Summary
Imagem de dois fótons, acoplado a nanodissection laser, são ferramentas úteis para estudar processos degenerativos e regenerativos no sistema nervoso central, com resolução subcelular. Este protocolo mostra como rotular, imagem e dissecar fibras escalada individuais no córtex cerebelar in vivo.
Introduction
Transecção axonal resultante de uma lesão mecânica, lesão tóxica ou doenças neurodegenerativas é geralmente seguido por degeneração da parte distal do axónio que é destacada do corpo celular 10-13. Com poucas exceções 2,7,14,15, os axônios cortados no SNC de animais adultos são geralmente incapazes de ativar um programa de rebrota 16.
Pouco se sabe sobre a dinâmica em tempo real de eventos degenerativas no nível celular e subcelular. O desenvolvimento de novas estratégias para limitar a lesão neuronal e na promoção recrescimento neuronal requer, como um primeiro passo, que clarifica o mecanismo pelo qual as células neuronais lesionados singularmente degenerar e regenerar. Este estudo é mais diretamente dirigida pelo monitoramento da dinâmica de um único neurônio in vivo. Embora as técnicas de um fóton de fluorescência de imagem são limitados por intensa dispersão de luz visível, de dois fótons de excitação atinge camadas corticais profundas na live ratos com resolução 3,4,17 subcelular. Tirando partido de ratinhos transgénicos nos quais as proteínas fluorescentes são expressas selectivamente em subpopulações de neurónios 18-20, microscopia TPF foi aplicado para a exploração de plasticidade sináptica e elongação axonal durante o desenvolvimento in vivo 21,22. Que t capacidade de neurónios danificados a singularmente regredir após a lesão pode ser investigado pelo acoplamento no monitoramento vivo pela imagem de dois fótons com um modelo de lesão especificamente orientadas para o axônio de interesse. Absorção multi-fotão de pulsos femtosecond foi utilizado para destruir a dendritos individuais ou mesmo espinhas individuais 5,23. Além disso, este paradigma ferimento permite cortar ramos axonais individuais sem interromper o dendrito contato 6. Dentro do contexto da dissecando as características que permitem a população neuronal específica para regenerar os seus axónios uma vez danificados, fibras de escalada de cerebelo (SFC) é um modelo útil Since eles mantêm notáveis propriedades plásticas após a lesão, mesmo em animais adultos 24,25. Recentemente, a imagem latente a longo prazo de FC mostraram que estes são capazes de axónios renováveis nos dias que se seguem axotomia de laser 6.
Este protocolo descreve como rotular neurônios olivocerebellar e seu alongamento axonal através de rastreamento anterógrado. Uma vez que os neurónios de interesse são marcadas por fluorescência, que pode ser monitorado repetidamente nos pontos de tempo arbitrárias durante semanas ou meses ao abrigo de uma janela craniana. O procedimento para dissecar ramos axonais individuais por axotomia do laser in vivo serão então ilustrado.
As técnicas apresentadas aqui fornecer novos insights sobre o mecanismo de remodelação axonal in vivo e pode ajudar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para limitar a degeneração neuronal e promover o crescimento axonal.
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Protocol
1. Labeling axonal
- Fibras de escalada podem ser marcados quer por injecção de corantes orgânicos conjugados com dextranos de elevado peso molecular ou de plasmídeo / vírus que induzem a expressão de proteínas fluorescentes 26-29. Neste protocolo, o corante orgânico Alexa Fluor Dextran 488 é injetado na oliva inferior a rotular fibras escalada e visualizá-los no córtex cerebelar (Figura 1). Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano.
- Prepare o tubo capilar de vidro, puxando-o em um extrator micropipeta. Corte a ponta do tubo capilar de vidro com uma tesoura até o diâmetro externo é de cerca de 30 mm.
- Carregar o capilar com 1-2 mL do corante de dextrano conjugado.
- Antes de começar, esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em uma autoclave. Durante o procedimento, a reduzir os riscos de contaminação, usando um esterilizador de contas de vidro.
- Anestesiar o rato (9-12semanas) por injecção intraperitoneal de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (9 mg / kg). Certifique-se de que o animal está totalmente sedado com cauda e / ou beliscões dedo do pé. Use veterinário pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia.
- Raspar os cabelos acima do pescoço ou com uma lâmina de barbear ou creme de depilação. Limpe o local cirúrgico, duas vezes com betadine, alternadas com etanol a 70%.
- Posicione o mouse sobre um suporte estereotáxico. Mantenha o animal aquecido com uma almofada de aquecimento.
- Suavemente empurrar os earbars no osso ao lado das orelhas, de modo que a cabeça é mantida firmemente. Rotação da cabeça de modo a formar um ângulo de 140 ° com o corpo. A orientação desejada pode ser obtida, alterando ligeiramente a altura da haste de suporte de nariz no suporte estereotáxico.
- Aplique algumas gotas de lidocaína na pele entre as orelhas. Use uma pinça ou uma lâmina de barbear para efectuar uma incisão vertical de aproximadamente 1 cm na pele abaixo do occipital.
- Delicadamente separar o tecido subcutâneo e os músculos por pinça sem cortes sob o microscópio de dissecação. Empurre para baixo o feixe muscular horizontal e mantenha para além dos dois músculos fascículos verticais, a fim de expor a dura sobre o forame magno.
- Usando extrema cautela, dissecar a dura com uma agulha de seringa ou uma pinça muito afiada para expor o tronco cerebral. Uma pequena quantidade de fluido cérebro-espinhal pode derramar quando a dura foi cortada.
- No micromanipulador estereotáxica, rodar o titular do capilar a 45 ° em relação à vertical. Colocar o capilar na linha média, no ponto médio entre a extremidade caudal do córtex cerebelar e da primeira vértebra cervical. Inserir a pipeta, a uma profundidade de 2 mm a partir da superfície.
- Entregar um volume de 0,5-1,5 mL de corante ao longo de 10-15 min. Um sistema de distribuição de microinjecção permite o fornecimento de pressão controlada do líquido no tubo capilar (pressão de pulso = 20 psi; duração do impulso = 3-4 mseg; frequência de pulso entrega = 12 Hz).
- Deixar o capilar no local durante 15 minutos, em seguida, slowly (em 2-3 min) removê-lo. Delicadamente realinhar os músculos e suturar a pele acima. Mantenha os músculos bem hidratados, aplicando alguns salina durante todo o procedimento.
- Para evitar a desidratação, injectar por via subcutânea 0,5 ml de NaCl a 0,9%. Mantenha o animal em uma gaiola aquecida até a recuperação completa da anestesia.
- Subcutânea administrar Carprofen (5 mg / kg) por dia por 2-3 dias após a cirurgia.
2. Janela óptica no Córtex Cerebelar
NOTA: O corante é transportado em 2 semanas a partir do núcleo olivar inferior até o córtex cerebelar aos terminais CFs (ver Figura 1). Os FCs escassamente marcadas podem ser visualizadas sob a janela craniana permanente que pode ser realizada como se segue:
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos.
- Anestesiar o rato, tal como descrito acima. Use pitadas de dedo para verificar o animal está completamente sedada.
- Raspar o cabelo acima da cabeça, limpe o skcom alternância de furtos de 70% de álcool e betadine e aplicar pomada. Posicione o mouse em um quadro estereotáxico e posicionar as barras de ouvido, a fim de segurar com firmeza a cabeça.
- Subcutaneamente administrar dexametasona (0,2 mg / kg) e carprofeno (5 mg / kg) para prevenir a expansão do cérebro e possíveis inflamações no local da janela craniana.
- Aplicar uma gota de lidocaína na pele acima do crânio e cortar uma aba, de entre as orelhas para acima dos olhos. Aplicar solução de lidocaína novamente para o periósteo antes de raspá-lo com um bisturi.
- Use a broca dental para diluir uma região semicircular do crânio acima do cerebelo. A janela é geralmente colocado central e em direcção à volta da sutura, de modo que a profundidade do crânio é quase constante em todo o perímetro do semicírculo. Posicionando a janela muito perto da sutura lambda e perfuração repetitivo sobre esta região muito grosso pode resultar em superaquecimento do cérebro e da formação de edemas.
- Aplicar hemostáticoesponja no crânio no caso de hemorragia.
- Cortar uma lamela em duas metades, com a ajuda de uma lâmina de barbear e uma pinça. Verifique se a lamela é ligeiramente maior do que a ilha de osso e tem uma forma semelhante, antes de remover a tampa do osso com a pinça; se não, reformular a lamela ou escolha outro. Não toque na dura-máter com a pinça enquanto desenha fora do osso. Cuidadosamente estabelecer a lamela sobre a dura-máter. NOTA: A adesão de toda a superfície do vidro sobre a dura-máter está predizendo de janelas longas cranianos duradouros.
- Remova as bolhas de ar sob o vidro de lavagem repetidas vezes com solução salina e secagem com cotonetes. Isso também irá ajudar a remover um pouco de sangue residual que possa ser derramado para fora de pequenos capilares depois de posicionar o vidro. Selar a janela com uma mistura de cola de acrílico e cimento dental 30.
- Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento em uma câmara de recuperação até que esteja totalmente recuperado da anestesia. Não retransformar os ratos na gaiola até que esteja totalmente recuperado; não deixá-los abandonados, até que recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
- Subcutânea administrar Carprofen (5 mg / kg) por dia por 2-3 dias após a cirurgia.
3. In Vivo Multi-fóton Laser axotomia
- Espere 2-7 dias da cirurgia antes de realizar a primeira sessão de imagem. O costume construído microscópio de dois fótons usada aqui é fornecido com um Ti: fonte de laser Sapphire (120 fs pulsos de largura, taxa de repetição de 90 MHz), o que é verificado pela primeira vez por um par de espelhos galvanométricos e depois se concentrou na amostra por uma imersão em água 20X objetivo (NA 0,95, WD 2 mm). A fase piezoelétrico de circuito fechado realiza deslocamentos axiais de até 400 mM do objetivo. Tubos fotomultiplicadores recolher o sinal de fluorescência.
- Anestesiar o animal, em seguida, posicione a cabeça no suporte estereotáxica para que a janela craniana estabelece paralelos ao objective plano focal.
- Explore com TPF imagens do córtex sob a janela craniana. Escolha o axônio de ser danificado entre os mais brilhantes.
- Adquirir uma pilha-Z (em geral o campo de visão é de 100 x 100 mm 2, de 512 x 512 pixels, 2 um passo eixo z) para obter um 3D-reconstruções do axónio alvo. Dentro do volume fotografada, escolher o local da lesão axonal num ramo que se encontra principalmente em paralelo ao plano focal. Esta orientação permite marcar rapidamente alterações morfológicas, que são preditivos de uma dissecção de sucesso.
- Irradiar com uma dose elevada de energia no ponto seleccionado sobre uma parte distal de um CF. Isto é feito através do software Labview: aumentar a potência do laser 5-10x mais do que a energia usada para geração de imagens (≈ 300 mW, medida após a lente objetiva), defina a posição dos espelhos galvanométricos para fazer uma varredura de linha (~ 4 - 10 mm) no local da lesão e abrir o obturador laser para 400-600 ms. Orientar a verificação das linhasperpendicular ao plano de CF para transecção completamente o axónio. Irradiando pontos brilhantes (por exemplo., Varizes) geralmente ajuda a dissecar o axônio. O comprimento de onda do laser para axotomia é o mesmo utilizado para a imagem latente (920 nm).
- Normalmente, a fluorescência do axónio na área irradiada transiente diminui devido à fotodegradação. Adquirir uma pilha dos mesmos região poucos minutos após a irradiação para assegurar a ablação tem sido bem realizada. Se a região começou a inchar e do axônio formaram estruturas de contas-like, o neurônio foi dissecado com sucesso. Neste caso, em poucas horas (de algumas dezenas de minutos a 24 horas), a porção distal do axónio degenera e desaparecer completamente.
- Infelizmente, a dose de energia necessária para produzir uma axotomia total, nem sempre é previsível. Se o único resultado da irradiação é a fotodegradação, a fluorescência deveria ser rapidamente recuperados, devido à difusão do corante, e a irradiação deve ser repetido mais uma vez a eficácialy dissecar o axônio. Além disso, no caso de sinais de inchaço não aparecem dentro de 5 - 20 min, ou o inchaço é seguido por recuperação (. Analogamente ao que foi descrito para o dendrotomy laser, ver Allegra Mascaro et al 23), tente novamente com novas verificações aumentando o o tempo de paragem e / ou a potência do laser.
- Monitorar a eventual remodelação do axônio, nos dias que se seguem à axotomia laser com dois fótons de imagem in vivo (Figuras 2 e 3). O padrão vascular é utilizado como padrão de referência para recuperar o axônio dissecado nos dias seguintes.
- Subcutânea administrar Carprofen (5 mg / kg) a cada sessão de imagens para toda a duração do experimento.
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Representative Results
Este protocolo descrito como realizar rotulagem axonal, imagem in vivo e axotomia laser sobre os neurônios individuais. A linha do tempo da experiência é mostrado na Figura 1.
Um exemplo de FCs marcadas com Alexa Fluor 488 Dextrano e visualizadas sob a janela craniana in vivo por microscopia de dois fotões é apresentado na Figura 2. Como relatado anteriormente 6,27, os ramos ascendentes exibir uma elevada estabilidade ao longo do período de observação de vários dias .
A Figura 3 mostra um exemplo de corte axonal por axotomia do laser de uma única ramificação de um CF. Como descrito anteriormente, o dano foi realizada por irradiação de um ramo distal (~ 30 mm abaixo do pia) de uma CF com uma dose elevada de energia de luz infravermelha. Como se mostra no segundo painel da Figura 3, 15 minutos após a irradiação a laser na porção distal do axónio começaram a inchar e degeneraçãoclassificação. No dia seguinte, a porção distal do axónio para o local da lesão desapareceu completamente (Figura 3, d17). A parte degenerada é destacado pelas setas vermelhas ao longo do tempo. Os últimos dois painéis mostram também a formação progressiva de um novo ramo transversal (seta verde) do axônio feridos (mais detalhes sobre o surgimento de novos ramos após axotomia do laser in vivo podem ser encontrados em 6).
Figura 1. Timeline do experimento nanosurgery laser. Após a injecção no núcleo olivar inferior, duas semanas de recuperação permitirá que o corante dextrano conjugado anterógrada para rotular as fibras de escalada. O córtex cerebelar é então exposto através da realização de uma janela craniana permanente. De 2-7, mais tarde, os FCs rotulados podem ser visualizados sob a micr dois fótonsoscope in vivo a intervalos de tempo arbitrárias. O Nanocirurgia laser sobre os axónios marcados podem ser realizados em qualquer momento após a janela craniana foi implantado.
Fibras Escalada Figura 2. Rotulagem. O painel esquerdo mostra um exemplo de um CF marcado com Alexa Fluor 488 Dextrano e visualizado in vivo por microscopia TPF. Painéis da direita exibir imagens de lapso de tempo de uma mesma CF a partir do dia 16 (d16) para d18. Barra de escala, 10 ^ m.
Figura 3. Axotomia Laser em um único ramo de uma fibra de escalada. O neurônio foi irradiado onde os pontos de seta vermelha no d16. Setas vermelhas highlight o desaparecimento da porção distal do axónio após axotomia do laser (d18). Um ramo transversal recém-formado é apontada pela seta verde. Barra de escala, 10 ^ m.
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Discussion
Este protocolo apresenta a forma de rótulo neurónios do oliva inferior com um corante fluorescente. Subsequentemente, o método para executar uma janela craniana no córtex cerebelar é descrito. Esta técnica permite o acesso óptico para a porção terminal de neurónios olivocerebellar, as fibras de escalada. Infelizmente, o resultado de ambos rotulagem e cirurgia craniotomia é bastante baixa, mesmo nas mãos de operadores qualificados (geralmente 1 de 3 camundongos é rotulado, e 1 em cada 3 janelas cranianas permanece clara após 1-2 semanas).
O procedimento para realizar a axotomia do laser em ratos vivos é então apresentada. Este método permite dissecar neurônios fluorescentes em sites segmentados. Enquanto paradigmas lesão comumente utilizados, seja por corte mecânico ou o uso de produtos químicos, causam enorme perturbação do tecido cerebral, a força fundamental deste modelo é o alto confinamento espacial e especificidade. De fato, estudos anteriores mostraram que as espinhas individuais podem ser cauterizado, poupando tele integridade estrutural do dendrito mãe 5; Além disso, os ramos axonais individuais podem ser rompidas evitando a formação de uma cicatriz glial persistente 6. O processo de degeneração pode ser seguido em tempo real, bem como a eventual remodelação do neurónio ferido. Este método é, portanto, uma ferramenta poderosa para o estudo do mecanismo de base de plasticidade estrutural axonal in vivo.
A possibilidade de dissecar estruturas seleccionadas depende, em primeira aproximação, a profundidade da estrutura e da sua intensidade de emissão de fluorescência. Embora microscopia de dois fotões permite que os neurónios de imagem até 600-800 mM profunda, verificou-se que o Nanocirurgia está limitada às primeiras camadas do córtex (superior a 300 mm).
Neste protocolo axotomia laser foi orientada para fibras de escalada cerebelar, mas pode ser utilizado para dissecar qualquer estrutura fluorescente no cérebro vivo. A irradiação laser foi usada para dissecar único ce neuronalll corpos, ramos dendríticas, axônios ou espinhos individuais de neurônios piramidais marcado com GFP no córtex de camundongos transgênicos 5,8,9,23.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fsec width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, hemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
References
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