רצף ברקוד מופעל של Tetrads: BEST

Summary

רצף ברקוד מופעל של Tetrads (הטובים ביותר) מחליף את התהליכים ידניים של בידוד, שיבוש ומרווח tetrads. BEST מבודד tetrads ידי תא הקרינה המופעל מיון על גבי צלחות אגר, מפריד את הנבגים על ידי תסיסה עם חרוזי זכוכית, וקובע שמושבות ערוכות באופן אקראי נגזרו מאותו הטטרדה המקורי באמצעות ברקודים מולקולריים.

Abstract

ניתוח הטטרדה הוא כלי רב ערך עבור שמרי גנטיקה, אבל טבע מדריך למייגע של התהליך יש הפריע יישומה בקנה מידה גדולה. ברקוד מופעל רצף של Tetrads (הטובים ביותר) ¹ מחליף את התהליכים ידניים של בידוד, שיבוש ומרווח tetrads. BEST מבודד tetrads מכוחו של חלבון ה-GFP היתוך נביגה ספציפית המאפשר מיון תא הקרינה המופעל של tetrads ישירות על גבי צלחות אגר, שבו הנאד מתעכל enzymatically והנבגים הם שיבשו באופן אקראי וערוך על ידי ציפוי חרוז זכוכית. המושבות הפלואידים מכן הוקצו יחסי נבג אחות, כלומר מידע על שנבגי מקורו מאותו הטטרדה, באמצעות ברקודים מולקולריים לקרוא בגנוטיפ. על ידי הסרת את צוואר הבקבוק של נתיחה ידנית, ניתן לבודד מאות או אפילו אלפי tetrads בתוך דקות. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של הפרוצדורות הנדרשות לביצוע הטובים ביותר בשמריםשמר אפייה, החל במתח דיפלואידי הטרוזיגוטיים דרך הבידוד של מושבות נגזרות מצאצאי meiotic הפלואידים.

Introduction

מיפוי Meiotic גן, הידוע בכינויו ניתוח הטטרדה, הוא מרכזי לשמרי גנטיקה. בקצרה, שני זנים הפלואידים, המכילים עותק אחד של כל כרומוזום, הם הזדווגו כדי ליצור מתח דיפלואידי הטרוזיגוטיים עם שני עותקים של כל כרומוזום, אחד מכל הורה. הרעבת תאי דיפלואידי לחנקן גורמת למיוזה (נביגה) שבו הכרומוזומים לשכפל, לעבור ארגון מחדש, ומתחלקים לארבעה תאים הפלואידים (נבגים או segregants) עם צירופים חדשים של אללים מכל הורה. ארבעה נבגים הנובעים ממיוזה יחידה יכולים להיות מבודדים על ידי תהליך ידני שנקרא נתיחת הטטרדה.

^2,3 הנתיחה הקונבנציונלי הטטרדה שהשתנה מעט יחסית מאז הפרסום המקורי בשנת 1937 ^4, יש שלוש מטרות. ראשית, תאים שעברו מיוזה (tetrads) חייבים להיות מבודדים מרקע של תאי צמח. בניתוח קונבנציונלי, זה נעשה על ידי חוקר ש, באמצעותמיקרוסקופ, מבחינה ויזואלית מזהה tetrads על צלחת אגר ומעסיק מנגנון micromanipulator חזותי זיהוי tetrads על צלחת אגר ובאמצעות micromanipulator לעבור הטטרדה על אזור ללא תא של הצלחת. בשלב הבא, ארבעת הנבגים בהטטרדה חייבים להיות מופרדים פיזי כדי למנוע הזדווגות interspore. נבגים בתוך הטטרדה מוחזקים יחד על ידי שני נאד, השריד של קיר התא של תא דיפלואידי המקורי, וקבוצה של interspore גשרים ^5. בניתוח קונבנציונלי הטטרדה הנאד יוסר על ידי עיכול אנזימטי, וחוקר משתמש micromanipulator לשבור גשרי interspore ולהקניט בנפרד הנבגים. לבסוף, הנבגים הבודדים אינם ערוכים בדפוס gridded ששומר על היחסים בין הנבגים, כלומר כל הצאצאים בשורה של ארבעה הם נבגי אחותו של אותו הטטרדה מקורי. שמרי חוקר מנוסה יכול להשלים את התהליך של ביתור 10 tetrads (מספר מינימאלי מקובללצלב) בכ 15 דקות.

פיתחנו שיטה חדשה תפוקה גבוהה גנוטיפ הטטרדה, שאנו מכנים E arcode B equencing S nabled של etrads T (הטובים ביותר) ^1. BEST מרחיב על שיטות קיימים בגנטיקה תפוקה גבוהה כך שהיא מאפשרת את הדור וגנוטיפ של מספרים גדולים של צאצאים כי הם מבודדים, genotyped, ונשמר כיחידים באופן שמאפשר יחסי נבג אחותו של כל ארבעת מוצרי meiotic להיות התאוששו. המטרה זו מושגת על ידי שימוש בשלוש אסטרטגיות עיקריות (איור 1). הראשון הוא המבוא של כתב לבנות כי תוויות בתאים שעברו מיוזה עם GFP ומאפשר להם להיות מבודדים על ידי תא הקרינה המופעל מיון (FACS). שני הוא השילוב של ברקוד DNA המורכב ביותר (מחרוזת של 15 נוקלאוטידים אקראיים) בטופס המועבר לכל ארבעת הנבגים של הטטרדה וניתן לקרוא על ידי רצפי DNA של ProGen רקומביננטיy ובכך מזהה את נבגי אחות מאותו הטטרדה. שלישי הוא צעד גנוטיפ, והטוב ביותר הוא תואם עם פלטפורמות גנוטיפ רבות שהלכידה שני סט של סמנים הגנומי כמו גם ברקוד הטטרדה ספציפי. אנו מעסיקים רצף הגבלה הקשורים אתר DNA תג (RAD-seq) שיטה ⁶ שמנתב את רצף הגנום לאתרי הגבלה ספציפי ^1, ובכך ללכוד 2-3% עקביים של הגנום של זני צאצאים, כמו גם את הברקוד שמקורן בפלסמיד . ההתאוששות של מערכות יחסים הטטרדה יחד עם נתונים גנוטיפ אמפירי הנגזרים מן הצלב מאפשרת היסק מדויק של מידע חסר, ובכלל זה מעמדם של סמנים עם כיסוי רצף נמוך והגנוטיפ של אנשים inviable (ולכן בלתי הפיך) המלא. כאן, אנו מתארים את יישום השיטה במיקרואורגניזם הנפוץ ביותר המשמש למיפוי meiotic, שמרי ס cerevisiae. עם זאת, עם החלפות של קטין ריאה האורגניזם ספציפירבותיי, למשל חלבונים נביגה ספציפית שונים התמזגו ה-GFP, השיטה צריכה להיות בקלות להעברה למיקרואורגניזמים אחרים, כוללים אורגניזמים שבו מיפוי meiotic הוא באופן משמעותי יותר עבודה אינטנסיבית או פתירה ברגע זה.

איור 1. השיטה הטובים ביותר. () פלסמיד pCL2_BC הוא פלסמיד 2 מיקרון עם פיוז'ן נביגה ספציפי GFP, התנגדות לG418, וברקוד אקראי 15 mer. בנייה של ספריית פלסמיד מתוארת באל Ludlow et ^1. (ב) בריכה של פלסמידים המינימרקטים הופכת לזן דיפלואידי מצלב. אז transformants (C) גדלים על בחירה ו~ 10,000 מושבות הפכו הם אספו וsporulated. במהלך המיוזה כל נבג של הטטרדה יורש שיתוףpy של פלסמיד המינימרקטים. Tetrads (ד ') מופרדים מתאי unsporulated ידי FACS ונאסף על צלחות אגר, שם הם מתעכלים ושבשו כדי לאפשר לכל נבג להקים מושבה. לאחר מכן מושבות (E) נאספות לתוך צלחות 96 היטב, phenotyped, וgenotyped. במהלך genotyping רקוד פלסמיד הוא לקרוא ומשמש לזיהוי ארבעה החברים של כל הטטרדה. נתון זה שונה מאל Ludlow et ^1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Protocol

1. בניית הזנים ואפיון

1. לבנות את מתח דיפלואידי הטרוזיגוטיים לשימוש בצלב על ידי הזדווגות זנים הפלואידים ובחירת diploids ² או באמצעות מתח הטרוזיגוטיים מתרחש באופן טבעי. הזנים לא צריכים נמל ה-GFP.
2. ודא שהמתח אינו יכול לגדול על YPD ² + 200 G418 מיקרוגרם / מיליליטר.
3. ודא שהמתח הוא מסוגל sporulate. BEST תואם צלבי יעילות נביגה נמוכים, אבל זמן מיון FACS תדירות עולה נביגה נמוך הנדרש.
   1. הגדרת תרבות O / N של הזן ב5 YPD מיליליטר ולגדול עם תסיסה ב30 ° C.
   2. שטוף 0.5 מיליליטר של תרבות O / N שלוש פעמים עם PBS (pH 7.4).
   3. גלולה התאים נשטפו, להסיר את supernatant, resuspend ב 2 בינוניים נביגה מיליליטר ^7.
   4. להתסיס תאים ב RT ולבדוק מדי יום להיווצרות הטטרדה באמצעות מיקרוסקופ אור לעומת שלב עם מטרת 40X.
   </ Ol>
   5. להעריך את כדאיות הנבג של הצלב על ידי נתיחה קונבנציונלית ^2,3 של מספר קטן (~ 20) של tetrads. כדאיות Spore בהכלאות בין רקע מתח שונה משתנית מאוד ובלתי צפוי. עם זאת, ניתן להשתמש בו ציפיות מראש של כדאיות נבג כדי להעריך את היעילות של ניסוי הטובים ביותר לקראת שלבי עבודה והעלות האינטנסיבית של חיסכון וgenotyping הזנים. לכן, בשלב זה מומלץ מאוד.

   2. טרנספורמציה של Diploids עם הספרייה של פלסמידים המינימרקטים

   1. הכנס את פלסמיד המינימרקטים pCL2_BC לזן דיפלואידי הטרוזיגוטיים באמצעות פרוטוקול השינוי המתואר בGietz וודס ⁸ בשינויים הבאים.
      1. לאחר תאים כבר הודגרו עם תערובת השינוי ב30 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, להוסיף DMSO ל -8% מהיקף תמהיל טרנספורמציה. תוספת של DMSO כבר נמצאה כדי לשפר את i יעילות שינויn קצת רקע מתח ^9.
      2. לאחר שלב הלם החום, גלולה התאים עם צנטריפוגה קצרה, למזוג את תערובת השינוי, ולשטוף את התאים בעדינות בYPD. ואז, resuspend התאים 1 מיליליטר YPD ולאפשר להם להתאושש על RT במשך 3 שעות ללא תסיסה.
   2. בחר transformants על ידי ציפוי על YPD + G418 (200 מיקרוגרם / מיליליטר) אגר צלחות. כדי להבטיח בריכה מורכבת של ברקודים פלסמיד, לקצור מספר רב של מושבות, למשל 5 צלחות עם ~ 2,500 מושבות בכל צלחת.
   3. פעם אחת מושבות גלויות (2-3 ימים של צמיחה ב30 מעלות צלזיוס), בריכת transformants ידי הגירוד בזהירות אותם מהצלחת לנוזל YPD + G418 (200 מיקרוגרם / מיליליטר) + גליצרול 15%. מערבולת השעיה תא זה, להעביר לבקבוקון שימור בהקפאה, ולהקפיא ב -80 ° C. הפוך המניה קפוא נפרדת לכל צלחת. מניות קפואות אלו משמשים כזנים מתחילים לשלב 3.1 ויכולות לשמש גם כדי ליצור יותר tetrads במועד מאוחר יותר, אם תרצה בכך.

      3. המתנבג הספרייה של תאים הפך להשג Tetrads המינימרקטים

      1. להחיות את התאים מהמניות הקפואות שנוצרו ב2.3 ידי צמיחת O / N ב 5 מיליליטר YPD + G418 (200 מיקרוגרם / מיליליטר) ב30 מעלות צלזיוס עם תסיסה.
      2. שוטפים את התאים מO / N תרבויות 3x ב PBS (pH 7.4) ולאחר מכן resuspend התאים בינוניים נביגה ⁷ בתוספת 200 G418 מיקרוגרם / מיליליטר.
      3. להתסיס תרבויות נביגה ב RT ולעקוב אחר התקדמות נביגה יום עד tetrads החדש הפסיק יוצרים.
      4. ברגע שהתרבות מכילה tetrads בנוי היטב ויחסית מעט צמדים, להסיר תרבויות מהתסיסה ולהשאיר על RT במשך לפחות 7 ימים. בעוד כמה צלבים עשויים להיות מקובל על מערכת העיכול צלחת ושיבוש בהקדם tetrads יצר (שהוערך כמתואר ב7.3), הדגירה נוספת (7-10 ימים בניסויים שלנו) היא חיונית לצלבים אחרים. לכן, בשלב זה מומלץ מאוד.

      4. הקמתגייטס FACS להטטרדה מיון

      Meiotically הביע היתוך SPS2-GFP על פלסמיד pCL2_BC מאפשר tetrads בתרבות נביגה כדי להתגלות ומבודד מהתרבות על ידי הקרינה. הפרוטוקול הבא פותח לFACSAria השני.

      
      איור 2. שערי FACS. סדרה של ארבעה שערים רציפים משמשת כדי לבודד tetrads. השערים שמוצגים ב( א) ו (ב) לעזור להפחית את מספר הגושים. אירועי פלורסנט נבחרים עם השער ב( C). היסטוגרמה ב( ד ') יש לו שתי פסגות. אירועים בשיא השמאל הם בעיקר tetrads (תמונת שיבוץ שמאלית), ואירועים בשיא הנכון הם בדרך כלל tetrads עם ניצן מצורף (תמונת שיבוץ מימין). שער אחרון הואלהחיל היסטוגרמה זו כדי לבחור אירועים שהם בעיקר tetrads (קווים אדומים). נתון זה שונה מLudlow, ואח' ^1.

      1. טען את תרבות sporulated על סדרן FACS ולהקים שני שערי פיזור ופיזור בצד קדימה שלא לכלול פסולת, תאים בכבדות, ותאים מרובים לכל טיפה (2A והדמויות 2B).
      2. לא צריך להיות אוכלוסייה של תאי ניאון, אשר בעת שימוש בכתב לבנות SPS2-GFP כוללים צמדים וtetrads ^10. שער ה-GFP לעומת FSC לכלול אירועי ניאון אלה (איור 2 ג).
      3. בהתאם לרקע המתח זה עשוי להיות נחוץ כדי לכלול שער נוסף כדי להסיר גושים הכוללים tetrads ותאים אחרים. אם זה הכרחי, לבדוק היסטוגרמה FSC של אירועי הניאון ולציין שער הכולל אירועים עם FSC נמוך יותר (איור 2 ד, אירועים מגודרות הם באדום).
      4. בדוק את היעילות של t הוא gating משטר ידי מיון ~ 1,500 tetrads לשקופית מיקרוסקופ וסופר את חלקם של tetrads אי tetrads באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב בהגדלה 400X. אחוזים מtetrads ניתן לאמוד באופן מדויק על ידי ספירה רק ~ 200 אירועי מיון, אבל מיון ~ 1,500 מפחית את כמות הזמן מושקעת בחיפוש אחר תאים בשקופית מיקרוסקופ. לחלופין, יחס tetrads אי tetrads ניתן להעריך בשלב 4.5.
      5. מעת לעת לבדוק כי סדרן הוא דיווח מדויק את מספר האירועים על ידי מיון 25 tetrads לשקופית מיקרוסקופ ובדיקת התאים הכלולים באגל באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב בהגדלה 400X. לא צריך להיות 25 tetrads בטיפה. חזור על פעולה 3-4x כדי להעריך את השונות של מכשיר FACS.

      5. Tetrads המיון על גבי צלחת אגר

      "Width =" p_upload/51401/51401fig3highres.jpg 500 "/>
      איור 3. מיקום של הצלחת אגר על סדרן FACS. כדי למיין tetrads לטיפה קטנה של פתרון zymolyase ממוקמת באמצע סטנדרטי צלחת (מעגלית) אגר, סטנדרטי (מלבני 100 מ"מ) צלחת 96 היטב היא ראשונה להציב על הבמה של סדרן התא והסדרן מתוכנת להפקיד tetrads לתוך באר ספציפי (במקרה זה D5). ואז, הצלחת אגר החוזר ממוקמת על גבי צלחת 96 היטב ומיושר, כך שהירידה של zymolyase מרוכזת מעל הבאר שצוינה.

      1. לחמם את המספר הרצוי של YPD + G418 (200 מיקרוגרם / מיליליטר) צלחות לפחות 1.5 שעות בחממה 37 מעלות צלזיוס ממוקמת ליד סדרן FACS.
      2. תכונה מרכזית של פרוטוקול המיון היא היכולת לכוון במדויק FACS מיון tetrads למיקום ספציפי בצלחת אגר המכילה מאגר של פתרון zymolyase. כדי לעשות זאת, הנח את "נקודת ציון" צלחת 96 היטב על tהוא אוטומטי יחידת תא בתצהיר (ACDU) של סדרן. הכן את פריסה מסוג זה יהיה למיין 25 tetrads לאחד טוב של פורמט 96 היטב. בחר גם קרוב לאמצע הצלחת, למשל גם D5. איור 3 מראה צלחת פטרי וצלחת 96 היטב הועמסה על סדרן תא. מיון 25 tetrads לכל צלחת תשואות מושבות מופרדות היטב.
      3. תביא ערימה של 10 צלחות אגר מן החממה 37 מעלות צלזיוס לסדרן.
      4. קח 25 μl אחד אגר הצלחת ופיפטה של ​​פתרון zymolyase (1 מ"ג / מיליליטר ב0.7 M סורביטול) על גבי אגר בסמוך למרכז הצלחת. לאחר מכן, הנח את הצלחת על צלחת 96 היטב הציון, יישור אגל zymolyase מעל היעד גם משלב 5.2, למשל גם D5.
      5. להתחיל למיין ולהפקיד 25 tetrads לאמצע אגל zymolyase על הצלחת אגר. לאחר מכן, להסיר ולכסות את הצלחת.
      6. חזור על שלבי 5.4 ו5.5 עד 25 tetrads כבר מסודרים לטיפי zymolyase על כל צלחת בערימה. החזר את ערימת צלחות המכיל הטטרדה ל37 מעלות צלזיוס החממה.
      7. חזור על הצעדים 5.3 דרך 5.7 עד שיש את כל הצלחות tetrads.

      6. נבגי הפרדה

      1. דגירה כל ערימה של צלחות אגר המכיל הטטרדה ב37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.
      2. הסר את הצלחות מן החממה, להוסיף 15-25 חרוזי זכוכית 3 מ"מ סטרילי לכל צלחת, ולנער את הצלחות כערימה (או כשתי ערימות של 5 צלחות) של 3-5 דקות. הפרדת הנבג הטובה ביותר מושגת על ידי הזזת הצלחות נוקשה מצד לצד או קדמי לאחורי. אל תזיזו את הצלחות כך שהחרוזים "המערבולת" מסביב לקצה החיצוני של הצלחת. השאר את חרוזים על הצלחות בסיום.
      3. הנח את ערימת צלחות עם חרוזים עם הפנים כלפי מעלה בחממה 30 מעלות צלזיוס. אחזר את צלחות המחסנית הבאות מן החממה 37 מעלות צלזיוס, וחזור על שלב 6.2.
      4. דגירה צלחות O / N ב30 ° C.

      7. קציר מושבות

      1. לאחרדגירה O / N ב 30 מעלות צלזיוס, מושבות קטנות צריכה יצרו על הצלחות. מוציא בזהירות את הצלחות מן החממה מבלי להפריע חרוזי הזכוכית.
      2. הסר את חרוזי זכוכית על ידי זהירות והיפוך במהירות את הצלחות מעל מיכל עמוק. המכל צריך להיות עמוק מספיק כדי לתפוס את חרוזים מבלי לאפשר להם להקפיץ למעלה ופגע בצלחת אגר. הקשה על תחתית הצלחת בזמן שהוא הפוך יכול לעזור לסלק חרוזים כי הם דבוקים לצלחת. ניתן לעשות שימוש חוזר חרוזים אלה על ידי שטיפה יסודית עם סבון, שטיפה היטב במי deionized וטיהור על ידי מעוקר.
      3. לספור את מספר המושבות על כל צלחת ולהשתמש במספר המושבות להעריך את היעילות של הפרדת נבג והתאוששות. לדוגמא, 25 tetrads לכל צלחת לצלב עם כדאיות 100% ליד יכול להניב כולל של כל צלחת 100 מושבות.
      4. מצלחות עם כמות מספקת של מושבות (> 65 לצלבים גבוהה כדאיות), תאי העברה מקולניו יורק לתוך באר נפרד מצלחת 96 היטב המכילה נוזל YPD + G418. כמו כן, שימו לב שהבארות מכילות מושבות מאותה הצלחת אגר; מידע זה ישמש כדי לסייע לתוכנת משימת הטטרדה.
      5. השתמש 96 גם צלחות נוזל זרע תרבויות לגנוטיפ ולהצלת זנים כמו מניות גליצרול קפוא. ניתן למצוא פרטים על רצף RAD-תג וניתוח רצף באל Ludlow et ^1.

Representative Results

BEST יכול לשפר באופן משמעותי את המהירות שבה ניתן לבודד מנבגי tetrads. כדוגמא לתפוקה בשיטה זו יכולה לספק, חוקר אחד ביצע את FACS מיון והפרדת נבג (שלבי 5.1 דרך 6.3) עם 149 צלחות אגר ב3 שעות ^1. תשואה מקבילה (כ 3,725 tetrads) תדרוש יותר מ90 שעות של נתיחה ידנית. עם זאת, כמו שיטות תפוקה גבוהה רבות, איטרציה הנוכחית של השיטה יש כמה אובדן של יעילות בהשוואה לנתיחה ידנית. הפסד זה בא לידי ביטוי במספר מופחת של מושבות התאושש בהשוואה לציפייה מחושבת על בסיס כדאיות הנבג של הצלב, שנקבעה על ידי לנתיחה במדריך (שלב 1.4). בהנחה שהסיבות לנשירות נבג (דיון) משפיעות נבגים באופן אקראי, יכולות להתבצע הערכות של כמה מושבות התאוששו יהיו חברי tetrads בי 1, 2, 3, או 4 נבגים כבר התאוששו (איור 4).

page = "תמיד">
איור 4. סימולציה של יעילות שיטה ברמת הטטרדה. אי הצלחה לשחזר נבגים (כמושבות) יכולה להיות בגלל inviability נבג, נבג הידבקות לחרוזי הזכוכית, כישלון להפריד נבגים אחד מהשני, וכו 'ההתפלגות הבינומית שימשה כדי לחשב את החלק היחסי הצפוי של tetrads (עם לפחות אחת נבג התאושש בהצלחה) לייצר 4, 3, 2 או 1 מושבות בהתאם לחלק היחסי של כל הנבגים התאוששו בהצלחה. גרף זה יכול לשמש כמדריך גס למספר הזנים שסופו של דבר מרכיבים אותם ל3 - או 4 - tetrads נבג. ככל שמספר מושבות בכל צלחת עולה, כך גם מספר tetrads המלא התאושש.

בניסוי שתואר לעיל, 25 tetrads מצלב עם קרוב כדאיות נבג 100% (כDetermined ידי נתיחה ידנית) ¹ היה מצופה על 149 צלחות אגר. בניסוי זה, את המספר המרבי של מושבות שנצפו לכל צלחת היה 80, המציין כי 20 נבגים לא הצליחו ליצור מושבות בדידות. מספר הממוצע של מושבות בכל צלחת היה 62. מושבות מהצלחות 61 מכילות 65 מושבות או יותר נקצרו ורצף. של 3,700 הזנים שעברו בקרת איכות רצף, 72% יכולים להיות מוקצים המחשוב ל3 - או 4 - tetrads נבג.

Discussion

תחומים רבים של מחקר בגנטיקה, החל מיפוי תכונה מורכב ¹¹ לחקר מנגנוני רקומבינציה DNA ^12, דורשים מספרים גדולים מאוד של צאצאים וכמויות גדולים של רצפי DNA. יש טכניקות שתינשאנה את כוחו של גישות קונבנציונליות עם הקיבולת של רצפי DNA תפוקה גבוהה הפוטנציאל לאפשר מחקרים שהיו בלתי פתירים בעבר. למרות מספר שיטות שמרי גנטיקה תפוקה גבוהה יושמו בצורה יעילה לבעיות ספציפיות, לכל אחד יש מגבלות שנופלות מתחולתה הרחבה של ניתוח הטטרדה קונבנציונלי. הכתובות הטובים ביותר עם אתגרים אלה על ידי העסקת גישת תפוקה גבוהה המשלבת נתיחת הטטרדה וgenotyping הצאצאים של שמרי צלבים. בשיתוף עם רצף RAD-תג מרובב, BEST מציע דרך זולה כדי ללקט מידע גנוטיפ עבור כל זן צאצאים תוך שמירה על יחסי הטטרדה באמצעות ברקודים הטטרדה ייחודיים.0; של שימוש בכל שיטות כיום תפוקה גבוהות, BEST משחזר באופן הדוק ביותר את המידע המסופק על ידי שמרי צלב גזור באופן ידני.

יש BEST שתי תכונות עיקריות. הראשון הוא השימוש בFACS לבודד tetrads במהירות הרחק מתאים unsporulated בתרבות (פרוטוקול שלבי 5-6). היכולת לבודד אלפי אירועי ניאון (tetrads) נותנת BEST הרווח הגדול ביותר שלה בתפוקה. אוטומציה זה מספקת יתרון גדול עוד יותר מעל לנתיחה במדריך לצלבים עם יעילות נביגה נמוכה, בשל הזמן עלה צורך לזיהוי חזותי של אירועים נדירים. תכונת המפתח השנייה היא השימוש ברקוד מורכב ביותר מולקולרי (פרוטוקול שלב 2) שמועבר לכל נבג אחותו של הטטרדה. מכיוון שניתן להשתמש בם ברקודים אלה למחשוב לשחזר את יחסי הטטרדה בין הנבגים שהופצו באופן אקראי על פני צלחת אגר, הצורך באופן ידני תאי מערך ברשת הורה הוא להקל עליו. לבסוף,כי את הברקוד המולקולרי וגן כתב ה-GFP נביגה ספציפית מקושרים פיזי (באותו פלסמיד), רק tetrads ששמר את הברקוד המולקולרי נבחרים על ידי FACS מיון.

ישנם שני שיקולים הקובעים את משך הזמן שתרבויות צריכה להיות מודגרות במדיום נביגה. ראשית, משום שהכתב נביגה הספציפי (SPS2-GFP) בא לידי הביטוי בשלב מוקדם במיוזה, GFP לבד אינו מבחין tetrads 4 נבג-שלם מהתאים שעדיין לא סיימו את המיוזה (כלומר צמדים). בעוד gating FACS נוסף עשוי להקטין את מספר tetrads ניאון, לא שלם, הדרך הקלה ביותר כדי להקטין את האירועים הללו לא רצויים היא פשוט ניטור התרבות נביגה (שלב 3.3) ושתמשיך פעם tetrads החדש הפסיק יוצרים. בניסויים שלנו, בתדירות של צמדים מסודרים היא פחות מ -1%. שנית, לכמה זמן נוסף צלבים בילה במדיום נביגה ב RT ללא תסיסה (שלב 3.4) significantly משפרת את ההפרדה tetrads ידי חרוזי הזכוכית בציפוי ((שלב פרוטוקול 6). למעשה, צעד זה הוא הכרחי לשיבוש של כמה צלבים.

כמו כל שיטות התפוקה גבוהות, הטובים ביותר הוא "רועש" מאשר הגישה הקונבנציונלית המקבילה. הירידה הקלה ביעילות הטובים ביותר בהשוואה לנתיחה הטטרדה קונבנציונלית יכולה לנבוע משילוב של מספר גורמים. גורם אחד הוא האובדן המוגבר של נבגי קיימא אחר, אשר עלול להיגרם כתוצאה מהידבקות לחרוזי הזכוכית בהפצה או מוגבר מות נבג בשל הלחצים מכאניים של התהליך. גורם שני יכול להיות אובדן פלסמיד פשוט במהלך המיוזה. גורם שלישי יכול להיות ירידה יעילה במושבות שמישה וכתוצאה ממושבות מעורבים גנוטיפים, 5% ~ משוער של מושבות בפיילוט שלנו חוצים ^1. סביר להניח כי מושבות אלה מייצגים כישלונות של הפרדה נבג אחות. בגלל פלואוריד המהירescence מיון והפרדת נבג לאפשר האוסף של מספרים עצומים של tetrads, הטובים ביותר הוא מצויד היטב כדי להתגבר על ירידה ביעילות בקנה מידה זה. בעוד חזרות עתידיות של BEST יכולים להגביר את היעילות מתקרבות לזה של נתיחה ידנית, זה אולי סביר יותר להניח כי מסלול מעריכי הנוכחי של קיבולת רצפי DNA יהיה במהירות לפצות על זה ברמה של אובדן מתח שמיש. בכל מקרה, את היכולת לבצע ניתוח הטטרדה בקנה המידה שבה ניתן ליישם BEST תאפשר מחקרים כי כרגע בלתי אפשריים בשיטות ידניות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACSAria II (Special order unit)	BD Biosciences		Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488 nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto Petri dishes
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)	BD Biosciences	643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)
Zymolyase 100T	Seikagaku Biobusiness
G418	A.G. Scientific		http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html