים ניאון באתרים ממוקדים. בעוד פרדיגמות פציעה נפוצות, או על ידי ניתוק מכאני או השימוש בכימיקלים, לגרום לשיבוש מסיבי של רקמת המוח, כוחו העיקרי של מודל זה הוא הכליאה מרחבית הגבוהה וספציפיות. ואכן, מחקרים קודמים הראו כי ניתן מלוטשים על קוצים בודדים בזמן חוסכים tהוא שלמות מבנית של דנדריט ההורה 5; יתר על כן, יכולים להיות מופרים סניפים אקסון יחיד למנוע את היווצרות של צלקת גליה מתמשכת 6. תהליך הניוון יכול להיות בעקבות כך בזמן אמת, כמו גם שיפוץ סופי של נוירון נפגע. שיטה זו היא אפוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את המנגנון הבסיסי של פלסטיות מבנית אקסון in vivo.

האפשרות לנתח מבנים שנבחרו תלויה בקירוב ראשון בעומק של המבנה ועל עוצמת פליטת הקרינה שלה. למרות ששני הפוטונים במיקרוסקופ מאפשר נוירונים הדמיה עד 600-800 מיקרומטר העמוק, מצאנו כי nanosurgery מוגבל לשכבות הראשונות של קליפת המוח (עד 300 מ"מ).

בaxotomy לייזר פרוטוקול זה היה ממוקד לסיבי טיפוס המוח הקטן, אבל זה יכול לשמש גם כדי לנתח את כל מבנה ניאון במוח חי. הקרנת לייזר נעשתה שימוש כדי לנתח ce העצבי אחתll גופים, ענפים הדנדריטים, אקסונים או קוצים בודדים של נוירונים פירמידליים-GFP שכותרתו בקליפת המוח של עכברים הטרנסגניים 5,8,9,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab standard stereotaxic, rat and mouse Stoelting  51670
Borosilicate glass with filament Sutter Instrument Inc BF100-50-10
Germinator 500 (Glass bead sterilizer) Roboz
Microinjection dispense system Picospritzer
Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) Warner Instruments  64-0720
Ti:Sapphire laser, 120 fsec width pulses, 90 MHz repetition rate Coherent Chameleon 
Spongostan, hemostatic sponge Ferrosan MS0005
Galvanometric mirrors  GSI Lumonics VM500+
Objective Olympus XLUMPLFLN 20XW
Piezoelectric stage  Physik Instrumente P-721
Photomultiplier modules  Hamamatsu Photonics H7710-13
LabVIEW System Design Software National Instruments
Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) Boheringer Ingelheim
Rymadil (carprofen)  Pfizer
Lidocaine clorohydrate 2% ATI
Alexa488 dextran Life Technologies D22910

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strata, P., Rossi, F. Plasticity of the olivocerebellar pathway. Trends Neurosci. 21, 407-413 (1998).
  2. Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Prog Neurobiol. 72, 373-398 (2004).
  3. Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).
  4. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2, 932-940 (2005).
  5. Sacconi, L., et al. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
  6. Allegra Mascaro, A. L., et al. In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).
  7. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr Biol. 19, 930-936 (2009).
  8. Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
  9. Canty, A. J., et al. Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex. J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).
  10. Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
  11. Hilliard, M. A. Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war. J Neurochem. 108, 23-32 (2009).
  12. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
  13. Luo, L., O'Leary, D. D. Axon retraction and degeneration in development and disease. Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).
  14. Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons. Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).
  15. Morrison, E. E., Costanzo, R. M. Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system. Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).
  16. Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity. Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).
  17. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  18. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  19. Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).
  20. De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks. Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).
  21. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  22. De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49, 861-875 (2006).
  23. Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F. Multi-photon nanosurgery in live brain. Frontiers in neuroenergetics. 2, 21 (2010).
  24. Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells. The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).
  25. Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Progress in neurobiology. 72, 373-398 (2004).
  26. Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43. PLoS One. 6, e20791 (2011).
  27. Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum. Neuron. 56, 472-487 (2007).
  28. Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex. Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).
  29. Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum. Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).
  30. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (12), (2008).

Tags

Neuroscience גיליון 89 תיוג אקסון התחקות עצבית, שני פוטונים במיקרוסקופ המוח הקטן סיבי טיפוס axotomy לייזר פתיחת גולגולת
Nanosurgery הלייזר של האקסונים Cerebellar<em&gt; בVivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Allegra Mascaro, A. L., Sacconi, L., … More

Allegra Mascaro, A. L., Sacconi, L., Pavone, F. S. Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo. J. Vis. Exp. (89), e51371, doi:10.3791/51371 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter