Summary
Detta protokoll beskriver ett förfarande för extraktion av små RNA från humant serum. Vi har använt denna metod för att isolera microRNAs från cancer serum för användning i DNA-matriser och även singleplex kvantitativ PCR. Protokollet använder fenol och guanidinium thiocyanate reagenser med ändringar ger hög kvalitet RNA.
Abstract
Analys av RNA och dess uttryck är ett gemensamt drag i många laboratorier. Av betydelse är framväxten av små RNA som mikroRNA, som finns i däggdjursceller. Dessa små RNA är potenta genregulatorer kontrollerar viktiga vägar som tillväxt, utveckling och död och mycket intresse har riktats mot deras uttryck i kroppsvätskor. Detta beror på deras dysregulation i mänskliga sjukdomar som cancer och deras potentiella användning som serumbiomarkers. Emellertid kan analysen av miRNA uttryck i serum vara problematisk. I de flesta fall den mängd serum är begränsande och serum innehåller låga mängder av total-RNA, av vilka små RNA utgör endast 0,4 till 0,5% 1. Isolering av tillräckliga mängder av kvalitet RNA från serum är alltså en stor utmaning för forskare i dag. I denna tekniska papper, visar vi en metod som använder endast 400 l av humant serum för att erhålla tillräckligt RNA för antingen DNA-arrayer eller qPCR analys. I endvantages med denna metod är dess enkelhet och förmåga att ge högkvalitativt RNA. Det kräver inga speciella kolumner för rening av små RNA och använder allmänna reagenser och hårdvara som finns i vanliga laboratorier. Vår metod använder en faslåst Gel för att eliminera kontamine fenol medan på samma gång, vilket gav hög kvalitet RNA. Vi introducerar också ett ytterligare steg för att ytterligare ta bort alla föroreningar under isoleringssteget. Detta protokoll är mycket effektiv i att isolera utbytena av total-RNA på upp till 100 ng / ul från serum, men kan också anpassas för andra biologiska vävnader.
Introduction
Under de senaste åren har det funnits ett växande tryck att upptäcka nya biomarkörer för tidig upptäckt av humana sjukdomar. Mycket uppmärksamhet har fokuserat på att använda små RNA såsom mikroRNA 2 (miRNA eller miRs) som potentiella markörer. Dessa små RNA återfinns i kroppsvätskor såsom serum och studier har visat att de är motståndskraftiga mot nedbrytning och är stabila över ett intervall av varierande miljövillkor 3. Med tanke på dessa funktioner, serum eller cirkulerande miRNA är den idealiska biomarkörer 4, 5. För närvarande finns det två huvudsakliga metoder för isolering av små RNA från biologiska vätskor. Den första metoden använder kolumnbaserad teknik för att binda och eluera små RNA 6, medan den andra metoden använder långvariga protokoll med fenol och guanidinium thiocyanate reagenser 7. Vi har utvecklat en enkel, effektiv, kolumn fritt protokoll för att isolera små RNA från humant serum. Det isolerade RNA är omedelbartbart kan användas i tillämpningar i senare led, bland annat DNA-oligonukleotid arrayer och RNA-sekvensering.
Detta protokoll har utvecklats för att vi konfronterades med flera problem vid användning av fenolbaserade metoder för att isolera RNA från serum. Den traditionella Chomczynski metod används ofta i de flesta laboratorier med en rad olika reagenser tillgängliga från de flesta kommersiella leverantörer. Men med tanke på deras omfattande användning, stränga riktlinjer har inte utvecklats för att konsekvent producera högkvalitativa RNA från kroppsvätskor, framför allt blod eller serum.
Vanliga problem i samband med att isolera RNA från serum inkluderar låga RNA avkastning och förorening med reagenser som används vid isolering, speciellt fenol. Vårt tillvägagångssätt eliminerar dessa fenolföroreningar för att ge hög kvalitet RNA för efterföljande analys såsom kvantitativ PCR (qPCR) och RNA-sekvensering. Vi har dessutom testat detta RNA på miRNA matriser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Human serumprover från friska patienter eller patienter med cancer erhölls med informerat samtycke enligt godkända humana etiska protokoll från Royal Prince Alfred Hospital Sydney (Protokoll nummer X10-0016 och HREC/10/RPAH/24) och University of Technology, Sydney. Serumprover samlades in från patienter före operation från olika Sydney sjukhus och placeras i lager vid -80 ° C.
1. Små RNA Isolering från Serum
Totalt RNA framställdes från humanserum med användning av en modifierad version av Tri-Reagent RT LS-protokollet.
- Tina frysta serumprov på is och sedan överföra 400 l av den nyligen tinat serum i ett märkt mikrocentrifugrör.
- Späd serum med 100 | il RNas-fritt H2O och lägga proteinas K vid en koncentration av 1 mg / ml.
- Inkubera vid 37 ° C under 20 min för att tillåta proteinupptaget genom proteinas K.
- To säkerställa fullständig solubilisering, lägga 1,5 gånger volymen av Tri-reagens RT LS och 100 pl 4-bromanisol.
- Kortfattat invertera homogenatet, utföra repetitiva pipettering i 5 sek och överför till en märkt 2 ml Heavy Phase Lock rör.
- Centrifugera homogenatet vid 12000 x g under 20 min vid 4 ° C.
- Dekantera försiktigt minst 1 ml av den resulterande vattenhaltiga lösningen till en färsk DNA LoBind röret. Den organiska och interfas ska infångas nedanför vit gel på den faslåsta röret.
- Lägg 5,0 | il glykogen (5 mg / ml) och 500 ul av 100% isopropanol till den vattenhaltiga lösningen, blanda genom inversion och inkubera O / N vid -20 ° C.
- Efter O / N inkubation, centrifugera provet under 20 min vid 12000 x g i en 4 ° C, centrifugera.
- Kassera den klara supernatanten och utför en "flash" spin under 2 min vid 16000 x g i en 4 ° C, centrifugera.
- Ta försiktigt bort den genomskinliga solution omger pelleten med användning av en pipett.
- Tvätta pelleten med 1 ml av 70% etanol och centrifugera vid 10.000 x g under 10 min. Häll tvättlösningen och upprepa tvättsteg.
2. RNA Resuspension i lösning
- Återsuspendera pelleten i 10 | il RNas-fritt H2O, säkerställa pelleten är helt upplöst. För att säkerställa att RNA är fullständigt solubiliseras provet kan upphettas till 55 ° C under 5 min. Under denna tid, blanda provet med upprepad pipettering. För en högre total RNA avkastning, pool två RNA-preparat från samma patient.
- Kvantifiera det omblandade RNA med hjälp av en UV-Vis spektrofotometer och bedöma RNA kvalitet med hjälp av en 2100 Bioanalyzer. Lagra de poolade RNA-prover vid -80 ° C för användning i tillämpningar i efterföljande led.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 representerar en typisk UV / Vis-spektrum för RNA isolerat från serum. Från den här profilen noterade vi kontamine protein vid 280 nm med fenol och organiska föroreningar både vid 270 nm och 230 nm, respektive. Återstod guanidiniumtiocyanat noterades också vid 260 nm. För att minska föroreningar, var en serie optimeringssteg som görs av standard Tri-reagens RT-LS förfarande. Vi lagt till 5 mg / ml glykogen för att öka både den totala RNA avkastningen och minska föroreningar (svart linje, figur 1 A).
Vidare har vi observerat att efter avlägsnande av isopropanol det fanns ungefär 100 till 300 | il av tvättbufferten närliggande RNA-pelleten. Ytterligare en centrifug spinn lades till protokollet och återstoden tvättlösningen avlägsnades försiktigt. Detta resulterade i ett profilförskjutning från 270 nm till 280 nm (rött spår, Figur 1B). Vi drog slutsatsen att denna "flash" spin hade minskat föroreningen fenolvid 270 nm och kom fram till att 280 nm toppen troligen representerade föroreningar protein.
För att ytterligare öka RNA avkastning och minska protein bär genom att vi lagt till en Phase Lock Gel steg. Detta steg möjliggjorde fullständig överföring av vattenfasen utan organiska föroreningar (figur 1b). Som serum innehåller ett stort överflöd av protein, utvärderade vi om att späda den ursprungliga serumvolymen skulle göra någon skillnad (Figur 1C). I en total extrakt volym på 500 l, blandade vi 400 och 250 l av serum med dH 2 O. Den större volymen avkastning nästan fördubblades mängden totalt RNA vid jämförelse med att använda 250 l av serum. Det fanns också en minskning av föroreningar vid minskande startvolymen (OBS: Som enda variabeln i denna optimering steg var volymen av serum är 230 nm toppen är direkt förknippade med serumvolymer och inte en artefakt från Tri-reagens isolering) . Den lilla RNA-innehållet i dessa preparat bedömdes sedan med användning av Bioanalyzer i kombination med små RNA-Kit. Från Bioanalyzer spår, finns det en distinkt topp vid cirka 20 nts, vilka representerar microRNAen populationen (Figur 2A). Med användning av detta protokoll, denna microRNAen komponent representerade 93% av den totala lilla RNA-populationen. Detta är en hög nivå av renhet och total-RNA kan nu användas för att variera molekyl analyser såsom arrayer och qPCR reaktioner. En sammanfattning av arbetsflödet visas i figur 2B.
Vi mätte sedan mikroRNA uttryck i fyra olika biologiska prover med hjälp av antingen en oligonukleotid matris eller qPCR. Figur 3A representerar en mikroRNA värme karta över dessa fyra prover. Liksom i vår tidigare studie visades hierarkisk klustring användes för att analysera expressionsdata och grupp prover baserat på deras mikro-RNA uttrycksprofilen 8. KvantitativPCR (qPCR) användes också för att bedöma mikro-RNA-nivåer i dessa beredningar. Med samma fyra prover, utförde vi singleplex TaqMan qPCR reaktioner för att upptäcka miR-21-5p, miR-486-5p, miR-15b-5p, miR-16-5p och låt-7a. Såsom visas i amplifieringsprodukterna tomter (fig. 3B och 3C) alla miRNA framgångsrikt detekterats.
Figur 1. Spektrofotometrisk Profil av RNA från humant serum. A. En typisk UV-profilen av RNA isolerat från humant serum (blå linje). Olika optimeringssteg testades för att minska föroreningarna och öka totalt RNA utbyte. B. jämför användningen av en faslåst Gel till en normal isolering. C. Profilen för två mätningar med olika utgångs volymer serum. Att öka volymen h annons markerad effekt på RNA avkastning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. A. Representativa Bioanalyzer spår som visar en enda spik vid approximativt 21 nukleotider (x-axeln). Denna spik representerar miRNA fraktionen i den lilla RNA befolkningen från serum. B. Sammanfattning av arbetsflödet för att isolera totala RNA från serum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51443/51443fig3.jpg "/>
Figur 3. De mikroRNA isolerade med denna metod användes för array profilering och qPCR analys. A. Tre huvud-halscancer och en normala sera isolerades för totalt RNA (inklusive microRNAsna) och utsattes för array profilering med hjälp av 8 X 60K miRNA chip. Detta upprepades i tekniska replikat. Efter rådata Kvalitetskontroll (QC) bearbetning, var uttryck för dessa mikroRNA analyseras med Hierarkisk klustring (HCL) och presenteras som en värmekarta. Rött indikerar uppreglering och blått indikerar nedreglering av microRNAsna. B. representanten qPCR förstärkning kurvor för påvisande av miR-21, miR-486, miR-15, miR-16 och låt-7a i fyra humansera. C. All fem miRNAs upptäcktes och rå Ct-värden sedan ritas för normalt serum. Detta mönster av upptäckt var liknande för de andra tre proven (data visas ej)..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Populationen av microRNAs utgör cirka 0,4-0,5% av den totala RNA som finns i serum. Vidare finns det också en hög proteinhalt som finns i humant serum. För att förbättra RNA och minska både protein och fenol förorenar vi har modifierat den traditionella Chomczynski tillvägagångssätt 9 med tillägg av flera steg.
Total RNA isolerades från serum med hjälp av standard Tri-reagens RT-LS (Molecular Research Centre) men när de utförs i vårt laboratorium, denna metod gav RNA i små mängder med olika föroreningar.
Figur 1 visar ett UV-spektrofotometrisk RNA profil med tecken på kontaminering protein vid 280 nm, kontamination fenol vid 270 nm, och andra organiska föroreningar på 230 nm. Reagenset, guanidintiocyanat, detekterades också vid 260 nm.
För att lösa problemen med låga RNA avkastning serum och minska föroreningar, en serie optimization steg sattes till standard Tri-Reagent RT-LS förfarandet. För det första har vi funnit att utspädning av serum 1 i 5 minskad kontaminering protein. Detta steg har rekommenderats av andra studier 10 och har visat sig minska föroreningar protein. Dessutom använde vi 1 mg / ml koncentration av proteinas K. Vi hade testat en rad olika koncentrationer från 100, 500 och 1000 mikrogram. Det fanns ingen skillnad mellan koncentrationerna vilket vi utnyttjade högre koncentrationer och kortare inkubationsperioder.
Den andra ändringen var att införa användning av 2,0 ml faslåsning rör. Den tunga Phase Lock Gel infångar de flesta föroreningar, såsom fenol och proteiner i den organiska fasen. Det ger en densitet barriär för maximal överföring av den vattenhaltiga fasen, utan risk för kontaminering. Tillämpningen av den faslåsta Gel som en vattenhaltig / organisk fas barriärmaterial kan minska bearbetningstiden och ytterligare förbättra DNA återEry med så mycket som 30%, medan samtidigt eliminerar användaren från exponering för skadliga flyktiga organiska ämnen 11. Den tredje modifieringen resulterade i en avsevärd förbättring av RNA kvalitet. Införandet av en "flash"-centrifugering centrifugering vid 12000 x g var viktigt för att avlägsna eventuell kvarvarande kontaminering från RNA-pelleten före etanoltvättar.
När man jämför vår inställning till andra publicerade metoder 6, 12, 13, har vi infört användning av en Phase Lock Gel för att maximera återvinningen av små icke-kodande RNA från vattenfasen. En av begränsningarna i våra protokoll och andra är att upprepade isoleringar kan behövas för att få tillräckligt med RNA för expressionsanalys. Från våra erfarenheter, vi föredrar Trizol baserade metoder över kolumnbaserade byggsatser och många studier har jämfört fördelarna med båda systemen 6, 14-16. Av särskilt intressevar en färsk undersökning som kom fram till att miRNA med låg GC innehåll som miR-141, miR-29b, miR-21, miR-106b, miR-15a och miR-34a, selektivt går förlorade under beredningen av proverna med hjälp av Trizol metoden 17. Detta problem löstes genom tillsats av magnesium under prov isolering.
Sammanfattningsvis använder våra protokoll de traditionella metoderna för att isolera små RNA från serum. Dessa serum miRNA kan härledas från mikropartiklar, exosomer eller döende celler. Detta protokoll skulle isolera alla dessa miRNA för att producera hög kvalitet RNA som kan användas för olika nedströms molekylära applikationer. Denna utvinningsmetod är ganska enkelt, bygger på gemensam hårdvara som finns i de flesta laboratorier, och är enkel nog för de flesta nybörjare som är intresserade av att mäta miRNA uttryck i humanserum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inget att lämna ut.
Acknowledgments
Samantha Khoury och Pamela Ajuyah stöds av den australiska Graduate Award. Vi vill också tacka för det Translational Cancer Research Network, Lowy Cancer Research Centre, University of New South Wales och norra Translational Cancer Research Unit för deras ytterligare stöd av Samantha Khoury.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
- Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
- Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
- Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
- Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
- Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
- Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
- Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
- Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
- Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
- McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).
