Summary
このプロトコルは、ヒト血清から低分子RNAを抽出するための方法が記載されている。私たちは、DNAアレイで使用するために、がん血清からマイクロRNAを分離してもシングルプレックス定量PCRするために、このメソッドを使用している。プロトコルは、高品質のRNAを得るために変更を加えてフェノール及びグアニジニウムチオシアネート試薬を利用する。
Abstract
RNAおよびその発現の分析は多くの研究室では一般的な機能です。重要なのは、哺乳動物細胞で発見されたマイクロRNAのような低分子RNAの登場です。これらの小さなRNAは、強力な遺伝子調節因子は、成長、開発、死などの重要な経路を制御し、大きな関心される体液中のそれらの発現に向けられてきた。これは、がんや血清バイオマーカーとしての可能性アプリケーションとしてのヒトの疾患での調節不全が原因です。しかしながら、血清中のmiRNA発現の分析は問題となり得る。ほとんどの場合、血清の量が制限され、血清は、小さなRNAが唯一の0.4から0.5パーセント1を構成する総RNAを少量含まれています。このように血清から品質のRNAの十分な量の単離は、今日の研究者にとって大きな課題となっています。この技術的な研究では、DNAアレイまたはqPCR分析のどちらかのために十分なRNAを得るために、ヒト血清のわずか400μLを使用する方法を示しています。 Aこの方法のdvantagesは、その単純さと高品質のRNAを得る能力である。それは、小さなRNAの精製のための特殊な列を必要とせず、一般的な研究室で見つかった一般的な試薬およびハードウェアを利用しています。我々の方法は、同時に、高品質のRNAを得ながら、フェノールの混入を排除するために、フェーズロックゲルを利用する。また、さらに、分離工程の間に、すべての汚染物質を除去するために追加のステップをご紹介します。このプロトコルは、血清から最大100 ngの/μlの総RNAの収量を単離するのに非常に有効であるだけでなく、他の生体組織に適合させることができる。
Introduction
近年、ヒト疾患の早期発見のための新規なバイオマーカーを発見するためのプッシュ成長があった。注目は、潜在的なマーカーのようなマイクロRNA 2（miRNAまたはのmiR）などの小さなRNAを使用して注目されている。これらの小さなRNAは、血清や研究などの体液で発見され、彼らが劣化し弾力性であり、様々な環境条件3の範囲に渡って安定しているが示されている。これらの機能は、血清中のmiRNAもしくは循環所与の理想的なバイオマーカー4,5である。現在、生物学的液体から小さなRNAの単離には主に2つのアプローチがあります。第二のアプローチは、フェノールとグアニジンチオシアネート試薬7との長年のプロトコルを使用しながら、最初のアプローチは、小さなRNA 6と結合し 、溶出するために、列ベースの技術を使用しています。我々は、ヒト血清からの低分子RNAを単離するための、シンプルで効果的な、列のないプロトコルを開発した。単離されたRNAは、直ちにですDNAオリゴヌクレオチド配列とRNAの塩基配列決定を含む下流の用途でately使用可能。
血清からRNAを単離するために、フェノールベースの方法を使用するときに我々はいくつかの問題に直面していたため、このプロトコルが開発されました。伝統をChomczynskiアプローチは頻繁にほとんどの商用ベンダーから入手可能な試薬の範囲で最も研究室で使用されています。しかしながら、それらの普及を考慮し、ストリンジェントなガイドラインは、一貫して、特定の血液または血清中に、体液からの高品質のRNAを産生するために開発されていない。
血清からRNAを単離に関連する一般的な問題は、低RNAの収量と分離、特にフェノールの際に使用する試薬の混入が含まれています。我々のアプローチは、例えば、定量的PCR（qPCR）およびRNA配列決定などの下流の分析のための高品質のRNAを提供するために、これらのフェノールの汚染物質を除去する。我々はさらに、miRNAアレイ上で、このRNAをテストしている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意：健康な患者や癌患者からのヒト血清サンプルを、ロイヤルプリンスアルフレッド病院シドニー（プロトコル番号X10-0016およびHREC/10/RPAH/24）技術大学から認可された人間の倫理的なプロトコルの下でインフォームドコンセントが得られたシドニー。血清試料は、種々のシドニーの病院から手術前に患者から採取し、-80℃で貯蔵中に入れた
血清から1。スモールRNAの単離
総RNAを、トリ-LS試薬RTプロトコルの修正版を用いてヒト血清から調製した。
- アイスで凍結した血清サンプルを解凍した後、ラベルされたマイクロ遠心チューブに新たに解凍血清400μlのを転送します。
- RNaseを含まないH 2 O100μlの血清を希釈し、1 mg / mlの濃度でプロテイナーゼKを追加します。
- プロテイナーゼKでタンパク質消化を可能にするために20分間37℃でインキュベート
- TO、完全な可溶化を確実にトライ試薬RT LSの1.5倍のボリュームを追加し、4 - ブロモアニソールを100μl。
- 簡単に説明すると、ホモジネートを反転5秒間繰り返しピペッティングを行い、ラベル2ミリリットルヘビーフェーズロックチューブに移す。
- 4℃で20分間12,000×gでホモジネートを紡ぐ
- 慎重に新鮮なDNA Lobindチューブに得られた水溶液を少なくとも1ミリリットルをデカントします。有機および間期は、フェーズロックチューブの白色ゲルの下に閉じ込められなければならない。
- 、水溶液にグリコーゲンの5.0μL（5 mg / ml）を100％イソプロパノール500μl加え転倒混和し、-20℃でO / Nインキュベート
- O / Nインキュベートした後、4℃の遠心機で12,000×gで20分間遠心分離器のサンプルを。
- 透明な上澄みを捨て、4℃の遠心機で16,000×gで2分間の「フラッシュ」スピンを行う。
- 慎重に透明なゾルを削除ピペットを用いてペレットを取り囲むution。
- 10分間、10,000×gで、70％エタノール及び遠心1mlでペレットを洗浄。洗浄溶液をデカントし、洗浄ステップを繰り返します。
溶液中に2。RNAの再懸濁
- ペレットが完全に溶解するの確保、RNaseを含まないH 2 O10μlにペレットを再懸濁します。 RNAが完全に可溶化されていることを確認するために、サンプルを5分間55℃に加熱することができる。この時間の間、繰り返してピペッティングで試料を混ぜる。高い全RNAの収量については、同一患者からの2 RNA調製プール。
- UV-可視分光光度計を用いて再懸濁RNAを定量し、2100バイオアナライザを用いてRNAの品質を評価する。ダウンストリームのアプリケーションで使用するために-80℃でプールされたRNAサンプルを格納します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図1は、血清から単離されたRNAの典型的なUV /可視スペクトルを示している。このプロファイルから、我々はそれぞれ、両方の270 nmおよび230 nmにおけるフェノール及び有機汚染物質との280 nmでタンパク質の混入を指摘した。残留グアニジンチオシアネートも260 nmで注目された。汚染物質を減らすために、最適化の一連の工程は、標準的なトライ試薬RT-LSプロシージャに作製した。我々は、総RNAの収量の両方を増加させ、汚染（黒線、 図1A）を低減するグリコーゲンの5 mg / mlのようにした。
さらに我々は、イソプロパノールを除去した後にRNAペレットを取り囲む洗浄緩衝液の約100〜300μlのがあったことを観察した。追加の遠心分離スピンをプロトコルに追加し、残渣を洗浄溶液を注意深く除去した。これは、280nm（赤線、 図1B）への270 nmのからプロファイルシフトをもたらした。我々は、この「フラッシュ」のスピンはフェノール汚染を減少させたと推定270 nmで280 nmのピークが最も可能性の高いタンパク質の混入を表すと結論付けた。
さらに、RNA収量を増加し、我々を介してタンパク質キャリーを低減するためにフェーズロックゲル工程を追加した。このステップでは、有機汚染物質（ 図1B）を使用せず、水相の完全な移動を可能にした。血清タンパク質を大量豊富に含まれているように、元の血清量を希釈することは違います（ 図1C）を作るならば、我々は評価した。 500μLの全抽出量では、我々は、DH 2 Oで血清の400と250μLを混合血清250μlのを使用して比較するとき、より大きなボリューム収量はほぼ全RNAの量を倍増した。起動ボリュームの減少、汚染物質の減少が（：この最適化ステップにおける唯一の変数は、血清の量だったので、230 nmのピークが直接血清ボリュームではなくトライ試薬の分離からの成果物に関連することに注意してください ）もありました。 これらの製剤の小RNA含量は、次いで小RNAキットと組み合わせて、バイオアナライザーを用いて評価した。バイオアナライザのトレースから、マイクロRNAの人口（ 図2A）を表し、約20 NTSの明瞭なピークが存在する。このプロトコルを使用して、このマイクロRNAコンポーネントは、全小さなRNA集団の93％を占めた。これは、高レベルの純度であり、全RNAは、現在このようなアレイ及びqPCR反応等の分子アッセイを変化させるために使用することができる。ワークフローの概要は、 図2Bに示されている。
次に、オリゴヌクレオチドアレイまたはqPCRのいずれかを使用して、4つの異なった生物学的サンプル中のマイクロRNA発現を測定した。図3Aは、これらの4つの試料のマイクロRNAヒートマップを表す。我々の以前の研究におけるように、階層的クラスタリングは、それらのマイクロRNA発現プロファイル8に基づいて、発現データおよびグループのサンプルを分析した。定量的なPCR（定量PCR）もまた、これらの調製物中のマイクロRNAレベルを評価するために使用した。同じ4サンプルを使用して、我々は、miR-21-5P、のmiR-486-5P、のmiR-15B-5P、のmiR-16-5Pおよびlet-7Aを検出するために、シングルプレックスのTaqMan qPCR反応を行った。増幅プロット（ 図3Bおよび3C）に示すように、すべてのmiRNAが正常に検出された。
図1。ヒト血清からのRNAの吸光光度プロフィール。 A.ヒト血清（青線）から単離されたRNAの典型的なUVプロファイル。様々な最適化の手順は汚染を削減し、総RNAの収量を増加するために試験した。B.、正常な単離にフェーズロックゲルの使用を比較し、血清の異なる出発体積の二つの測定のC.プロフィール 。ボリュームhを増加させる RNA収量に対する広告著しい影響を与える。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。A.代表バイオアナライザは、約21ヌクレオチド（x軸）に単一のスパイクを示すトレースします。このスパイクは、血清からの小さなRNA集団の血清から全RNAを単離するためのワークフローの。B.要約におけるmiRNA割合を表す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
hres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/51443/51443fig3.jpg "/>
図3マイクロRNAはこの方法を用いて単離し、アレイプロファイリングおよびqPCR分析に利用した。 A.三頭頸部癌および1の正常血清（マイクロRNAを含む）の全RNAのために単離され、8×60KのmiRNAチップを使用してアレイプロファイリングを行った。これは、技術的反復で繰り返した。生データ品質管理（QC）の処理の後、これらのマイクロRNAの発現は、階層的クラスタリング（HCL）を用いて分析した、ヒートマップとして提示した。赤はレギュレーションを示し、青はマイクロRNAのダウンレギュレーションを示している。は、miR-21、のmiR-486、のmiR-15、のmiR-16およびlet-7aと4人の血清中。 ですべての検出のためにB.代表定量PCR増幅曲線を5 miRNAが検出され、生のCt値は、その後、正常血清についてプロットした。この検出パターンは、他の3つのサンプル（データは示さない）についても同様であった。.jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
マイクロRNAの集団は、血清中に見出される総RNAの約0.4から0.5パーセントを構成する。さらに、ヒト血清中に見出される高タンパク質含量もある。 RNAを改善し、タンパク質とフェノールの両方を低減するために、我々はいくつかのステップを追加して、伝統的なアプローチをChomczynski 9を変更した汚染する。
全RNAを、標準的なトライ試薬RT-LS（モレキュラー·リサーチ·センター）を用いて血清から単離した我々の実験室で行われたときしかし、この方法は、様々な汚染物質の低量でのRNAが得られた。
図1は、230nmの280nmでのタンパク質の混入の証拠を有するUV分光光度RNAプロファイルを、270nmでのフェノールの汚染、および他の有機汚染物質を示している。試薬、グアニジンチオシアネートもまた、260nmで検出した。
低血清RNA収量の問題に対処し、汚染を減少させる、optimizat一連のイオン工程は、標準的なトライ試薬RT-LS手順に加えた。第一に、我々は5の血清1を希釈すると、タンパク質の混入を減少させることを見出した。このステップは、他の研究10で推奨されていると、タンパク質の混入を低減することが示されている。さらに、我々は1 mg / mLの我々は、100の濃度範囲をテストしていたプロテイナーゼKの濃度、500、1,000μgのを使用していました。我々は、より高濃度と短い潜伏期間を利用してこのような濃度との間に差はなかった。
第2の変形例2.0ミリリットルフェーズロック管の使用を導入することであった。重いフェーズロックゲルは、有機相中のフェノールやタンパク質などの汚染物質の大部分をトラップします。これは、汚染のリスクなしに、水相の最大転送の濃度バリアを提供する。水性/有機相障壁材料としてフェーズロックゲルの適用は、処理時間を短縮し、さらにDNA RECOVを向上させることができ30％程度によってERY、同時に有害な揮発性有機物11への曝露からユーザーを排除しつつ。第三の修正は、RNAの品質の大幅な改善をもたらした。 12,000×gで「フラッシュ」の遠心分離スピンの導入は、事前のエタノール洗浄にRNAペレットから残留汚染を除去するのに重要であった。
他の公開された方法論6、12、13へのアプローチを比較すると、我々は、水相からの小さな非コードRNAの回収率を最大にするフェーズロックゲルの使用を導入している。我々のプロトコルおよびその他の制限の1つは、反復単離、発現分析のための十分なRNAを得るために必要とされ得ることである。私たちの経験から、我々は、カラムベースのキットと多くの研究上のトリゾールベースの方法は、両方のシステム6、14〜16のメリットを比較した好む。特に関心のあるこのようなは、miR-141、のmiR-29B、のmiR-21、のmiR-106B、のmiR-15A、およびmiR-34Aのような低GC含量とのmiRNAは、選択的にトリゾール法を用いたサンプル調製の間に失われていると結論付けた最近の研究であった17。この問題は、サンプルの分離の際にマグネシウムを添加することによって解決した。
要約すると、我々のプロトコルは、血清から低分子RNAを単離するための従来の方法を使用しています。これらの血清中のmiRNAは、マイクロ粒子、エキソソームまたは死につつある細胞に由来することができる。このプロトコルは、様々な下流分子の用途に使用することができる高品質のRNAを生成するために、すべてのこれらのmiRNAを単離するであろう。この抽出方法は、非常に簡単です、ほとんどの研究室で見つかった共通のハードウェアに依存しており、ヒト血清中のmiRNAの発現を測定することに興味を持って、ほとんどの初心者のために十分に簡単である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
開示することは何もありません。
Acknowledgments
サマンサKhouryさんとパメラAjuyahはオーストラリアの大学院賞でサポートされています。また、サマンサKhouryさんの彼らの追加サポートのためにトランスレーショナルがん研究ネットワーク、ホリボシルトランスフェラーゼがん研究センター、ニューサウスウェールズ大学と北トランスレーショナルがん研究ユニットを認識したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
- Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
- Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
- Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
- Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
- Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
- Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
- Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
- Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
- Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
- McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).
