Summary
Drosophila melanogaster er nyttige i å studere genetiske eller miljømessige manipulasjoner som påvirker atferd som for eksempel spontan bevegelsesaktivitet. Her beskriver vi en protokoll som benytter skjermer med infrarøde stråler og dataanalyse programvare for å kvantifisere spontan bevegelsesaktivitet.
Abstract
Drosophila melanogaster har blitt brukt som et utmerket modellorganisme for å studere miljømessige og genetiske manipulasjoner som påvirker virkemåten. En slik oppførsel er spontan bevegelsesaktivitet. Her beskriver vi vår protokoll som benytter Drosophila befolknings skjermer og et sporingssystem som tillater kontinuerlig overvåking av den spontane bevegelsesaktiviteten av fluer i flere dager om gangen. Denne metoden er enkel, pålitelig og objektiv og kan brukes til å undersøke effektene av aldring, kjønn, endringer i kaloriinnholdet i maten, tilsetning av medikamenter, eller genetiske manipulasjoner som etterligner menneskelige sykdommer.
Introduction
Fruktfluer, Drosophila melanogaster, har blitt brukt som en verdifull modellorganisme for å studere mekanismene bak komplekse atferd, for eksempel læring og hukommelse, sosial interaksjon, aggresjon, rusmisbruk, søvn, sensorisk funksjon, frieri, og parring 1,2. En atferd som er blitt studert gjennom flere protokoller er spontan bevegelsesaktivitet. Negativ geotaxis var en av de første metodene som er utviklet for å måle Drosophila-aktivitet, og denne protokoll innebærer måling av prosentandelen av fluer som når en viss høyde av ampullen etter at fluene ble rystet til bunnen av beholderen 1,3. Denne metode har fordelen av å være enkel, billig, og da den ikke krever noe spesielt utstyr den kan utføres i ethvert laboratorium. Det har vært brukt som et verdifullt verktøy for screening for å studere effekten av forskjellige genetiske manipulasjoner på fly mobilitet 3. Det er imidlertid tids-og arbeidskrevende etnd har mulighet for systematiske feil som følge av variabel risting av ampullene og humane opptak.
Den negative geotaxis Metoden ble forbedres ved utvikling av Rapid Iterativ Negative Geotaxis (RING) metoden 4,5, som tar bilder av flue ampuller følgende risting av fluene til bunns. Fordelen med denne protokollen er dens følsomhet og muligheten for å teste et stort antall fly-ampuller på samme tid. Imidlertid har denne protokollen fortsatt potensialet for menneskelig feil, og bare måler negative geotaxis. Andre laboratorier har brukt enkel observasjon i kultur ampuller å bestemme bevegelsesaktiviteten seks.
Nylig flere videoopptak systemer for måling fly bevegelsesaktiviteten har blitt utviklet. En video overvåking protokollen gir tid for justering før opptaket 7. Fremgangsmåten beskrevet av Slawson et al. Bruker også en luftpuls til å stoppe movement før opptaksstart, noe som potensielt kan være en stressfaktor for dyrene 7. Denne metoden gir informasjon om gjennomsnittshastighet, maksimal hastighet, tid tilbringer i bevegelse, etc. En annen tre-dimensjonal sporing system måler den maksimale hastigheten i de enkelte fluene i løpet av ~ 0,2 sekunders fri flukt letting 8.. En tredimensjonal videoovervåkning protokollen bruker fluer som uttrykker GFP og flere kameraer som er utstyrt med filtre som muliggjør påvisning av fluorescens for å bestemme fly mobilitet 9.. Fluer i denne protokollen har en tendens til å stille ut sylindriske flytur mønstre, som er potensielt grunn av formen på Drosophila kultur hetteglass 10. Denne metoden ble forbedret ved bruk av en kuppel som tillater måling av spontan bevegelse av to fluer 11. En high-throughput metode som bruker et kamera for å automatisk overvåke og kvantifisere den enkelte og sosiale atferden til Drosophila har vært også beskrevet 12. Zou etal. utviklet et atferds monitor system (BMS) som bruker to IT-baserte kameraer for å registrere levetid atferd og bevegelser som hvile, flytting, flyr, spise, drikke, eller dødsfall av enkelte tephritid fruktfluer 13. Flere andre videosystemer er utviklet for å overvåke fly atferds aktivitet 14,15.
Her beskriver vi en metode for å kvantifisere Drosophila aktivitet som benytter skjermer befolknings. Disse skjermene er plassert i temperatur-og fuktighetskontrollerte inkubatorer ved 25 ° C på en 12 timers dag-natt lys syklus. Hver befolkningen skjermen har infrarøde stråler plassert i ringer plassert på tre forskjellige høyder. Hver gang et fly beveger seg på tvers av ringene den avbryter den infrarøde strålen, som er registrert av en mikroprosessor som uavhengig registrerer og teller aktiviteten av fluene i løpet av ampullen. En mikroprosessor laster opp den totale aktiviteten innenfor hetteglasset til datamaskinen ved brukerdefinert intervaEr det kunne variere fra 1 sekund til 60 minutter. Metoden er beskrevet her gir rikelig tid for fluer å tilpasse seg det nye miljøet, og gir mulighet for samtidig måling av den spontane bevegelsesaktiviteten av så mange som 120 bestander av fluer. I tillegg beskriver vi tilberedning av maten, fly vedlikehold, sette opp mobilitet befolknings skjermer i temperaturkontrollerte inkubatorer og potensielle faktorer som kan påvirke resultatene. Denne metoden kan brukes til å studere hvordan forskjellige miljømessige eller genetiske modifikasjoner påvirker spontan lokomotorisk aktivitet av fluene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Canton-S belastningen er standard villtype bakgrunn linjen hentet fra Bloomington Stock Center.
En. Matlaging og Oppskrift på 1000 ml av Mat
Merk: Denne delen beskriver protokollen for matlaging. Store metall potter er benyttet til å forberede omtrent 18 L av mat på en gang. Protokollen er beskrevet her er forminsket og bruker 1000 ml H 2 O. Mat autoklaveres to ganger.
- Bland 113 g sukrose og 28 g bryggere gjær i 643 ml vann. La ingredienser på en varm plate innstilt på 25 ° C med en rørestav for å blande hele i 15 minutter.
- Autoklav mat-løsning i 20 min.
- Bland 49 g maismel og 8,1 g agar i 268 ml vann og tilsett til autoklavert mat blandingen beskrevet i trinn 1.2. Bland godt med en stor skje eller en visp.
- Autoklav mat blandingen for en annen 20 min.
- Plasser maten på en tallerken og la kjøle ned med konstant blanding med en rørepinne. Jegf flere løsninger bør legges til mat, for eksempel mifepriston (RU486), holde maten på en varm plate satt opp ved 60 ° C og legg løsning når maten når ønsket temperatur.
- Oppløs 2,4 g tegosept i 10,7 ml 100% EtOH og holde på en kald plate med en rører for å løse opp og blande seg i omtrent 15 min.
- Legg tegosept løsning mat når temperaturen av mat er 60 ° C og bland godt.
- Bruke en pumpe eller en mat-dispenser for å helle omtrent 10 ml av mat i en lang ampulle. Ved hjelp av en mat-dispenser kan man helle mat samtidig til 100 brede plast-ampuller (1) skuff om gangen.
- Dekk ampuller med Kimwipes og ost klut og la mat i romtemperatur i 12-24 timer for å kjøle seg ned. Hold maten ved 4 ° C og bruk innen 3-4 uker. Varm opp maten til romtemperatur før bruk for flue arbeid.
2. Utarbeidelse av glassflasker
- Forbered mat i henhold til protokollen er oppført i trinn en. Delmengde 5 ml av mat til hvert smal, hetteglass, som er den riktige størrelsen for skjermene befolkningen. Denne mengde mat bør være lav nok til å være under det laveste ring av befolkningen monitor.
- Etter maten kjøles ned til romtemperatur dekke hetteglassene med svamp plugger og holde dem ved 4 ° C i opptil to uker. Fordi mengden av mat i en ampulle som er heller lav, er det best å bruke mat i løpet av en uke eller to, for å hindre tørking.
- Varm opp ampullene til romtemperatur før bruk.
Tre. Vedlikehold av Foreldre Flies
- Grow fluene i store plasthetteglass med standard laboratorie mat og holde hetteglassene i en fuktet, temperatur-kontrollert miljø kammer ved 25 ° C på en 12 timers lys / mørke-syklusen. Dagslys periode starter kl 06:00 i dette laboratoriet.
- I morgen klart voksen flyr fra hetteglassene som foreldre fluer vil bli samlet inn.
- Samle nylig eclosed flues og skille dem etter kjønn på en CO 2 pad innen åtte timer etter eklosjonshormon å sørge for at de kvinnelige fluer er jomfruer. Fluer begynner å parre åtte timer etter eklosjonshormon.
- Når de jomfruelige mannlige og kvinnelige fluer er mellom 5 og 10 dager gammel, satt 10 menn og 10 kvinner fluer i en ampulle med standard mat og flere korn av aktiv gjær på toppen.
Merk: kontrollere tettheten av larvene ved hjelp av det samme antall fluer og holde dem i et hetteglass i to dager. Tilsetting av aktiv gjær fremmer eggproduksjon. - Holde fluene til å parre seg og legge egg i et temperaturkontrollert miljø kammer ved 25 ° C med en 12 timers lys / mørke-syklusen for to dager. Sett opp 5-10 ampuller med foreldre fluer.
- Pass fluene til en ny plasthetteglass annenhver dag og holde hetteglassene med eggene i en inkubator ved 25 ° C.
4. Innsamling av Eksperimentelle Flies
- Etter ni dager fluer vil begynne å ELukk fra hetteglassene der parental fluer lagt egg (som er beskrevet i trinn 3.6.). Klar og forkaste de fluene som eclosed under den første dagen og returnere ampullene til inkubatoren. Mesteparten av fluene eclosed på dag 1 er kvinner. En mer synkronisert populasjon av fluer vil ELukk på dag to.
- Innen 24 timers sted nylig eclosed fluer på CO 2 pads og samle 25 mannlige og 25 kvinnelige fluer per hetteglass med en pensel eller metall skje. Hold fluer på CO 2 pads for en kort periode for å minimere eventuelle effekter av CO 2. Skriv ned den dagen eklosjonshormon på hetteglasset. Sett sammen minst 5 replikat ampuller for eksperimentell og for kontrollgruppene.
- Oppbevar hetteglassene i temperaturkontrollerte miljøkamre ved 25 ° C med en 12 timers lys / mørke-syklusen.
- Pass fluene til en ny plasthetteglass annenhver dag ved hjelp av en trakt.
- Alder fluene til ønsket alder for eksperimentering er nådd.
5. Sette opp Mobility skjermer
- Plasserbefolkningen overvåker i et temperaturkontrollert kuvøse.
- Koble hver skjerm med en 4-ledning telefonledningen til strømforsyningen Interface Unit (PSIU) via 5-veis splittere (flere linjer), som kan koble opp til fem individuelle skjermer til en åpning i PSIU. Se figur 1A og 2B.
- Koble PSIU til en linje strømuttak (100-240 V). Plugg strømforsyningen utgangskontakten til en av de to parring PSIU knekt. Den tilstøtende grønne lyset lyser grønt når den er koblet riktig.
- Koble PSIU til (USB) hardware Universal Serial Bus. Koble USB-kabelen mellom USB-maskinvare med en Macintosh eller en Windows-PC for dataregistrering. Det ville være best å ha en datamaskin dedikert kun for datainnsamling siden samlingen går i flere dager om gangen.
- Last ned USB-programvaren (PSIUdrivers.zip). USB driverprogramvare brukes av strømforsyning grensesnitt og må lastes ned bare en gang. Det syntetiserer endatalink mellom dataprogram og PSIU / aktivitets skjermer. For en PC-bruk en COM-port og for en Macintosh bruke en enkel seriell port.
- Last ned dataprogram for Macintosh OSX (Intel) eller for Windows PC (XP/Vista/7) programmer ved å følge instruksjonene fra produsenten Merknader 308.pdf.
- Start dataprogram og sette opp programmet ved å klikke på Innstillinger, Lights eller skjermer. Programmet vil løpe inntil brukeren velger "slutte" å stoppe programmet. Hvis dataprogrammet eller datamaskinen er slått av skjermene vil fortsette å telle bjelkebrudd, men de teller ikke vil bli tatt opp til programmet blir relansert. I så fall den første lesning vil omfatte alle de teller siden forrige gang PSIU sendte dataene til datamaskinen.
- Velg kategorien Innstillinger og velger Serial Port, PSIU for Macintosh og COM for PC.
- Velg den lese intervallet som strekker seg fra sekunder, minutter eller en time. <li> Velg monitorene: Hver skjerm har sitt unike nummer som er gitt av produsenten. Velg Monitor Range som tilsvarer sifrene til skjermer av produsenten.
- The Lights boksen: Kontroller at alle skjermer er riktig tilkoblet, som er merket med et grønt lys ved siden av skjermnummeret på programvaren. Et rødt lys indikerer at forbindelsen blir brutt, og en svart boks indikerer at systemet er av eller feil satt opp.
6. Sette opp Experiment
- Fjern hetteglass inneholdende mat fra 4 ° C, og la dem varme til romtemperatur.
- Separate mannlige og kvinnelige fluer på samme alder på CO 2 pad. For aldring studier er det mulig å starte mobilitets studier så tidlig som 3 dager gamle.
- Sett 10 mann eller 10 kvinnelige fluer i hvert hetteglass som inneholder mat. Bruk minst tre ampuller for hver forsøks-og kontroll-ledningen av fluer og for hvert kjønn.
- Hold VIals på sin side til fluene gjenopprette fra CO 2 for å sikre fluene ikke blir sittende fast i maten. Separate flyr på ca 8:00 og la dem i ca 2 timer ved romtemperatur for å gjenopprette fra CO 2.
- Plasser hetteglassene på innsiden befolkningen skjermer plassert i kuvøser.
- Kast de innsamlede dataene i løpet av de første 24 timer etter fluene blir lagt i kuvøse for å la dem å tilpasse seg den nye miljø.
- Pass fluene etter tre eller fire dager til nye pakningene for å unngå uttørking av maten. Hvis fluene er utsatt for død eller er alder 40 dager eller eldre, passere fluene etter to dager og bruke data som er samlet for dag to. Også bruke mer enn tre ampuller per gruppe for å sikre tilstrekkelig replikater. Data fra hetteglass med døde fluer bør strykes og ikke inkludert i analysen.
7. Kjører aktivitet skjermer og beregning av total Spontan aktivitet
- Velg innstillinger - intervallet for datainnsamling <.br /> Merk: Datamaskinen Programmet tillater innsamling av data i intervaller fra 1 sekund til 60 minutter. 10 og 30 minutters perioder er blitt funnet å gi tilstrekkelig informasjon om bevegelighet uten å ha et overveldende antall av tidspunkter. På den valgte tidsperioden, vil programmet sende den aktuelle totalantall for hver monitor til datamaskinen og begynner å telle fra null igjen. Dataprogrammet lagrer dataene i en ny mappe er opprettet av datamaskinen data systemet. Dataene som samles inn i hver skjerm lagres separat, og individuelle tekstdokumenter er opprettet for hvert hetteglass. Dataene blir kontinuerlig oppsamlet så lenge programmet opererer.
- På slutten av forsøket, skanne data ved hjelp av FileScan110X for Macintosh OSX (Intel) eller SystemMB108 for Windows PC (XP/Vista/7) program.
Merk: Scan-programmet eliminerer duplikate målinger og sørger for at opptakene er ferdig. - Lagre dataene som samles inn i løpet av en bestemt tid og period dager. Velg en eksperimentell navn og kopiere filer fra datamaskinen data-mappen for analyse.
Merk: På dette tidspunktet, kan aktivitets intervaller endres og omdannes til forskjellige dem. De opprinnelige dataene vil bo som er lagret i datamaskinen data-mappen og kan hentes så lenge de ikke blir slettet.
8. Data Analysis
- Kopier de innsamlede dataene i tekstfiler inn i kolonner i Excel regneark for dataanalyse. Data som samles inn av denne programvare er i kolonner, som inneholder tall som representerer totalaktivitet i en enkelt skjerm over en periode valgt av undersøkeren.
Merk: Data som samles inn for hver skjerm er i separate tekstfiler. Det er 32 kolonner for hver skjerm. De første seks kolonnene er tom og inneholder kun 0; neste tre inneholder dataene som samles i bunnen ringen, i midten, og på den øverste ringen. Resten av kanalene kan slettes, siden de ikke inneholder noen data. Hver ring utganger enenkelt verdi per gang. Se skjermbilde av rådata i Figur 2. - Beregn den totale aktivitet i en ønsket tidsperiode for hvert skjerm som representerer summen av aktiviteten samles på tre forskjellige høyder av infrarøde stråler.
Merk: Tidsperioden kan variere fra flere timer, 24 timer eller flere dager. - Bestem den gjennomsnittlige bevegelsesaktiviteten og standardavviket mellom de tre skjermer som representerer tre biologiske replikater.
Merk: De data kan bli analysert for statistisk signifikans ved hjelp av en rekke tester. En tosidig studentens t-test, en en-veis analyse av varians (ANOVA) og en Tukey HSD post-hoc-test kan anvendes for å bestemme virkningene av en rekke miljø-eller genetiske manipulasjoner på 24 timer med spontan lokomotorisk aktivitet 16. Det finnes en rekke andre programmer som kan brukes, og har tidligere blitt publisert 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den spontan lokomotorisk aktivitet i Drosophila, avhenger av fly kjønn (figur 3A), kaloriinnholdet i maten (figur 3B), og den lys / mørke syklus. Når lyset er slått av fly aktiviteten avtar dramatisk. Figur 3A viser 24 timer med bevegelsesaktiviteten opptak av mannlige og kvinnelige fluer. En stjerne på x-aksen angir tid når lyset ble slått av, og overgangen til mørk syklus. Figur 3B illustrerer standardavviket mellom den gjennomsnittlige spontan lokomotorisk aktivitet samles opp i tre populasjons skjermer for menn fluer alder 3 dager på mais mat. Dataene som samles inn for den spontane fysisk aktivitet i løpet av 24 timer kan også uttrykkes som den totale aktiviteten per fly i løpet av en 24 timers periode, Figur 3C.
_upload/51449/51449fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51449/51449fig1.jpg "/>
Figur 1:.. Befolknings monitor oppsett for overvåking av spontan bevegelsesaktiviteten av fluer A) Flere befolknings skjermer er koblet med en 4-leder telefonkabel til 5-veis splittere og plassert i et temperaturkontrollert kuvøse B) Høyere forstørrelse av to befolkningen skjermer, som viser plassering av hetteglassene i befolkningen skjermer og tre ringer med infrarøde stråler plassert på tre forskjellige høyder. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2: Skjermbilde av rådata generert av såftware viser dato, klokkeslett og data innsamlet i Rings 1, 2, og 3. R står for Ring. Klikk her for å se større bilde.
Figur 3: A) Gjennomsnittlig spontan bevegelsesaktiviteten for menn (svart) og kvinnelige (Magenta) flyr i løpet av 24 timer på standard laboratorie diett. Dataene er samlet inn i 10 minutt binger og representerer gjennomsnittlig aktivitet per fly beregnet som gjennomsnittet aktivitet mellom tre ampuller som hver inneholder 10 fluer. B) Gjennomsnittlig spontan bevegelsesaktiviteten av mannlige flyr under 24 timer på standard laboratorie diett. Dataene er samlet inn i 10 minutt binger og representerer gjennomsnittlig aktivitet per fly beregnet som gjennomsnittet aktivitet mellom thRee hetteglass. Standardavvik er markert med grønt. C) Total aktivitet av 20 dager gammel mann flyr på lav-kalori (0.5x) (grønn) og høy-kalori (1,5 X) (Brown) mat over 24 timer. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spontan bevegelsesaktiviteten av fluer er påvirket av mange faktorer som for eksempel alder, genetisk bakgrunn og kjønn 2,13,18,19. I tillegg kan miljømessige faktorer slik som kaloriinnholdet i maten, temperaturen i omgivelsene, tilsetning av forskjellige stoffer, og dag / natt-lys syklus påvirke fly-aktivitet. For eksempel hannfluer av samme alder har en høyere spontan fysisk aktivitet sammenlignet med kvinner (figur 1). Derfor bør fluer av samme alder og kjønn bli sammenlignet med hverandre. Ved undersøkelse av virkningen av genetiske manipulasjoner på fly-aktivitet, for eksempel overekspresjon eller tap av funksjon av et bestemt gen, må de eksperimentelle og kontroll fluene være i samme genetiske bakgrunnen for å fjerne eventuelle virkninger av forskjellig genetisk bakgrunn, eller andre modifiseringsmidler reiser. Dette kan oppnås ved tilbakekryssing eksperimentelle kvinnelige fluer til w 1118 eller YW menn i 10 generasjoner. Etter 10generasjoner av tilbakekryssing, w 1118 eller YW fluer kan brukes som en genetisk kontroll. En annen måte å kontrollere for den genetiske bakgrunnen er å bruke induserbar Gal4 GeneSwitch (Gal4-GS)-UAS binært system, som gjør at overuttrykk eller nedregulering (RNAi) av genet av interesse i en tid og vev-spesifikk måte i fluer matet mat med tillegg av mifepriston (RU486) 20,21. RU486 er nødvendig for Gal4 å dimerize og binde til UAS-sekvensen. Genetiske kontroller er søsken fluer holdt på mat med tillegg av EtOH (RU486 fortynningsmiddel).
Ulike metoder har blitt brukt til å spille inn Drosophila mobilitet. Metoden som beskrives her er enkel, pålitelig og mer informative, og har mindre potensial for skjevhet i forhold til andre metoder som brukes for å bestemme Drosophila mobilitet, slik som negative geotaxis. Den har fordelen av objektiv samtidig opptak av flere populasjoner av fluer i en lang tidsperiode istandard kultur forhold. Måling bevegelsesaktiviteten ved hjelp av skjermer befolknings kan være nyttig for å studere hvordan ulike kalori innholdet i maten påvirker fly aktivitet eller å studere genetiske mekanismene bak økt aktivitet av fluer på CR 16. Tilsvarende, har dette systemet er benyttet for å studere effekten av forskjellige genetiske mutasjoner, aldring, eller tilsetningen av forskjellige legemidler på fly spontan fysisk aktivitet. Bruk av enkelte rør i stedet for skjermer befolknings tillater måling av H 2 O 2 motstand i ulike genotyper av fluer, studere døgnrytme in vivo, analysere søvnatferd, og andre 17,22-24.
Som enhver metode, er det begrensninger i dette overvåkingssystemet. Ved overvåking av fluer i en lang tidsperiode, er det et potensial for flue død, spesielt ved bruk av alderen fluer. Bruke bare friske fluer vil bidra til å forhindre dette. Vi prøver også å bruke mer enn tre biologiske gjentak pergruppe hvis fluene er gamle eller utsatt for å dø. En løsning er å holde fluer bare for to dager i mobilitet skjermer og bruke data som samles inn i løpet av dagen to, etter at fluene har tilpasset seg miljøet. Hvis døden inntreffer vi ikke bruke de innsamlede dataene for hetteglasset i beregningene. Selv om vi har brukt ampuller plassert bare vertikalt i aktivitets skjermer Trikinetics, er det en mulighet for å plassere ampullene horisontalt. Vi velger å plassere ampullene vertikalt fordi maten er i bunnen av beholderen, som er lik standard inkubator dyrkningsbetingelser. Dette gjør fluene til å ha mer plass til å gå opp og ned i hetteglassene, og det er mer lik negative geotaxis eksperimenter. Fuktigheten i inkubatoren bør også monitoreres hvis mat uttørking blir et problem 24. Dette systemet gir data i form av gjennomsnittlig aktivitet, og gir ikke spesifikke detaljer om hva slags aktivitet. I tillegg, hvis to fluer krysser strålen på samme tid, det will bare bli registrert som ett avbrudd. Protokollen er beskrevet her er nyttig for kvantifisering av total aktivitet, men andre protokoller kunne gi nyttige data om mer presis informasjon for eksempel fly bane eller hastighet er ønsket 12,14,25.
Etter dette eksperimentet, vil forskjeller i spontan bevegelsesaktiviteten skyldes genetiske eller miljømessige manipulasjoner bli kjent. En fremtidig endring av denne protokollen kan være å analysere de ulike aktivitetsnivåer av fluer på toppen, midten, og nederste ringene av skjermene befolknings. Dette vil bestemme om flue populasjoner bruke mesteparten av sin tid på bunnen av ampullen i nærheten av mat eller på toppen. Protokollen i sin nåværende form åpner for nøyaktig, samtidig kvantifisering av spontan bevegelsesaktiviteten av Drosophila eksperimentelle og kontroll populasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health (AG023088 til BR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose FCC Food Grade 100 LB, | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90471380 | |
| Brewer’s Yeast | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90331280 | |
| Drosophila Agar Fine | SciMart | DR-820-25F | |
| Cornmeal | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90141125 | |
| Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept | Sigma | H5501-5KG | |
| EtOH | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Active Dry Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Fly CO2 pad | LabScientific | BGSU-7 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | |
| Drosophila carbon dioxide (CO2) tank | Airgas | UN1013 | |
| Small paint brush for pushing the flies | |||
| Shell vial wide | Fischer Scientific | AS519 | |
| Buzzplugs for wide plastic vials | Fischer Scientific | AS275 | |
| Glass vials (25 x 95 mm) | Fischer Scientific Kimble 60931-8 | AS-574 | |
| Sponge plugs for glass vials | SciMart | DR-750 | |
| Drosophila Food Dispenser | Applied Scientific (Fischer Scientific) | AS780Q | |
| DPM Drosophila Population Monitor | Trikinetics Inc. | ||
| DC Power Supply with line cord | Trikinetics Inc. | ||
| PSIU9 The Power Supply Interface Unit | Trikinetics Inc. | ||
| Telephone cables and 5 way splitters | Trikinetics Inc. | ||
| Universal Serial Bus (USB) hardware | Trikinetics Inc. | ||
| Macintosh or Windows PC with UCB port | |||
| DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAMFileScan108X software for Macintosh | www.trikinetics.com | ||
| DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com | ||
| USB software (PSIUdrivers.zip) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem Notes 308 | (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf |
References
- Ali, Y. O., Escala, W. E., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. 49, 2504 (2011).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and behaviors. Exp. Gerontol. 46 (5), 320-325 (2011).
- Grotewiel, M. S., Martin, I., Bhandari, p, Cook-Wiends, E.
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING): a New Method for Assessing Age-related Locomotor Decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. 61, 3791 (2012).
- Long, T. A., Rice, W. R. Adult locomotor activity mediates Intralocus sexual conflict in a laboratory-adapted population of Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 274 (1629), 3105-3112 (2007).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotor in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. 24 (24), 1096 (2009).
- Marden, J. H., Rogina, B., Montooth, K. L., Helfand, S. L. Conditional tradeoff between aging and organismal performance of Indy long-lived mutant flies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (6), 3369-3372 (2003).
- Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, L. Simultaneous tracking of fly movement and gene expression using GFP. BMC Biotechnol. 8, 93 (2008).
- Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, J. Simultaneous tracking of movement and gene expression in multiple Drosophila melanogaster flies using GFP and DsRED fluorescent reporter transgenes. BMC Res Notes. 2 (58), 1-11 (2009).
- Ardekani, R., et al. Three-dimensional tracking and behaviour monitoring of multiple fruit flies. J. R. Soc. Interface. 10 (78), (2013).
- Branson, K. A., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Zou, S., et al. Recording Lifetime Behavior and Movement in an Invertebrate Model. PLOS One. 6 (4), (2011).
- Valente, D., Golani, I., Mitra, P. P. Analysis of the trajectory of Drosophila melanogaster in a circular open field arena. PLoS One. 2 (10), 1083 (2007).
- Inan, O. T., Marcu, O., Sanchez, M. E., Bhattacharya, S., Kovacs, K. T. A portable system for monitoring the behavioral activity of Drosophila. J Neurosci. Methods. 202 (1), 45-52 (2011).
- Parashar, V., Rogina, B. dSir2 mediates the increased spontaneous physical activity in flies on calorie restriction. Aging. 1 (6), 529-541 (2009).
- Kaneuchi, T., Togawa, T., Matsuo, T., Fuyama, Y., Aigaki, T. Efficient measurement of H2O2 resistance in Drosophila using an activity monitor. Biogerontology. 4 (3), 157-165 (2003).
- Carey, J. R., et al. Age-specific and lifetime behavior patterns in Drosophila melanogaster and the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Exp. Gerontol. 41 (1), 93-97 (2006).
- Rhodenizer, D., Martin, I., Bhandari, P., Pletcher, S. D., Grotewiel, M. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp. Gerontol. 43 (8), 739-749 (2008).
- Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (22), 12596-12601 (2001).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. 43, 2157 (2010).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protoc. 11, (2010).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Processing circadian data collected from the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Protoc. 11, Cold Spring Harbor. (2010).
- Ardekani, R., Tavaré, S., Tower, J. Assessing senescence in Drosophila using video tracking. Methods Mol. Biol. 965, 501-516 (2013).
