Summary
本协议描述为从人血清中提取的小分子RNA的方法。我们已经用这种方法来隔离患者血清小分子RNA在DNA阵列使用，也可单重定量PCR。该协议利用酚和异硫氰酸胍试剂进行了修改，以产生高质量的RNA。
Abstract
RNA和其表达的分析是在许多实验室的共同特征。意义的是小RNA像微小RNA，其被发现在哺乳动物细胞中的出现。这些小RNA是有效的调节基因控制的重要途径，如生长，发育和死亡，并极大的兴趣已经冲着他们的体液中的表达。这是由于它们在人类疾病如癌症和其潜在的应用如血清生物标志物的失调。然而，血清中的miRNA表达的分析可能会产生问题。在大多数情况下，血清的量限制和血清中含有低量的总RNA，其中小RNA只占0.4-0.5％1。因此足量的血清RNA的质量分离是当今的一大挑战研究人员。在这种技术论文，我们证明仅使用400μL人血清中获得足够的RNA是DNA阵列或定量PCR分析的方法。在一个这种方法的dvantages是它的简单性和产生高质量RNA的能力。它不需要专门的列的小RNA纯化及利用一般的试剂和硬件共同实验室发现。我们的方法是利用一个相位锁定凝胶消除苯酚污染，而在同一时间得到高质量的RNA。我们还引入一个额外的步骤在分离步骤，以进一步去除所有污染物。这个协议是非常有效的隔离血清高达100纳克/微升的总RNA的产率，但也可以适用于其他生物组织。
Introduction
近年来，出现了越来越多的推动，发现新的生物标志物的早期检测人类疾病。许多注意力都集中在利用小分子RNA，如微RNA 2（微RNA或大鹏）作为潜在的标志物。这些小RNA被发现在体液如血清和研究已经表明它们是弹性的退化，并稳定在一个范围内的不同的环境条件3。鉴于这些特点，血清或循环miRNA是理想的生物标志物4，5。目前，有用于从生物体液的小RNA分离两种主要方法。第一种方法使用了基于列的技术结合和洗脱的小RNA 6，而第二种方法使用与苯酚和异硫氰酸胍试剂7已久的协议。我们已经开发出一种简单，有效，无柱协议从人血清中分离出的小分子RNA。分离的RNA是immediately可用在下游应用，包括DNA寡核苷酸阵列和RNA测序。
这个协议被开发，因为我们使用酚为基础的方法，从血清中分离RNA时，面临着几个问题。传统Chomczynski方法被经常使用在大多数实验室用范围可从大多数商业供应商的试剂。但是考虑到它们的广泛使用，严格的标准还未发展到持续生产高品质的RNA的体液，特别是血液或血清。
从血清中分离RNA相关的常见问题包括低的RNA产率和污染的隔离，特别是苯酚过程中使用的试剂。我们的方法消除了这些酚类污染物为下游分析，如定量PCR（定量PCR）和RNA测序提供高品质的RNA。我们对miRNA的阵列进一步测试此RNA。
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Protocol
注：从健康的病人或癌症患者的人血清样品受到来自皇家阿尔弗雷德王子医院悉尼（协议号X10-0016和HREC/10/RPAH/24）和科技大学批准人的道德协议知情同意获得，悉尼。血清样品从患者在手术前，从各个悉尼医院收集和放置在存储于-80℃。
从血清1。小RNA分离
总RNA，从人血清中使用三试剂RT LS协议的修改版本来制备。
- 解冻冷冻的血清样品在冰上，再换乘400微升的刚解冻的血清成标记的离心管。
- 稀释血清100μl的无RNase H 2 O的，并在1毫克/毫升的浓度添加蛋白酶K。
- 在37°C下持续20分钟，使蛋白质的消化蛋白酶K。
- Ŧo确保完全溶解，加入1.5倍的三试剂RT LS的体积和100微升的4 - 溴苯甲醚。
- 简要反转匀浆，持续5秒执行重复移液并转移到一个标记2毫升重锁相管。
- 旋匀浆以12,000×g的20分钟，在4℃下
- 小心地倒出至少将1ml所得的水溶液中放入新的DNA低吸附管。有机和相间应该被困在锁相管的白色凝胶下方。
- 加入5.0微升糖原（5毫克/毫升）和500μl的100％异丙醇的水溶液中，通过倒置混合，并孵育O / N在-20℃下
- 下面的O / N培养，离心样品20分钟，在12000×g下在4℃离心。
- 弃去上清液，并在4℃下离心分离机进行“闪光”旋转2分钟，在16000×g下。
- 小心地取下透明溶胶ution使用移液管周围的颗粒。
- 用1毫升70％乙醇和离心机以10,000×g下洗涤沉淀10分钟。滗出洗涤液并重复洗涤步骤。
2，RNA再悬浮成解决方案
- 重悬沉淀于10μl无RNA酶的H 2 O的，确保沉淀完全溶解。以确保该RNA被完全溶解的样品可以被加热到55℃持续5分钟。在这段时间内，混合样品反复吹打。对于更高的总RNA的产量，凝聚两个RNA制剂来自同一患者。
- 定量使用紫外可见分光光度计的再悬浮的RNA，并使用2100生物分析仪评估RNA的质量。存储池的RNA样品在-80℃下，在下游应用中使用。
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Representative Results
图1表示从血清中分离的RNA的典型的UV / Vis光谱。从这个配置文件，我们注意到蛋白质污染在无论是在270 nm和230 nm的280 nm的苯酚和有机污染物，分别。残留硫氰酸胍还注意到在260 nm处。以减少污染物，一系列的优化步骤是标准的三试剂RT-LS方法制备。我们添加了糖原的5毫克/毫升，以增加两总RNA的产量和减少污染（黑线， 图1A）。
进一步，我们观察到，除去异丙醇后有大约100-300微升的周围RNA沉淀的洗涤缓冲液。一个额外的离心旋转加入到该协议，将残余物洗涤溶液小心地除去。这导致了从270纳米的配置文件转移到280纳米（红色曲线， 图1B）。我们推断，这个“闪”旋减少了苯酚污染在270 nm处，并认为280 nm的峰值最有可能代表的蛋白质污染。
为了进一步提高RNA的产量，并通过我们减少蛋白质携带增添了锁相凝胶一步。这个步骤允许用于水相的完全转移无有机污染物（ 图1B）。由于血清中含有大量丰富的蛋白质，我们评估，如果稀释原血清体积将使任何区别（ 图1C）。在500微升的总提取物量，我们混合400和250微升的血清用dH 2 O。较大体积的产量几乎翻了一番总RNA的量比较时使用250微升血清。也有在污染物减少时降低初始体积（ 注：如在此优化步骤的唯一变量是血清的体积，230纳米的峰值是直接与血清卷相关联，并从三试剂隔离不是一个工件 ） 。 这些制剂中的小RNA含量，然后使用生物分析仪与小RNA试剂盒组合进行评估。从生物分析仪跟踪，有大约20个核苷酸一个明显的峰代表了人口的microRNA（ 图2A）。使用此协议，这种小分子RNA成分所代表的总小分子RNA人口的93％。这是纯度高的水平和总RNA，现在可以用于不同的分子检测，例如阵列和qPCR反应。工作流程的概要列于图2B。
然后，我们使用两种寡核苷酸阵列或qPCR的测量microRNA表达在四个不同的生物样品。 图3A表示这4种样品的microRNA的热图。正如我们在以前的研究中，层次聚类是用来分析的基础上的microRNA表达谱8的表达谱数据和组样品。量PCR（定量PCR）也被用来评估在这些制剂中微小RNA的水平。使用相同的四个样品，进行了单重TaqMan探针定量PCR反应，检测了miR-21-5P中，miR-486-5P中，miR-15B-5P中，miR-16-5p和让 - 7A。如图所示，在放大图 （ 图3B和3C）所有的miRNA被成功地检测到。
图1。人血清分光光度法轮廓的RNA。从人血清（蓝线）中分离的RNA 答：典型的UV曲线。测试了不同的优化步骤，以减少污染物，增加总RNA的产量。B.比较使用锁相凝胶到正常隔离的两个测量值与血清的不同的起始体积。C.配置。增加卷H合并在RNA产量的广告标记的影响。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图2。A.代表性生物分析仪跟踪示于约21个核苷酸（x-轴）的单一尖峰。这个尖峰代表了miRNA的分数在小RNA人口由血清中的工作流程，从血清中分离的总RNA。B.小结。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图3：使用此方法分离出的小分子RNA被用于阵列分析和定量PCR分析。 A.三头部和颈部癌症，一个正常的血清中分离总RNA（包括微RNA），并使用8 X 60K的miRNA芯片进行阵列分析。这是重复的技术重复。原始数据的质量控制（QC）处理后，这些小分子RNA的表达采用层次聚类（HCL）进行了分析，并提出了作为热图。红色表示上调，蓝色表示下跌的microRNA的调控。B.代表定量PCR扩增曲线的miR-21中，miR-486中，miR-15中，miR-16和let-7a中的四种人血清。C.所有的检测检测5 miRNAs与原始Ct值，然后绘制的正常血清。检测这种模式是类似的另外三个样品（数据未显示）。.jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg“目标=”_blank“>请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
microRNA的人口构成中的血清中发现的总RNA约0.4-0.5％。此外还有人血清中发现了蛋白质含量高。以提高RNA和减少蛋白质和酚污染我们修改了传统的Chomczynski方法9与另外的几个步骤。
总RNA从血清使用标准的三试剂RT-LS（分子研究中心）分离但是在我们的实验室中进行时，这种方法在低量含有各种杂质，得到的RNA。
图1显示了蛋白污染的证据在280nm，苯酚污染在270nm处，并在230nm其他有机污染物的UV分光光度测定RNA谱。试剂，硫氰酸胍，也检测在260nm处。
为了解决低血清RNA产量的问题，减少污染，一系列optimizat的离子步骤被添加到标准的三试剂RT-LS程序。首先，我们发现，在5降低蛋白质污染稀释血清1。这个步骤已经被推荐的其他研究10，并已被证明可以减少蛋白污染。此外，我们用1毫克/毫升的浓度蛋白酶K的我们已经从100测试了浓度范围，500，和1000微克。因此，我们利用更高的浓度和更短的潜伏期有浓度之间没有差异。
第二个修改是引入使用2.0毫升锁相管。重锁相凝胶捕获大部分的污染物，如酚和蛋白质在有机相中的。它提供了用于将水相的最大传输未经污染的风险密度屏障。锁相凝胶作为水相/有机相的阻挡材料的应用可以减少处理时间，并进一步提高DNA RECOV红霉素高达30％，而在相同的时间消除因暴露于有害的挥发性有机物11的用户。第三变形导致RNA的质量有相当大的改善。一个“闪”离心旋转在12,000×克的引入是重要的从RNA沉淀前的乙醇洗涤去除任何残留污染。
当比较我们的方法与其他方法公布6，12，13，我们已经推出了采用锁相凝胶最大限度地从水相小非编码RNA的恢复。我们的一个协议和他人的限制是复制隔离可能需要获得足够的RNA表达分析。从我们的经验，我们更喜欢在基于列的包和众多研究的Trizol基础的方法已比较两个系统6，14-16的优点。的特别兴趣是最近的一项研究的结论是miRNA的具有低GC含量的，如的miR-141中，miR-29b中，miR-21的中，miR-106b的中，miR-15a中，和miR-34a的，有选择性的样品制备过程中，使用Trizol法丢失17。在样品的隔离这个问题已经解决了通过添加镁。
总之，我们的协议采用传统的方法从血清中分离出的小分子RNA。这些血清的miRNA可来源于微粒，外来体或死亡的细胞。该协议将隔离所有这些miRNAs产生可用于各种下游分子应用的高品质的RNA。这种提取方法是相当简单的，依赖于大多数实验室中常见的硬件，并让有兴趣的测定人血清中的miRNA表达最新手很简单。
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Disclosures
没有什么可以透露。
Acknowledgments
萨曼莎·扈利和Pamela Ajuyah由澳洲研究生奖支持。我们还要承认平移癌症研究网络，洛伊癌症研究中心，新南威尔士大学和北平移癌症研究单位对他们的额外支持萨曼莎·扈利的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
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