Summary
레이저 nanodissection 결합 이광자 이미징은, 세포 내 해상도 중추 신경계 퇴행성 및 재생 공정을 연구하는 유용한 도구이다. 이 프로토콜은, 라벨 이미지 및 생체 내에서 소뇌 피질에서 하나의 등반 섬유를 해부하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
기계적 손상, 독성 모욕 또는 신경 변성 질환으로 인한 절개 축삭은 보통 10-13 전지 본체에서 분리 축삭의 말단 부분의 변성에 의해 이어진다. 몇 가지 예외를 제외하고 2,7,14,15로, 성인 동물의 CNS에서 절단 축삭은 일반적으로 재성장 프로그램 (16)을 활성화 할 수 없습니다.
약간은 세포와 세포 이하의 수준에서 퇴행성 이벤트의 실시간 역학에 대한 알려져있다. 신경 세포의 손상을 제한하고 신경 세포의 재성장을 촉진하기위한 새로운 전략의 개발은 단독으로 부상당한 신경 세포가 퇴화하고 재생하는 메커니즘을 명확히, 첫 번째 단계로,이 필요합니다. 이 연구는 가장 직접적으로 생체 내에서 단일 신경 세포의 역학을 모니터링하여 해결됩니다. 일 광자 형광 이미징 기술은 가시광의 산란 강도에 의해 제한되는 반면, 두 개의 광자 여기가 리 깊은 피질 층에 도달세포 내 해상도 3,4,17와 마우스를했습니다. 형광 단백질을 선택적으로 신경 18-20의 모집단에서 발현되는 형질 전환 마우스의 활용, TPF 현미경은 생체 내 21, 22의 개발 과정에서 시냅스 가소성과 축삭 신장의 탐사에 적용되었습니다. 유일하게 손상된 신경 세포의 T 그 기능에 부상이 특히 관심의 축삭을 대상으로 상해의 모델 두 광자 이미징에 의해 생체 모니터링에 커플 링에 의해 조사 할 수 있습니다 후 다시 자라게. 펨토초 펄스의 다 광자 흡수는 하나의 수상 돌기 또는 한 쪽이 5,23을 방해하는 데 사용되었습니다. 또한,이 부상 패러다임은 연락 덴 드라이트 (dendrite) 6을 방해하지 않고 하나의 축삭 가지를 절단 할 수 있습니다. 한 번 손상, 소뇌 등산 섬유 (CFS) 자신의 축삭을 재생하는 특정 신경 세포의 인구 수 있도록 기능을 해부의 컨텍스트 내에서 유용한 모델 SI는후부 그들은 심지어 성인 동물 (24, 25)의 부상 후 뛰어난 플라스틱의 특성을 유지합니다. 최근 CF 및 장기 이미징은 이러한 축삭 레이저 axotomy 6에 따라 일 재성장 할 수 있다는 것을 보여 주었다.
이 프로토콜은 선행 성 추적을 통해 olivocerebellar 뉴런과 자신의 축삭 신장 레이블을하는 방법에 대해 설명합니다. 관심의 신경 세포가 형광 표지되면, 그들은 두개골 창 아래에 몇 주 또는 몇 달 임의의 시점에서 반복적으로 모니터링 할 수 있습니다. 생체 내에서 레이저 axotomy에 의해 하나의 축삭 가지를 해부하는 절차는 설명한다.
여기에 제시된 기술은 생체 내에서 축삭 리모델링의 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공하고 신경 세포의 변성을 제한하고 축삭 재성장을 촉진하는 치료 전략의 개발을하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Protocol
1. 축삭 라벨링
- 클라이밍 섬유는 고 분자량 덱스 트란 또는 형광 단백질 26-29의 발현을 유도하는 플라스미드 /의 바이러스에 접합 된 유기 염료 하나를 주사하여 표시 할 수있다. 이 프로토콜, 유기 염료 알렉사 플 루어 488 덱스 트란은 등반 섬유 레이블 (그림 1) 소뇌 피질을 시각화하기 위해 하부 올리브에 주입된다. 여기에 설명 된 모든 절차는 건강의 이탈리아 교육부에 의해 승인되었습니다.
- 마이크로 피펫 풀러에 당겨 유리 모세관 튜브를 준비한다. 외부 직경이 대략 30 μM이다까지 가위 유리 모세관 튜브의 팁을 잘라.
- 덱스 트란 - 복합 염료의 1-2 μL와 모세관을로드합니다.
- 시작하기 전에, 오토 클레이브의 모든 수술기구를 소독. 절차를 수행하는 동안, 유리 구슬 살균기를 사용에 의한 오염의 위험을 줄일 수 있습니다.
- 마우스 (9-12 마취케타민 (90 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (9 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사 주). 동물이 완전히 꼬리 및 / 또는 발가락 핀치를 사용하여 침착되어 있는지 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
- 면도날이나 제모 크림 하나와 목 위의 털을 면도. 에탄올 70 % 번갈아 베타 딘, 회 수술 부위를 면봉.
- 정위 홀더에 마우스를 놓습니다. 가열 패드로 동물을 따뜻하게 유지.
- 머리가 단단히 고정되도록 조심스럽게 옆에 귀를 뼈에 earbars을 누릅니다. 몸을 140 ° 각도를 형성하기 위해 머리를 돌립니다. 원하는 방향으로 부드럽게 정위 홀더 상 코 홀더로드의 높이를 변경함으로써 얻을 수있다.
- 귀 사이의 피부에 리도카인의 몇 방울을 적용합니다. 후두부 아래의 피부에 약 1 ㎝의 수직 절개를 수행하기 위해 집게 나 면도날을 사용합니다.
- 조심스럽게 무딘 트위터에 피하 조직과 근육을 분리해부 현미경의. 수평 근육 번들을 아래로 누르고 난원 매그넘을 통해 경질을 노출하기 위해 두 개의 수직 근육 다발을 따로 보유.
- 극도의주의를 사용하여 뇌간을 노출하는 주사기 바늘 또는 매우 날카로운 집게로 경질을 해부하다. 경질이 절단되었을 때 뇌 - 척수의 작은 양이 쏟아 질 수있다.
- 정위 미세 조작기에서 수직에서 모세관 45 °의 홀더를 회전합니다. 소뇌 피질의 꼬리 가장자리와 첫 번째 경추 사이의 중간에, 중간 선에서 모세관을 놓습니다. 표면에서 2mm의 깊이에 피펫을 삽입합니다.
- 10 ~ 15 분에 걸쳐 염료의 0.5 ~ 1.5 ㎕의 볼륨을 제공합니다. 미세 주입 분배 시스템은 모세관에 액체의 제어 압력 전달을 할 수 있습니다 (펄스 압력 = 20 PSI, 펄스 지속 시간 = 3 ~ 4 밀리 초, 펄스 전달 = 12 Hz에서의 주파수).
- 다음, 15 분 동안 자리에 모세관을 남겨 slowlY는 (2 ~ 3 분에)를 제거합니다. 섬세하게 근육을 다시 정렬하고 위의 피부를 봉합. 물론 전체 절차를 통해 식염수를 적용하여 수화 근육을 유지합니다.
- 탈수를 방지하기 위해 피하에 0.5 ㎖의 0.9 % NaCl을 주입. 마취에서 완전히 회복 될 때까지 가열 새장에 동물을 유지합니다.
- 피하 수술 후 2 ~ 3 일 동안 매일 Carprofen (5 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다.
소뇌 피질에 2. 광학 창
참고 : 염료 (그림 1 참조)의 CF 단자 소뇌 피질 하부 olivary 핵까지에서 2 주에 전송됩니다. 띄엄 띄엄 표시의 CF는 다음과 같이 수행 할 수있는 영구적 인 뇌 창에서 시각화 할 수 있습니다 :
- 모든 수술기구를 소독.
- 상술 한 바와 같이 마우스를 마취. 동물을 확인하기 위해 발가락 핀치를 사용하여 완전히 진정된다.
- SK 닦아 머리 위에 머리를 면도70 % 알코올, 베타 딘의 교류 강타로 눈 연고를 적용합니다. 고정대에 마우스를 놓고 단단히 머리를 유지하기 위해 귀 막대를 놓습니다.
- 피하 두개골 창 사이트의 뇌 가능한 염증의 붓기를 방지하기 위해 덱사메타손 (0.2 ㎎ / ㎏)과 Carprofen (5 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다.
- 귀 사이에서 눈 위를, 두개골 위의 피부에 리도카인의 드롭을 적용하고 플랩을 잘라. 메스로 긁어 전에 골막에 다시 리도카인 솔루션을 적용합니다.
- 소뇌 위의 두개골의 얇은 반원형의 영역으로 치과 드릴을 사용합니다. 두개골 깊이 반원의 둘레에 걸쳐 거의 일정하도록 윈도우는 일반적으로, 중앙과 뒤 봉합사를 향해 배치된다. 이 두꺼운 영역에 람다 봉합하고 반복 훈련에 너무 가까이 창을 배치하면 부종의 뇌 형성의 과열을 초래할 수 있습니다.
- 지혈을 적용출혈의 경우 두개골에 스펀지.
- 면도날과 족집게의 도움으로 두 개의 반쪽 커버 글라스를 잘라. 커버 글라스가 뼈의 섬보다 약간 큰이며, 핀셋 뼈의 플랩을 제거하기 전에 유사한 모양을 가지고 있는지 확인합니다; 하지 않을 경우, 커버 글라스 모양을 변경하거나 다른 하나를 선택합니다. 뼈를 그리는 동안 족집게로 경막을 만지지 마십시오. 조심스럽게 경질에 커버 글라스를 내려 놓으십시오. 참고 : 경질의 유리의 표면 전체의 준수가 오래 지속 두개골 창을 예고한다.
- 반복 식염수로 세척하고면 스틱 건조가 유리 아래로 기포를 제거합니다. 이것은 또한 유리를 배치 한 후 작은 모세 혈관 밖으로 유출 될 수있는 몇 가지 잔여 혈액을 제거하는 데 도움이 될 것입니다. 아크릴 글루 치과 시멘트 (30)의 혼합물을 밀봉 창.
- 완전 마취에서 회복 될 때까지 회수 챔버에서 가열 패드 위에 동물을 계속. 다시 사용하지 마십시오완전히 회복 될 때까지 홈 케이지에 마우스를 켠다; 그들은 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인를 두지 마십시오.
- 피하 수술 후 2 ~ 3 일 동안 매일 Carprofen (5 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다.
3. 생체 다 광자 레이저 Axotomy
- 첫 번째 영상 세션을 수행하기 전에 수술 2-7일 기다립니다. 사파이어 레이저 소스 (120 FS 폭 펄스, 90 MHz의 반복율) 우선 갈바 노 미러의 쌍에 의해 스캔 후 수침 (20X)에 의해 시료 상에 집중된다 : 여기에서 사용 이광자 현미경 내장 지정은 티타늄으로 제공된다 목적 (NA 0.95, WD 2mm). 폐쇄 루프 압전 스테이지는 대물 400 μM까지의 축 방향 변위를 수행한다. 광전자 배증 관은 형광 신호를 수집합니다.
- 두개골 창 objecti에 평행하게 놓 이도록 동물을 마취 한 후 정위 홀더에 머리를 위치초점면을했습니다.
- TPF는 두개골 창 아래 피질 이미징과 탐색. 밝은 사람 사이에 손상 될 수있는 축삭을 선택합니다.
- Z-스택을 취득 대상 축삭의 3 차원 재구성을 얻기 위해 (일반적으로 시야는 512 X 512 픽셀, 2 μm의 Z-축 단계에서, 100 × 100 μm의 2). 이미지가 볼륨 내에서 초점면에 주로 병렬 자리 축삭 분기에 병변 사이트를 선택합니다. 이 방향은 신속하게 성공적으로 절개의 예측이다 형태 학적 변화를 득점 할 수 있습니다.
- CF의 말단 부분에 선택한 점 복용량 높은 에너지를 조사. 이는 LabVIEW 소프트웨어를 통해 수행된다 : (1 ~ 4 라인 스캔을 수행하는 갈바 노 미러의 위치를 설정, 영상 (대물 렌즈 후에 측정 ≈ 300 mW의)에 사용되는 전력보다 5 배 이상의 레이저 파워를 증가 - 10 병변 사이트에 μM) 및 (400)의 레이저 셔터를 엽니 다 - 600 밀리 초. 라인 스캔 배향CF의 평면에 수직 완전히 축삭을 절개합니다. 밝은 장소 (예를 들면., 정맥류)를 조사하는 것은 일반적으로 축삭을 해부하는 데 도움이됩니다. 레이저 axotomy에 대한 파장은 영상 (920 nm의)에 사용되는 동일합니다.
- 일반적으로 조사 지역에있는 축삭의 형광 photobleaching에 일시적으로 인해 감소한다. 조사가 절제 제대로 수행되었는지를 보장하기 위해 후에 동일한 영역 몇 분의 스택을 획득. 지역 붓기 시작 축삭 구슬 같은 구조가 형성되면 신경 세포가 성공적으로 해부하고있다. 이 경우, 몇 시간 (분의 수십에서 24 시간에) 축삭의 말단 부분은 퇴화 완전히 사라집니다.
- 불행히도 완전한 axotomy을 생성하는데 필요한 에너지 량은 항상 예측 가능하지 않다. 조사의 결과 만이 photobleaching에 경우, 형광이 빠르게 확산 염색에 의한 회복되어야하고, 방사선 조사 효과에 다시 반복해야LY는 축삭을 해부하다. 또한, 경우에 부종의 증상은 5에서 표시되지 않습니다 - 증가하는 새로운 검사와 함께 다시 시도 (. 유사 레이저 dendrotomy에 기술 된 내용에, 알레그라 Mascaro 등 23 참조) 20 분, 또는 부종은 회복 다음에 시간 및 / 또는 레이저 파워 드웰.
- 생체 내 이미징에서 두 광자와 레이저 axotomy을 따라 일 축삭의 최종 리모델링 모니터 (그림 2와 그림 3). 혈관 패턴은 다음 일 해부 축삭을 검색하기 위해 참조 패턴으로서 사용된다.
- 피하 Carprofen (5 ㎎ / kg) 실험의 전체 지속 기간에 대한 모든 촬상 세션을 관리.
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Representative Results
이 프로토콜은 하나의 뉴런의 축삭 라벨, 생체 내 이미징 및 레이저 axotomy을 수행하는 방법을 설명했다. 실험의 타임 라인은도 1에 도시된다.
알렉사 형석 488 덱스 트란으로 표시하고 생체 이광자 현미경으로 두개 창 아래 시각의 CF의 예는도 2에보고된다. 이전 6,27보고 된 바와 같이, 상승하는 분기 수일의 관찰 기간에 걸쳐 높은 안정성을 표시 .
그림 3은 CF의 단일 분기의 레이저 axotomy 의해 축삭 단절의 예를 나타낸다. 전술 한 바와 같이, 손상은 외광의 고 에너지 도즈와 CF의 말단 지점 (PIA 아래 ~ 30 μM)을 조사함으로써 실시 하였다. 도 3의 제 2 패널에 도시 된 바와 같이, 15 분, 레이저 조사 후 축삭의 말단부는 붓기 degene 개시평가. 하루 후, 병변 사이트에 축삭의 말단 부분은 완전히 (그림 3, D17)를 사라졌다. 퇴화 한 부분은 시간 경과에 빨간 화살촉에 의해 강조된다. 마지막 두 패널은 (생체 내에서 레이저 axotomy 후 새 가지의 발아에 대한 자세한 내용은 6에서 확인하실 수 있습니다) 부상당한 축삭에서 새 횡단 지점 (녹색 화살표 모양)의 점진적 형성을 보여줍니다.
레이저 nanosurgery 실험의 그림 1. 타임 라인. 열등 olivary 핵에 주입 한 후, 복구 2 주 선행 성 덱스 트란 - 복합 염료 등반 섬유 레이블을 할 수 있습니다. 소뇌 피질이어서 영구 두개 창을 수행하여 노출된다. 나중에 2-7에서 표시된 CFS 및 이광자 MICR하에 이미징 될 수있다임의의 시간 간격으로 생체 내 oscope. 표지 축삭에 레이저 nanosurgery가 두개골 창 후 언제든지 수행 될 수는 이식되었다.
그림 2. 등반 섬유 라벨. 왼쪽 패널 알렉사 플 루어 488 덱스 트란으로 표시하고 TPF 현미경으로 생체 내에서 시각화 CF의 예를 보여줍니다. 오른쪽 패널은 16 일 (D16)에서 D18에 같은 CF의 시간 경과 이미지를 표시합니다. 스케일 바, 10 μm의.
그림 3. 등산 섬유의 단일 지점에 레이저 axotomy. 신경 세포가 조사 된 곳 D16의 빨간색 화살표가 가리키는. 레드 화살촉의 highlig레이저 axotomy (D18) 후 축삭의 말단 부분의 실종 HT. 새로 형성된 가로 분기 녹색 화살촉에 의해 지적되고있다. 스케일 바, 10 μm의.
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Discussion
이 프로토콜은 형광 염료와 하부 올리브의 뉴런 레이블을하는 방법을 보여줍니다. 이어서, 소뇌 피질에 두개 창을 수행하는 방법을 설명한다. 이 기술은 olivocerebellar 신경, 등산 섬유의 단자 부분에 광 액세스를 제공합니다. 불행하게도, 라벨 및 개두 수술 모두의 결과는 (일반적으로 3 마우스 중 1 표시, 1 3 중 두개골 창 1 ~ 2 주 후에 명확 유지됩니다)도 숙련 된 운영자의 손에 아주 낮다.
살아있는 마우스에서 레이저 axotomy를 수행하는 절차는 다음 제시된다. 이 방법은 대상 사이트에 형광 뉴런을 해부 할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 부상의 패러다임은 어느 기계적 단절이나 화학 물질을 사용하여 뇌 조직의 대규모 파열의 원인이 있지만,이 모델의 키 강도가 높은 공간 협착 및 특이성이다. 사실, 이전의 연구는 t을 살려주는 동안 한 쪽은 절제 할 수 있다는 것을 보여 주었다그는 부모 덴 드라이트 5 구조적 무결성; 또한, 하나의 축삭 분기 영구 신경교 흉터 6의 형성을 회피 중단 될 수있다. 변성 후, 프로세스는 물론 신경 세포 손상의 최후 개조 등, 실시간으로 따라야 할 수있다. 이 방법은 따라서 생체 내에서 축삭 구조 소성의 기본 메커니즘을 연구 할 수있는 강력한 도구입니다.
선택된 구조를 해부의 가능성은 구조의 깊이들에 대한 그것의 형광 발광 강도에 대한 제 근사치에 의존한다. 두 광자 현미경 깊은 600 ~ 800 μm의 이미징 신경을 수 있지만, 우리는 nanosurgery이 (300mm까지) 피질의 첫 번째 층으로 제한됩니다 것으로 나타났습니다.
이 프로토콜 레이저 axotomy 소뇌 등반 섬유를 대상으로했지만, 이것은 살아있는 뇌에 어떠한 형광 구조를 해부하는데 사용될 수있다. 레이저 조사는 하나의 신경 세포 CE를 해부하는 데 사용되었습니다몸, 수지상 가지, 축삭 또는 형질 전환 마우스 5,8,9,23의 피질에있는 GFP - 라벨 피라미드 뉴런의 한 쪽거야.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fsec width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, hemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
References
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