Summary
Ce protocole décrit un procédé d'extraction de petits ARN à partir de sérum humain. Nous avons utilisé cette méthode pour isoler les micro-ARN à partir de sérum de cancer destiné à être utilisé dans les puces à ADN et PCR quantitative singleplex également. Le protocole utilise le phénol et du thiocyanate de guanidinium réactifs avec des modifications pour donner l'ARN de haute qualité.
Abstract
L'analyse de l'ARN et son expression est une caractéristique commune à de nombreux laboratoires. D'importance est l'émergence de petits ARN comme les microARN, qui se trouvent dans les cellules de mammifères. Ces petits ARN sont des régulateurs de gènes puissants de contrôle des canaux vitaux tels que la croissance, le développement et la mort et beaucoup d'intérêt a été réalisé à leur expression dans les fluides corporels. Ceci est dû à leur dérégulation dans les maladies humaines telles que le cancer et leur application possible en tant que biomarqueurs sériques. Cependant, l'analyse de l'expression des miARN dans le sérum peut être problématique. Dans la plupart des cas, la quantité de sérum est de limiter et de sérum contient de faibles quantités d'ARN total, dont de petits ARN constituent seulement 0,4-0,5% 1. Ainsi l'isolement de quantités suffisantes d'ARN de qualité à partir de sérum est un défi majeur pour les chercheurs d'aujourd'hui. Dans ce document technique, nous démontrons une méthode qui utilise seulement 400 pi de sérum humain pour obtenir l'ARN est suffisante pour soit des puces à ADN ou analyse qPCR. L'unvantages de ce procédé sont sa simplicité et sa capacité à produire de l'ARN de haute qualité. Il ne nécessite pas de colonnes spécialisées pour la purification de petits ARN et utilise des réactifs généraux et du matériel trouvés dans des laboratoires communs. Notre procédé utilise un gel de verrouillage de phase pour éliminer la contamination de phénol tout en donnant en même temps l'ARN de haute qualité. Nous introduisons également une étape supplémentaire pour éliminer encore tous les contaminants lors de l'étape d'isolement. Ce protocole est très efficace pour isoler l'ARN total des rendements allant jusqu'à 100 ng / ul de sérum, mais peut également être adapté à d'autres tissus biologiques.
Introduction
Au cours des dernières années, il ya eu une poussée de plus en plus de découvrir de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce des maladies humaines. Beaucoup d'attention a été porté sur l'utilisation de petits ARN tels que les microARN 2 (miARN ou mirs) comme marqueurs potentiels. Ces petits ARN sont trouvés dans les fluides corporels tels que le sérum, et des études ont montré qu'ils sont résistants à la dégradation et sont stables dans une gamme de conditions environnementales variables 3. Compte tenu de ces caractéristiques miARN, de sérum ou de circulation sont le biomarqueur idéal 4, 5. Actuellement, il existe deux approches principales pour l'isolement de petits ARN à partir de fluides biologiques. La première approche utilise une technologie basée sur les colonnes de lier et éluer les petits ARN 6, tandis que la seconde approche utilise le protocole de longue date avec le phénol et guanidinium thiocyanate réactifs 7. Nous avons développé un protocole simple, efficace, sans colonne pour isoler de petits ARN à partir de sérum humain. L'ARN isolé est immédiatementment utilisable dans des applications en aval, y compris les tableaux ADN d'oligonucléotides et le séquençage de l'ARN.
Ce protocole a été développé parce que nous avons été confrontés à plusieurs problèmes lors de l'utilisation des méthodes à base de phénol pour isoler l'ARN à partir de sérum. L'approche traditionnelle Chomczynski est fréquemment utilisé dans la plupart des laboratoires avec une gamme de réactifs disponibles dans la plupart des fournisseurs commerciaux. Toutefois, compte tenu de leur utilisation généralisée, les lignes directrices strictes n'ont pas été développées pour produire toujours ARN de haute qualité à partir de fluides corporels, dans le sang ou le sérum particulier.
Les problèmes courants associés à l'isolement d'ARN à partir de sérum d'ARN comprennent des rendements faibles et une contamination par des réactifs utilisés au cours de l'isolement, en particulier le phénol. Notre approche élimine ces impuretés phénoliques pour fournir de l'ARN de haute qualité pour analyse en aval telles que la PCR quantitative (qPCR) et le séquençage de l'ARN. Nous avons également testé cet ARN sur les tableaux de miARN.
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Protocol
Remarque: les échantillons de sérum humain provenant de patients sains ou des patients atteints de cancer ont été obtenus avec le consentement éclairé sous protocoles éthiques humaines agréés du Royal Prince Alfred Hospital de Sydney (numéro de protocole X10-0016 et HREC/10/RPAH/24) et l'Université de Technologie, Sydney. Des échantillons de sérum ont été prélevés chez des patients avant la chirurgie de divers hôpitaux de Sydney et placés dans le stockage à -80 ° C.
1. Petite isolement d'ARN à partir de sérum
L'ARN total a été préparé à partir de sérum humain à l'aide d'une version modifiée du protocole du Tri-Reagent LS RT.
- Décongeler échantillon de sérum congelé sur de la glace, puis transférer 400 pl de sérum fraîchement décongelé dans un tube à centrifuger étiqueté.
- Diluer le sérum avec 100 ul de RNase H 2 O et ajouter la proteinase K à une concentration de 1 mg / ml.
- Incuber à 37 ° C pendant 20 min pour permettre la digestion des protéines par la protéinase K.
- To assurer la solubilisation complète, ajouter 1,5 fois son volume de Tri-Reagent RT LS et 100 pi de 4 bromoanisole.
- Inverser brièvement l'homogénat, effectuer pipetage répétitif pendant 5 secondes et transférer dans un tube de 2 ml lourd à verrouillage de phase marquée.
- Spin l'homogénat à 12 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
- Décanter avec soin au moins 1 ml de la solution aqueuse obtenue dans un nouveau tube ADN LoBind. L'interphase organique et doit être pris au piège sous le gel blanc du tube à verrouillage de phase.
- Ajouter 5,0 pl de glycogène (5 mg / ml) et 500 ul d'isopropanol à 100% à la solution aqueuse, mélanger par retournement, et incuber O / N à 20 ° C.
- Suite à O / N incubation, centrifuger l'échantillon pendant 20 min à 12 000 x g dans une centrifugeuse 4 C °.
- Jeter le surnageant clair et effectuer un "flash" rotation pendant 2 min à 16000 x g dans une centrifugeuse C 4 °.
- Retirez délicatement le sol clairution entourant la pastille à l'aide d'une pipette.
- Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 70% et centrifuger à 10 000 g pendant 10 min. Décanter la solution de lavage et répétez l'étape de lavage.
2. ARN remise en suspension dans la solution
- Reprendre le culot dans 10 ul de RNase H 2 O, en assurant le culot est complètement dissous. Afin de s'assurer que l'ARN est complètement solubilisé l'échantillon peut être chauffé à 55 ° C pendant 5 min. Pendant ce temps, mélanger l'échantillon avec pipetage répété. Pour un rendement élevé de l'ARN total, en commun deux préparations d'ARN provenant du même patient.
- Quantifier l'ARN remises en suspension à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis et évaluer la qualité de l'ARN en utilisant une Bioanalyseur 2100. Stocker les échantillons d'ARN regroupées à -80 ° C pour une utilisation dans des applications en aval.
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Representative Results
La figure 1 représente un spectre typique UV / Vis de l'ARN isolé à partir de sérum. De ce profil, nous avons constaté la contamination de la protéine à 280 nm avec du phénol et de contaminants organiques à la fois à 270 nm et 230 nm, respectivement. Résidu thiocyanate de guanidinium a également été noté à 260 nm. Afin de réduire les contaminants, une série d'étapes d'optimisation ont été apportées à la procédure de Tri-Reagent RT-LS standard. On a ajouté 5 mg / ml de glycogène à augmenter à la fois le rendement de l'ARN total et de réduire la contamination (ligne noire, figure 1A).
En outre, nous avons observé que, après le retrait de l'isopropanol, il était d'environ 100 à 300 pi de tampon de lavage entourant le culot d'ARN. Une centrifugeuse rotation supplémentaire a été ajoutée au protocole et la solution de lavage des résidus a été soigneusement retiré. Il en est résulté un déplacement du profil 270 nm à 280 nm (trace rouge, figure 1B). Nous en avons déduit que ce "flash" de spin a réduit la contamination de phénolà 270 nm et a conclu que le pic de 280 nm probablement représenté contamination par des protéines.
Pour augmenter encore le rendement de l'ARN et des protéines réduire report par nous avons ajouté une étape à verrouillage de phase de gel. Cette étape a permis le transfert complet de la phase aqueuse sans contaminants organiques (figure 1B). Que le sérum contient une grande abondance de la protéine, nous avons évalué si la dilution du volume de sérum d'origine ferait une différence (figure 1C). Dans un volume d'extrait total de 500 ul, on a mélangé 400 et 250 pi de sérum avec dH 2 O. Le rendement de plus grand volume a presque doublé la quantité d'ARN total quand comparer à l'aide de 250 pi de sérum. Il y avait aussi une réduction des contaminants lors de la diminution du volume de départ (Note: Comme la seule variable dans cette étape d'optimisation est le volume de sérum, le pic à 230 nm est directement associée à des volumes de sérum et non un artefact de l'isolement de Tri-Reagent) . La faible teneur en ARN de ces préparations a été ensuite évaluée à l'aide du bioanalyseur en combinaison avec le kit Petit ARN. De la trace Bioanalyzer, il ya un pic distinct à environ 20 nts qui représente la population de micro-ARN (figure 2A). En utilisant ce protocole, ce composant de micro-ARN a représenté 93% de la petite population totale d'ARN. Il s'agit d'un niveau élevé de pureté et de l'ARN total peut maintenant être utilisé pour faire varier les dosages moléculaires tels que les tableaux et les réactions de qPCR. Un résumé du flux de travail est présenté à la figure 2B.
Nous avons ensuite mesuré l'expression de microARN dans quatre échantillons biologiques différents en utilisant soit un réseau d'oligonucléotides ou qPCR. Figure 3A représente une carte de chaleur de microRNA de ces quatre échantillons. Comme dans notre étude précédente, la classification hiérarchique a été utilisé pour analyser les données d'expression et des échantillons de groupes en fonction de leur profil d'expression de microARN 8. QuantitatifPCR (qPCR) a également été utilisé pour évaluer les niveaux de microARN dans ces préparations. En utilisant les quatre mêmes échantillons, nous avons effectué des réactions de qPCR TaqMan singleplex pour détecter miR-21-5p, miR-486-5p, miR-15b-5p, miR-16-5p et laissez-7a. Comme le montrent les graphes d'amplification (figures 3B et 3C) tous les miARN ont été détectés avec succès.
Figure 1. Profil spectrophotométrique de l'ARN à partir de sérum humain. A. Un profil UV typique de l'ARN isolé à partir de sérum humain (ligne bleue). Différentes étapes d'optimisation ont été testés afin de réduire les contaminants et augmenter le rendement de l'ARN total. B. compare l'utilisation d'un gel de verrouillage de phase à un isolement normal. C. Profil de deux mesures avec différents volumes de départ de sérum. Augmenter le volume h annonce marqué impact sur les rendements d'ARN. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. A. Représentant Bioanalyzer trace présentant un seul pic à environ 21 nucléotides (axe des x). Cette hausse représente la fraction miARN dans la petite population d'ARN à partir de sérum. B. Résumé du flux de travail pour isoler l'ARN total à partir de sérum. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Les microARN isolés en utilisant cette méthode ont été utilisés pour tableau profilage et analyse qPCR. A. Trois cancers ORL et un sérums normaux ont été isolés pour l'ARN total (y compris les micro-ARN) et soumis à tableau profilage à l'aide de la puce 8 X 60K miARN. Cela a été répété dans les répétitions techniques. Après contrôle de la qualité pour les données brutes (QC) le traitement, l'expression de ces microARN a été analysée à l'aide Hiérarchique (HCL) et présenté comme une carte de chaleur. Le rouge indique jusqu'à la régulation et le bleu vers le bas indique la réglementation des microARN. Courbes d'amplification B. Représentant qPCR pour la détection de miR-21, miR-486, miR-15, miR-16 et laissez-7a dans quatre sérums humains. C. Tous cinq miARN ont été détectées et des valeurs brutes de Ct ont ensuite été tracées pour le sérum normal. Ce motif de détection était similaire pour les trois autres échantillons (données non présentées)..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La population de microARN représente environ 0,4-0,5% de l'ARN total dans le sérum. En outre il existe également une teneur élevée en protéine présente dans le sérum humain. Pour améliorer l'ARN et de réduire à la fois la protéine et le phénol contamine nous avons modifié l'approche traditionnelle Chomczynski 9 avec l'ajout de plusieurs étapes.
L'ARN total a été isolé à partir de sérum en utilisant la norme Tri-Reagent RT-LS (Centre de recherche moléculaire) mais lorsqu'il est effectué dans notre laboratoire, cette méthode a abouti à l'ARN en faibles quantités avec divers contaminants.
La figure 1 montre un profil d'ARN par spectrophotométrie UV avec des preuves de la contamination de la protéine à 280 nm, la contamination de phénol à 270 nm, et d'autres contaminants organiques, à 230 nm. Le réactif, le thiocyanate de guanidinium, a également été détectée à 260 nm.
Pour résoudre les problèmes de faible rendement d'ARN de sérum et de réduire la contamination, une série de optimizatétapes d'ions ont été ajoutées à la Tri-Reagent procédure RT-LS standard. Tout d'abord, nous avons trouvé que la dilution de sérum dans une 5 contamination de protéine réduite. Cette étape a été recommandé par d'autres études et 10 a été montré pour réduire la contamination de la protéine. En outre, nous avons utilisé une concentration mg / ml de protéinase K. On avait testé une gamme de concentrations de 100, 500 et 1000 pg. Il n'y avait aucune différence entre les concentrations ainsi nous avons utilisé des concentrations plus élevées et des périodes d'incubation plus courtes.
La deuxième modification a consisté à introduire l'utilisation des tubes de 2,0 ml à verrouillage de phase. Le verrouillage de phase lourde Gel emprisonne la majorité des contaminants tels que le phénol et des protéines dans la phase organique. Il fournit une barrière de densité pour le transfert maximum de la phase aqueuse, sans risque de contamination. L'application de l'écluse Gel phase comme une matière aqueuse / organique phase de barrière peut diminuer le temps de traitement et d'améliorer l'ADN RECOVery par autant que 30%, tandis que dans le même temps élimination de l'utilisateur à partir de l'exposition à des substances organiques volatiles nuisibles 11. La troisième modification a donné lieu à une amélioration considérable de la qualité de l'ARN. L'introduction d'un "flash" centrifugation tournent à 12 000 × g est important pour éliminer toute contamination résiduelle du culot d'ARN avant les lavages à l'éthanol.
Lorsque l'on compare notre approche à d'autres méthodologies publiées 6, 12, 13, nous avons introduit l'utilisation d'une serrure Gel phase pour maximiser la récupération de petits ARN non codantes de la phase aqueuse. L'une des limitations de notre protocole et autres est que les isolements répétés peuvent être nécessaires pour obtenir suffisamment d'ARN pour l'analyse d'expression. De nos expériences, nous préférons les méthodes basées sur les kits Trizol en colonnes et de nombreuses études ont comparé les mérites des deux systèmes 6, 14-16. De particulier intérêtétait une étude récente qui a conclu que les miARN à faible teneur en GC, comme miR-141, miR-29b, miR-21, miR-106b, miR-15a et miR-34a, sont sélectivement perdus lors de la préparation de l'échantillon en utilisant la méthode Trizol 17. Ce problème a été résolu par l'addition de magnésium au cours de l'isolement de l'échantillon.
En résumé, notre protocole utilise les méthodes traditionnelles d'isoler de petits ARN à partir de sérum. Ces miARN sériques peuvent être dérivées de micro-particules, les exosomes ou cellules mourantes. Ce protocole isoler tous ces miARN à produire de l'ARN de haute qualité qui peut être utilisé pour diverses applications moléculaires en aval. Cette méthode d'extraction est assez simple, repose sur un matériel commun dans la plupart des laboratoires, et est assez simple pour la plupart des novices désireux de mesurer miARN expression dans le sérum humain.
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Disclosures
Il n'y a rien à divulguer.
Acknowledgments
Samantha Khoury et Pamela Ajuyah sont pris en charge par le Postgraduate Award australien. Nous tenons également à remercier le Réseau de recherche translationnelle sur le cancer, Centre de recherche sur le cancer Lowy, l'Université de Nouvelle-Galles du Sud et l'Unité de recherche translationnelle du cancer du Nord pour leur soutien supplémentaire de Samantha Khoury.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
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