Summary
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til ekstraktion af små RNA'er fra humant serum. Vi har brugt denne metode til at isolere microRNA fra kræft-serum til anvendelse i DNA-arrays og også singleplex kvantitativ PCR. Protokollen anvender phenol og guanidiniumthiocyanat reagenser med modifikationer til opnåelse kvalitet RNA høj.
Abstract
Analysen af RNA og dets ekspression er et fælles træk i mange laboratorier. Af betydning er fremkomsten af små RNA som microRNA, som findes i pattedyrceller. Disse små RNA er potente gen regulatorer styrer vitale veje såsom vækst, udvikling og død og stor interesse har været rettet på deres udtryk i kropsvæsker. Dette er på grund af deres dysregulering i humane sygdomme som kræft og deres potentielle anvendelse som serum biomarkører. Analyse af miRNA ekspression i serum, kan dog være problematisk. I de fleste tilfælde mængden af serum er begrænsende og serum indeholder lave mængder af total RNA, hvoraf små RNA kun udgør 0,4-0,5% 1. Isolering af tilstrækkelige mængder af kvalitet RNA fra serum er således en stor udfordring for forskerne i dag. I denne tekniske papir, vi demonstrere en metode, som kun bruger 400 ul humant serum for at opnå tilstrækkelig RNA til enten DNA arrays eller qPCR analyse. Den advantages ved denne metode er dens enkelhed og evne til at give kvalitet RNA høj. Det kræver ingen særlige kolonner til rensning af små RNA og udnytter almindelige reagenser og hardware, der findes i almindelige laboratorier. Vores metode anvender en faselåst Gel at eliminere phenol forurening ved samtidig opnåelse af høj kvalitet RNA. Vi introducerer også en yderligere skridt til yderligere at fjerne alle forureninger under isolation trin. Denne protokol er meget effektiv til at isolere udbyttet af total RNA på op til 100 ng / ul fra serum, men kan også tilpasses til andre biologiske væv.
Introduction
I de senere år har der været en voksende indsats for at opdage nye biomarkører til tidlig påvisning af sygdomme hos mennesker. Meget opmærksomhed har været fokuseret på at bruge små RNA såsom microRNA 2 (miRNA eller Mirs) som potentielle markører. Disse små RNA'er findes i kropsvæsker, såsom serum, og undersøgelser har vist, at de er modstandsdygtige over for nedbrydning og er stabile over et område af varierende miljøforhold 3. På baggrund af disse funktioner, serum-eller cirkulerende miRNA er den ideelle biomarkør 4, 5. I øjeblikket er der to primære metoder til isolering af små RNA fra biologiske væsker. Den første fremgangsmåde bruger kolonne-baseret teknologi til at binde og elueres små RNA 6, mens den anden fremgangsmåde bruger den langvarige protokol med phenol og guanidiniumthiocyanat reagenser 7. Vi har udviklet en enkel, effektiv, kolonne-fri protokol til at isolere små RNA fra humant serum. Det isolerede RNA straksdelbart anvendelige i downstream-applikationer, herunder DNA oligonukleotid arrays og RNA sekventering.
Denne protokol blev udviklet, fordi vi blev konfronteret med flere problemer, når du bruger phenol-baserede metoder til at isolere RNA fra serum. Den traditionelle Chomczynski metode anvendes ofte i de fleste laboratorier med en række reagenser tilgængelige fra de fleste kommercielle leverandører. Dog overvejer deres udbredte anvendelse, strenge retningslinjer ikke er blevet udviklet til konsekvent at producere høj kvalitet RNA fra kropsvæsker, især blod eller serum.
Almindelige problemer forbundet med at isolere RNA fra serum omfatter lave RNA udbytter og forurening med reagenser, der anvendes i løbet af isolation, især phenol. Vores tilgang eliminerer disse phenol forureninger til at levere kvalitet RNA høj for downstream analyse som kvantitativ PCR (qPCR) og RNA sekventering. Vi har yderligere testet denne RNA på miRNA arrays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Human serum prøver fra raske patienter eller patienter med cancer blev opnået med informeret samtykke under godkendte humane etiske protokoller fra Royal Prince Alfred Hospital Sydney (Protokol nummer X10-0016 og HREC/10/RPAH/24) og University of Technology, Sydney. Serumprøver blev opsamlet fra patienter før operation fra forskellige Sydney hospitaler og placeres i opbevaring ved -80 ° C.
1. Small RNA Isolation fra serum
Totalt RNA blev fremstillet ud fra humant serum ved anvendelse af en modificeret version af Tri-Reagent RT LS protokol.
- Optø frosne serumprøve på is og derefter overføre 400 ul af frisk optøet serum i et mærket mikrocentrifugeglas.
- Fortynd serum med 100 pi RNase fri H2O og tilføj proteinase K i en koncentration på 1 mg / ml.
- Inkuberes ved 37 ° C i 20 minutter for at tillade protein fordøjelse med proteinase K.
- To sikre fuldstændig solubilisering tilsættes 1,5 gange dens volumen af Tri-Reagent RT LS og 100 pi af 4-bromanisol.
- Kortvarigt invertere homogenatet, udføre gentagne pipettering i 5 sek og overføres til et mærket 2 ml Heavy Phase Lock rør.
- Spin homogenatet ved 12.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C.
- Dekanteres forsigtigt mindst 1 ml af den resulterende vandige opløsning i en frisk DNA LoBind rør. Den organiske og interfase skal indfanges under white gel af faselåste røret.
- Tilføj 5,0 pi glycogen (5 mg / ml) og 500 pi 100% isopropanol til den vandige opløsning, bland ved inversion, og inkuber O / N ved -20 ° C.
- Efter O / N inkubation centrifugeres prøven i 20 minutter ved 12.000 x g i en 4 ° C centrifugeres.
- Kassér den klare supernatant og udføre en "flash" centrifugering i 2 minutter ved 16.000 x g i en 4 ° C centrifugeres.
- Fjern forsigtigt den klare solution omkring pelleten under anvendelse af en pipette.
- Vask pelleten med 1 ml 70% ethanol og centrifugeres ved 10.000 x g i 10 min. Dekanteres vaskeopløsningen og gentag vasketrinnet.
2.. RNA Resuspension i opløsning
- Pelleten resuspenderes i 10 pi RNase fri H2O sikre pelleten er fuldstændig opløst. For at sikre, at RNA er fuldstændigt solubiliseret prøven kan opvarmes til 55 ° C i 5 min. I løbet af denne tid, blandes prøven med gentagen pipettering. For en højere total RNA udbytte, pool to RNA præparater fra den samme patient.
- Kvantificere resuspenderet RNA ved anvendelse af et UV-Vis spektrofotometer og vurdere RNA kvalitet ved hjælp af en 2100 Bioanalyzer. Opbevar de samlede RNA-prøver ved -80 ° C til anvendelse i efterfølgende anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et typisk UV / Vis-spektret af RNA isoleret fra serum. Fra denne profil, vi bemærkede protein forurening ved 280 nm med phenol og organiske forureninger både på 270 nm og 230 nm, hhv. Rest guanidiniumthiocyanat blev også bemærket ved 260 nm. For at reducere forurenende stoffer, blev en række optimering skridt foretaget standard Tri-Reagent RT-LS procedure. Vi har tilføjet 5 mg / ml af glykogen at øge både den totale RNA udbytte og reducere forureningen (sort linje, figur 1A).
Yderligere har vi observeret, at efter fjernelse af isopropanol, der var omtrent 100-300 pi vaskebuffer omkring RNA pellet. En yderligere centrifugerotationens blev tilføjet til protokollen, og resten vaskeopløsningen blev omhyggeligt fjernet. Dette resulterede i en profil skift fra 270 nm til 280 nm (rød spor, figur 1B). Vi udledes, at denne "flash" spin-havde reduceret forureningen phenolved 270 nm, og konkluderede, at 280 nm peak sandsynligvis repræsenterede protein forurening.
For yderligere at øge RNA udbytte og reducere protein carry gennem vi tilføjet en fase Lock Gel skridt. Dette trin er tilladt for den fuldstændige overførsel af den vandige fase uden organiske forureninger (figur 1B). Som serum indeholder en stor overflod af protein, vi evalueres, hvis fortynde det oprindelige serumvolumenet ville gøre nogen forskel (figur 1C). I en samlet ekstrakt volumen på 500 ul, vi blandet 400 og 250 ul serum med dH 2 O. Den større volumen udbyttet næsten fordoblet mængden af total RNA når sammenligne til at bruge 250 pi serum. Der var også en reduktion i forureninger, når faldende volumen start (Bemærk: Som den eneste variabel i denne optimering trin var mængden af serum er 230 nm top er direkte forbundet med serum volumen og ikke et artefakt fra Tri-Reagent isolation) . Den lille RNA-indhold af disse præparater blev derefter vurderet under anvendelse af Bioanalyzer i kombination med Small RNA Kit. Fra Bioanalyzer spor, er der en tydelig top ved cirka 20 nts som repræsenterer microRNA population (figur 2A). Ved hjælp af denne protokol, denne microRNA komponent udgjorde 93% af den samlede små RNA befolkning. Dette er en høj grad af renhed og det totale RNA kan nu bruges i varierende molekylære assays, såsom arrays og qPCR reaktioner. Et sammendrag af arbejdsprocessen er præsenteret i figur 2B.
Vi derefter målt microRNA udtryk i fire forskellige biologiske prøver ved hjælp af enten et oligonukleotid matrix eller qPCR figur 3A repræsenterer en microRNA zonekort af disse fire prøver.. Som i vores tidligere undersøgelse blev hierarkisk gruppering anvendt til at analysere udtryk data og tilknyttede prøver baseret på deres microRNA ekspression profil 8. KvantitativePCR (qPCR), blev også anvendt til at vurdere microRNA niveauer i disse præparater. Brug de samme fire prøver, vi udførte singleplex TaqMan qPCR reaktioner til at opdage miR-21-5p, miR-486-5p, miR-15b-5p, miR-16-5p og lad-7a. Som vist i amplifikationsprodukterne plots (figur 3B og 3C) alle miRNA blev registreret.
Figur 1. Spektrofotometrisk profil RNA fra human serum. A. En typisk UV-profil af RNA isoleret fra humant serum (blå linje). Forskellige optimering trin blev testet for at reducere forureninger og øge den samlede RNA-udbytte. B. Sammenligner anvendelse af en faselåst Gel til en normal isolation. C. profil af to målinger med forskellige udgangspunkter volumener af serum. Øget volumen h annonce markant indflydelse på RNA-udbyttet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. A. repræsentant Bioanalyzer spor med en enkelt spids i cirka 21 nukleotider (x-akse). Denne spike repræsenterer miRNA-fraktionen i den lille RNA befolkning fra serum. B. Resumé af arbejdsgangen for at isolere total RNA fra serum. Klik her for at se en større version af dette tal.
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51443/51443fig3.jpg "/>
Fig. 3. De microRNA isoleret ved hjælp af denne metode blev anvendt til opstilling profilering og qPCR analyse. A. Tre hoved og hals kræft og en normal sera blev isoleret for total RNA (inklusive microRNA) og udsat for matrix profilering ved hjælp af 8 X 60K miRNA chip. Dette blev gentaget i de tekniske gentagelser. Efter rå data Kvalitetskontrol (QC) behandling, blev ekspression af disse microRNA analyseres ved hjælp af hierarkiske clustering (HCL) og præsenteret som en zonekort. Rød indikerer opregulering og blå indikerer nedregulering af microRNA. B. repræsentant qPCR forstærkningsmetoder kurver til påvisning af miR-21, miR-486, miR-15, miR-16 og lad-7a i fire humane sera. C. Alle fem miRNA blev opdaget og rå Ct-værdier blev derefter plottet for den normale serum. Dette mønster for afsløring var ens for de tre andre prøver (data ikke vist)..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Populationen af microRNA udgør ca 0,4-0,5% af det totale RNA fundet i serum. Endvidere er der også et højt proteinindhold findes i humant serum. For at forbedre RNA og reducere både protein og phenol forurener vi har ændret den traditionelle Chomczynski tilgang 9 med tilføjelse af flere trin.
Totalt RNA blev isoleret fra serum under anvendelse af standard Tri-Reagent RT-LS (Molecular Research Center), men når den udføres i vores laboratorium, er denne metode gav RNA i små mængder med forskellige forureninger.
Figur 1 viser et UV-spektrofotometrisk RNA profil med tegn på protein forurening ved 280 nm, phenol forureningen på 270 nm, og andre organiske forureninger ved 230 nm. Reagenset, guanidiniumthiocyanat, blev også påvist ved 260 nm.
For at løse problemerne med lavt serum RNA udbyttet og reducere forureningen, en række optimization trin sattes til standard Tri-Reagent RT-LS procedure. Først fandt vi, at fortynding af serum 1 i 5 nedsat protein forurening. Dette trin er blevet anbefalet af andre undersøgelser 10 og har vist sig at reducere protein-forurening. Desuden brugte vi 1 mg / ml koncentration af proteinase K. Vi havde testet en række koncentrationer fra 100, 500, og 1000 ug. Der var ingen forskel mellem koncentrationerne således udnyttet vi højere koncentrationer og kortere inkubationsperioder.
Den anden ændring var at indføre anvendelse af 2,0 ml faselåst rør. Den tunge fase Lock Gel fælder størstedelen af forurenende stoffer, såsom phenol og proteiner i den organiske fase. Det giver en densitet barriere for den maksimale overførsel af den vandige fase uden risiko for forurening. Anvendelsen af faselåste Gel som en vandig / organisk fase barrieremateriale kan nedsætte behandlingstiden og yderligere forbedre DNA genindery med så meget som 30%, mens den på samme tid at fjerne bruger fra udsættelse for skadelige flygtige organiske 11. Den tredje ændring resulterede i en betydelig forbedring af RNA kvalitet. Indførelsen af et "flash" centrifugering centrifugering ved 12.000 × g var vigtigt at fjerne enhver restforurening fra RNA pellet forud for ethanol vaske.
Når man sammenligner vores tilgang til andre offentliggjorte metoder 6, 12, 13, har vi indført brugen af et fase Lock Gel at maksimere genvinding af små kodende RNA fra den vandige fase. En af begrænsningerne i vores protokol, og andre er, at der kan være behov replikere isolationer for at få nok RNA til udtryk analyse. Fra vores erfaringer, vi foretrækker Trizol baserede metoder over kolonnen-baserede kits og talrige undersøgelser har sammenlignet berettigelsen af begge systemer 6, 14-16. Af særlig interessevar en nylig undersøgelse, som konkluderede, at miRNA med lavt indhold af GC, såsom miR-141, miR-29b, miR-21, miR-106b, miR-15a og miR-34a, selektivt tabt under prøveforberedelse hjælp af Trizol metoden 17.. Dette problem blev løst ved tilsætning af magnesium under prøven isolation.
Sammenfattende vores protokol anvender de traditionelle metoder til at isolere små RNA fra serum. Disse serum miRNA kan afledes fra mikro-partikler, exosomer eller døende celler. Denne protokol vil isolere alle disse miRNA til at producere kvalitet RNA høj som kan bruges til forskellige downstream molekylære applikationer. Denne ekstraktion metode er forholdsvis ligetil, afhængig af fælles hardware findes i de fleste laboratorier, og er simpelt nok for de fleste nybegyndere er interesseret i at måle miRNA udtryk i human serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Samantha Khoury og Pamela Ajuyah understøttes af den australske Postgraduate Award. Vi vil også gerne anerkende den Translationel Cancer Research Network, Lowy Cancer Research Centre, University of New South Wales og Northern Translationel Cancer Research Unit for deres ekstra støtte til Samantha Khoury.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
- Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
- Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
- Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
- Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
- Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
- Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
- Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
- Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
- Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
- McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).
