Summary
ヒト視鏡頭蓋底再建のマウスモデルは、鼻粘膜移植片を用いて、脳と鼻の間の半透過性界面を作成することが開発されている。この方法では、研究者は、全身投与された場合に他の方法で血液脳関門によって除外された高分子量治療薬の中枢神経系への送達を研究することを可能にする。
Abstract
脳への治療薬の送達は、血流から脳組織への極性および高分子量化合物の通過を制限する血液脳関門(BBB)の存在によって妨げられる。ヒトでのいくつかの直接の受け渡しの成功は、経頭蓋カテーテルの移植を介して達成された。しかし、この方法は非常に侵襲的であり、数々の合併症を伴うです。より侵襲性の低い代替物は、ヒトにおける内視鏡経鼻腫瘍除去手術後の頭蓋底の欠陥を修復するために使用される鼻粘膜のような外科的に移植され、半透膜を介して脳に投与するためであろう。この膜も薬物伝達が効率的にBBBをバイパスして、脳と脳脊髄液に直接拡散する。このアプローチに触発され、マウスでの外科的アプローチは、頭蓋外の手術のBBB欠損上移植されたドナー中隔粘膜を使用して開発した。このモデルは、効果的に示されている脳内への高分子量化合物の通過を可能にする。数多くの薬剤候補がBBBを通過することができないので、このモデルでは、神経精神疾患に対する新しい治療法の前臨床試験を実施するための貴重なものです。
Introduction
神経および精神疾患の治療に重大な中枢神経系1-3に到達するすべての潜在的な薬剤の95%以上を阻止する血液脳関門(BBB)の存在によって妨げられる。全身的に送達されたとき、それがBBB 4-6に浸透することができないため、例えば、神経栄養因子(GDNF)、グリア由来の脳に直接注射した場合に、パーキンソン病を治療するのに有効であることが示されている、しかし、効果がない。
多数の接近は、この問題を回避しようとするために開発されている。 neurotheraputicsの全身送達の改善は、脳毛細血管内皮上にある輸送タンパク質に選択的な抗体を含有する薬物複合体を使用することによって実証されている。しかしながら、この方法は、医薬品7,8の幅広い適用可能であることが示されていない。さらに、BBBの浸透開口部はクリニック使用されています。関心9の脳領域へのより直接的な配信とは対照的に、同盟国、しかし、この方法は、全身薬物投与の影響を受けている。相当な努力が直接脳に10月12日を対象としたのを期待して経鼻配信を最適化するようになってきた。いくつかの成功が達成されてきたが、決定的な結果は、例えば、インスリン、13,14などの内因性受容体を有する薬物のために得られている。さらに経鼻デリバリーのメカニズムは、嗅覚ニューロンの取り込みを介して、または血流11を通って脳への間接的なエントリを示唆する証拠と議論されています。植込み型カテーテルを使用する直接、経頭蓋配達がこの手順では、侵襲性が高いと多数の合併症15,16と関連し、達成された。現在までに、脳内に高分子量化合物を送達するためのない一般的な、低侵襲性の方法は存在しない。
マウスの外科的処置は、本明細書で提示さそれは、脳で半透過性のインターフェイスを作成します。これは、マウスでの外科的開頭欠損上粘膜外植片17を移植することによって達成される。この手順を使用して、それは500 kDaの最大水溶性化合物は、時間と分子量依存的に18の両方において、中枢神経系(直接脳実質内へ、並びに脳脊髄液への)に送達することができることが示されている。 BBBを迂回するこの方法は、経鼻内視鏡手術19,20次の頭蓋骨に穴を修復するために血管新生粘膜移植片を使用していますヒトで頭蓋底の欠陥の修理のためのモデルです。
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Protocol
手術前に行われるためにすべての手続きが動物実験委員会および追加倫理的または法的当局によって承認され、人道的な動物の治療プラクティスを使用していることを確認してください。これは、無菌手術の条件を用いて動物実験委員会は、法を承認した使用して、マウスを麻酔し、手術中に獣医軟膏をマウスに目を潤滑し、術後のケアを提供することを含む。手順の側面が承認されるかどうかを疑問点については、手術を続行しないでください。ここに実行されたすべての手順は、ボストン大学機関動物実験委員会によって承認された。
1。動物の作製および外科用品
- 手術中に使用されるすべての外科器具をオートクレーブ。
- 実行されるべきであるすべての技術は動物の規制当局によって承認されていることを確認します。
粘膜移植片の2。収穫
- として同じような年齢の遺伝的に同一のマウスを選んだ実験マウスと(ここでは、頸椎脱臼が続くイソフルラン窒息)動物実験委員会に承認の方法でそれを安楽死させる。
- 外科はさみを使用して、頭蓋骨を露出させ、マウスの頭部の鼻部分の周りの皮膚を取り除きます。
- 空気式ドリルで、横方向に鼻の領域と垂直に2ラインを結ぶの目に沿って、第三の側面に位置する2そのうち3行をマーク。
- 周囲の組織から鼻中隔を分離するために、腹側にドリルダウンします。広いパスが、しかし、それはまた、より困難に膜を単離することであろう粘膜への損傷を防止する。正中線に近い狭いカットを推奨します。
- それに付着した組織から遊離隔壁を切断し、滅菌生理食塩水に格納するはさみを使用する。この時点では、移植片は、接続された組織を除去するクリーンアップすることができます。理想的な状況は、損傷を受けていない粘膜軟骨中隔の両側に露出させることである。一GR後方には、2匹のマウスのための膜は、膜の表面積が開頭術部位をカバーするのに十分である設け供給することができる。これは、移植片が、可能な限り迅速に使用され、研究者は、すぐに移植片が分離されているように、ステップ3に進むことをお勧めします。
粘膜移植片の3。外科的移植
- 標準、無菌マウスの外科的処置を使用して、立体解析フレームにマウスを麻酔し、マウントします。げっ歯類の麻酔器を使用して純酸素で約2%イソフルランを使用してください。
- 耳のバーや鼻ホルダーと定位固定装置にマウスを固定。目に眼軟膏を適用し、3ラウンドのベタジンおよび75%エタノールで頭皮をスクラブ。ハサミやヘアトリマーのいずれかを使用して、頭の上に毛皮を削除します。かみそりの刃で頭蓋骨を露出させ、ヘッドを水平に。投薬される脳の場所の上に開頭を行います。例えば、線条体をターゲットとする場合は、1.25ミリメートルを切る空気圧ドリルを使用。;:(0.88ミリメートルML 1.00ミリメートルのAPを中心とする)頭蓋骨の直径の円形の穴。滅菌生理食塩水掘削面積を湿らせ、頭蓋骨を削除するためにカミソリの刃を使用しています。
- 慎重に針の先端を使用して硬膜を除去します。さらに、この湿った表面に硬膜組織接着剤の最小量を適用することによって達成することができる。この層が硬化した後、剃刀ブレード先端との横方向の動きは、膜を除去するために使用することができる。
- 離れて傷と反対側上皮側を維持するために細心の注意を取って脳表面上の粘膜を配置します。これは、最高のピンセットで開頭術部位に隣接する頭蓋骨の表面上に隔壁全体を転送することによって行われる。外科はさみの先端を使用して、軟骨のOffおよび頭蓋骨と脳の表面に膜を引っ張る。膜が乾燥したり、任意の吸収性材料で触れないようにしてください。グラフトは、寛大に開頭Sのすべての骨の端と端が重なる必要があります映像情報メディア学会。
- ニトリルの無菌枚で移植をカバーしています。これは、治癒の間に皮膚移植片の付着を防止するように作用する。ニトリルは、全体の粘膜を覆うのに十分な大きさであればよい。必要であれば過度の膜をトリミング。それは、移植片に接触した後、ニトリルのいずれかの運動は避けてください。
- 実行中の5-0無菌縫合糸で皮膚を閉じ、マウスが次のステップに進む前に3-7日間回復しましょう。皮膚閉鎖時のニトリルバリアまたは粘膜移植を混乱しないように注意してください。
投与液の4。管理
- 定位フレームに、麻酔したマウスを固定した後、ハサミで縫合糸をカットし、頭蓋骨の周りの余分な皮膚を取り除く。
- ニトリル障壁を除去して頭蓋骨の表面を清掃してください。移植が表示されるまでの領域をきれいに滅菌生理食塩水と綿棒を使用しています。 dよりも大きく成長した場合に移植片をカミソリで切断する必要があるかもしれない表面積をesired。
- 実験は数日より長くなる場合には、頭インプラントを補強するために、少なくとも2つの頭蓋骨用ねじを埋め込むことが賢明である。
- エッジが頭蓋骨に接触しているように、移植片の上にうまく配置します。ウェルと頭蓋骨の間の接合部にシアノアクリレート系接着剤を塗布。滅菌生理食塩水とよくを満たし、漏れがないことを確認してください。ウェルをカット注射針から作られる。
- 所定の位置にうまくを確保するために頭蓋骨に骨セメントを適用します。
- ピペットで井戸から生理食塩水を除去します。その接着剤が必要なソリューションを追加するインチ漏洩していません検証するだけでなく、数回洗浄する。この場合には、蛍光デキストラン50μlのに使用される。これは、類似の極性の水溶性化合物はデキストランと同様に動作することが期待される。疎水性化合物または懸濁液の送達は、この方法で検討されていません。
- に固定され、ニトリルの円形の部分を使用してウェルのトップにキャップシアノアクリレート接着剤を用いてトップ。接着剤は、ウェル内容物と接触しないことを確認してください。
粘膜送達の5。分析
- 所望の時間が経過した後に、マウスを麻酔し、エバンスブルー色素の溶液でウェル内容物を交換する。この色素は、移植片が無傷であったことを確認するために使用されている。
- 30分後、頻繁にマウスを麻酔、色素溶液を除去し、断頭を経由して安楽死させる。
- 手動でインプラントを除去し、手術用はさみを用いて脳を削除します。所定の位置に移植しないように注意してください。
- 一旦除去、フラッシュ凍結イソブタンの溶液中に脳をドライアイス浴中で冷却した。
- 50μMで最適な切削温度(10月)ソリューションとスライス脳に埋め込む。
- 顕微鏡スライド上で直接目的のスライスを配置します。
- 画像次第のOCT溶液を乾燥させたように蛍光顕微鏡を使用してスライス。
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Representative Results
十分な大きさの鼻中隔の外植片を得ることがその後のステップのために重要である。これは、 図1aに示されたドナーマウスの頭蓋上の位置で穿孔することによって達成することができる。 図1bに示すように、この経路に沿って切断して十分なサイズの外植片を生成する。掘削深さが十分に深くない場合には、移植片は切り捨てられ、それが脳の表面を覆うように十分な大きさの膜を得ることは困難であろう。より多くの組織は、鼻中隔に残り、次のステップはより困難になりますので、より横方向を示唆したパスよりも掘削はお勧めできません。事前の粘膜の転送するには、セプタムの表面がすべての余分な結合組織をきれいにする必要があります。これが完了すると、粘膜には、軟骨の表面に表示されるはずです。 図1cは、組織は、洗浄後にどのように見えるかを示しています。
MEMBを転送する前に、RANEは、開頭術および硬膜切除は、脳の表面を露出させるために実行される必要がある。後硬膜切除出血が停止した後にのみ膜を転送することができます。 図2aは、手術部位は、次のステップに進む前に、どのように見えるかを示しています。脳の表面に軟骨から粘膜を転送する全体の外科的処置の中で最も技術的に困難なステップであり、慎重に行う必要があります。収穫中隔が十分に大きい場合、粘膜移植片の表面積は、脳の表面を覆うのに十分な大きさであるべきである。転送されると、手術領域は、 図2bと同様に見えるはずです。これは、軟骨と接触している膜の面は、脳表面に接触しているものと同じであることを確認することが重要である。膜を裏返し、またはそれ自体の上に折り畳まれます場合、それは破棄されるべきであり、もう一方が使用されるべきである。このステップが完了すると、頭皮を縫合することができるマウスを回復することができ、グラフトは癒すことができるように。頭皮の内面に接触する移植片からの有害反応を防ぐために、保護ニトリルのピースは、手術部位への上に配置されるべきである。 図2cに示すように、挿入された作品は、膜をカバーするのに十分な大きさが、皮膚が閉じて縫合する妨げに十分な大きさではないでなければなりません。
回復期間中、内部成長の実質的な組織は、膜を投与する前に除去しなければならない周囲の骨膜のために発生します。頭皮を再オープンした後、滅菌した綿棒や生理食塩水は、 図3aと同様に見えるまで、サイトを洗浄するために使用する必要があります。私たちは、実質的な免疫応答を確認されていません。しかしながら、これは組織学的に確認されていない。移植片は、頭蓋骨の表面を横切って成長してきた場合には、カミソリで切断する必要があるかもしれません。この段階で投与ソリューションが含まれますうまくTiONからは、移植片の上に移植する必要があります。インプラントの長期的な機械的安定性が懸念される場合には、いくつかの頭蓋骨のネジは、この段階で入れることができます。それは、移植片に接触しないように十分に配置されていることを確認します。一旦適所に、シアノアクリレート接着剤は、頭蓋骨に接着するために適用することができる。移植片と接触するのを防ぐために接着剤には、ウェルの表面に塗布し、隙間をシールするために下方に押されるべきである。井戸が安全であると、それは、移植片を水和して漏れをチェックし、両方に生理食塩水を一時的に満たされなければならない。付着したウェルは、図3bにそのように見て、必要があります ソリューション それはどんな接着剤が含まれていないことを示す明確にする必要があります。ウェル内の液面が低下しますので、任意のリークは明らかであろう。漏れが検出された場合、それらは、より接着剤で固定する必要がある。ウェルはその後、骨セメントで補強されている。この時点で、ウェル内の生理食塩水をピペットで除去することができると所望の投薬溶液と交換。ニトリルのケアの一部とよくをカバーする際に接着剤がウェル内の溶液に接触しないことを確認するために注意する必要があります。全体の手順の最後に、マウスの頭部は、 図3cにそのようになっているはずです。骨セメントは、ウェルの内容物が光感受性である場合、従って、染料またはインクウェル内容物の光分解を防ぐために乾燥したセメントの表面にセメント混合物に添加することができるわずかに半透明である。
待機所望の時間後、脳は、投与の効果を発見するために分析されるべきである。脳が検討されているものに応じて異なる方法で扱われるべきである。手順の目的は、(上記のプロトコルの項に記載されているような)、ウェルに加え、任意の化学物質の存在を分析することであるなら、それは、投与される化合物を保存するために、脳の瞬間冷凍を行うことをお勧めします。 図4 >このアプローチを用いた代表的な結果を示している。 24時間、40 kDaの蛍光体(tetramethyrhodamine共役デキストラン)を投与すると、脳組織に顕著な拡散を示しています。脳組織へのデキストランショー拡散と我々の以前の結果は、18時間と分子量の両方に依存しています。小さな分子は、我々が試験した全ての分子量のための拡散をより多く、より大きなものよりも大きく、脳実質内に拡散し、大きな投与時間の結果。瞬間冷凍が行われる場合は、切片化した後、スライドをマウントし、すべてのソリューションにそれらをさらさないことが重要です。任意の液体が投与された化合物を可溶化し、脳切片の表面積を横切ってそれを拡散する。免疫組織化学は、脳に実行される場合、それは脳組織を修正するために、マウスを灌流することをお勧めします。
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図1。鼻中隔の収穫手順のイメージ。 A)安楽死させたマウスの頭蓋骨にドリル部位の位置。点線は、直接余分な組織を除去した後、外科的に除去。C)鼻中隔の後に。B)鼻中隔をドリル周囲を示している。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。移植プロセスの手術画像。 A)開頭と硬膜切除次手術部位。イメージは、頭蓋骨がそれに移植を配置する前に、どのようなものかを表している開頭サイトに粘膜移植の。B)に配置。点線は、移植片の周囲を示している。画像は、保護バリアのニトリルグラフト。C)移植の所望の表面積を示す。示すように、材料の大きさは、移植片をカバーするのに十分な大きさが、縫合に干渉するのに十分な大きさではありません。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。薬剤投与法の手術画像。 A)癒さ粘膜移植手術部位の厳格な洗浄の後にどのようなものか。だけでなく頭蓋骨に添付のB)の画像の例を。よく頭蓋骨とのインタフェースが確保されているシアノアクリレート接着剤及びウェルで滅菌生理食塩水で満たされている。安定した液レベルが井戸から漏れがないことを示し、溶液の透明度は、接着剤を用いて、溶液の汚染がないことを示します。C)完成手術の画像を表示する。ウェルは、投薬溶液を含有し、確実ニトリルバリアでキャップされている。骨セメントは、ウェル注入を剛性化するための場所である。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4。24時間40kDaのテトラメチルローダミン共役デキストランの投与経後のマウス脳切片の蛍光顕微鏡像。スライスは50の厚さで-1.06ミリブレグマで撮影された1、M。粘膜移植は、脳の表面上に表示されている。バー= 1ミリメートル。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここに記載されている手順の最も困難な段階は、脳の表面に適切なサイズの粘膜を正常に転送することです。収穫され、鼻中隔が十分に大きく、十分に洗浄された場合は、この手順が大幅に容易になる。中隔の腹側の部分が切り捨てられた場合、新たな移植片が得られるはずである。掘削角度は、粘膜ドリルによって損傷を受けないことを保証するために、マウスの頭部に対して垂直であるべきである。広い推奨値よりも掘削パスが取られている場合は、中隔に接続されている余分な組織を除去するためにはるかに困難になります。結合組織のいずれかの大規模な作品ではなく緩いそれらを引くしようとするよりも鋭いハサミカットで削除する必要があります。組織の小片は、組織が粘膜に接続されていない設けはさみの先端でこすることによって除去することができる。洗浄工程の終わりに、依然として結合した膜と軟骨表面が露出されるべきである。 OCCAsionally中隔の軟骨は、それが背側エッジに接続されている骨から切り離され得る。これは、それが次のステップでそれを使用することが可能であるような場合は、しかし、それは2つの理由のために、より困難である。骨は、洗浄し、それを転送する際に、外植片を保持するのに便利なハンドルです。一旦除去され、より繊細な軟骨シートを操作するのが難しくなる。粘膜、軟骨から取り外す際に得ることが最も厚く、最も容易である第二に、軟骨と骨の接合がある。骨は軟骨から分離されている場合は、膜のこの部分は失われます。
中隔移植片を洗浄しており、開頭と硬膜切除が行われた後、粘膜が露出脳表面上に配置することができる。これは最高の開頭部位に隣接植片を配置することによって達成される。次いで、膜を頭蓋骨上に、および脳の上に、軟骨から引き出すことができる。多くのことは、このプロセスへの際に間違って行くことができるS。この膜は、それ自体の上、または束を上に折り、破棄されます、完全に乾くことができます。また、隔壁の他側を覆う膜は頭蓋骨擦れから損傷を受けることができます。これは、上向きに粘膜を除去しようとして、一つは、同時に両側からの膜を除去することも可能である。これらの問題のすべてを防止するためには、隔壁の両側を観察し、ゆっくりと常に膜を移動させることが重要である。最善の戦略は、それをオフにスライドしようとする前に軟骨シートからの膜を取り除くために、はさみの先端を使用することです。膜の任意の部分が付着したままの場合は、組織の弾性がそれを引っ張った後に後退することが可能である。小さな、引っ張る動作を用いて膜を隔膜から取り外すことができる。唯一それが容易にオフにスライドします。膜は、ピンセットで扱うことができることが薄すぎる。それは別の面から引き出すことができる。それは上に跳ね上げたり、それ自体の上に折り畳まれます場合は、破棄されるべきであり、他の一つは、得られるべきである。
移植片が露出した脳の表面領域全体を覆う場合、処理は成功し、手術部位が治癒することができるように、頭皮を縫合することができる。皮膚が膜に接触しないように、ニトリルバリアが適所に置かれなければならない。そうでなければ、移植位置が移動することを縫合する際に、その圧力は、ニトリルに及ぼさないように注意が必要です。また、ニトリルに縫合しないように注意してください。必ず材料が従うようにする最良の方法は、生理食塩水で湿ったそれを維持し、必ずそれは、縫合を通じてフラットのままにすることです。
移植片(3-7日間)治癒した後、投与溶液を含有するウェルは、上記グラフト頭蓋骨に取り付けることができる。これは、接着剤で接着し、恒久的に骨セメントで頭蓋に一時的に固定することができる。骨セメントが適用されると、それはウェル位置therefoへの修正を行うことができなくなる再すべての最適化は、その適用前に行う必要があります。ウェル位置にあり、シアノアクリレート接着剤で固定されると、それは、滅菌生理食塩水で充填されるべきである。プロシージャが正常に行われていた場合は、液体のレベルは変化しませんし、溶液は透明になります。漏れがある場合は、レベルが低下し、水がエスケープされた場所の位置が表示されるはずです。リークサイト上でより多くの接着剤を塗布した後、より多くの生理食塩水が漏れが密閉されたことを確認するために追加する必要があります。接着剤が十分に液を汚染する場合は、半透明のフィルムが液面の上部に表示されます。この場合は、溶液が透明になるまでよく、生理食塩水で数回洗浄されるべきである。さらに、綿のスワップが液面に触れることにより、膜を除去するために使用することができる。ウェル溶液は、安定的かつ明確である場合にのみ、セメントを適用する必要があります。セメントが乾燥したら、ウェルから食塩水を除去し、投薬溶液で置換することができる。ケアに注意が必要ですへと外によくピペッティング時に膜に損傷を与えない。充填後、ウェルの頂部は、シアノアクリレート接着剤を用いてニトリル片で密封されるべきである。これは、空間が溶液の表面とウェルの頂部との間に残されることが重要である。これは、ニトリルバリアを装着する際の接着剤は、ソリューションに触れていないことを保証します。
それは、投薬手順の効果を分析する時間になると、脳を取り出し、画像化されなければならない。免疫組織化学を行う場合には、標準的な灌流および抗体染色を行うことができる。投与された化合物の位置が決定される場合には、ドライアイス/イソブタン溶液中で脳を凍結点滅することをお勧めします。これは、安楽死の直前にあったように脳スライス中の化合物の位置が同じであることを保証する。
本明細書に記載されたプロトコールは、外科的に介してマウス脳への薬物送達を調査する方法を記載半透過性の粘膜18を移植された。これは頭蓋底欠陥が血管化、鼻粘膜19,20で修復されているヒトでの経鼻腫瘍除去手術の結果に類似しています。このマウスモデルを用いて、これらの粘膜移植片はBBBをバイパスして脳への直接的な高分子量の薬物の送達を可能にすることができる方法を研究することが可能である。我々は今、100回以上、この手順を実行しました。この手順の重要なドナーマウスの鼻中隔の移植の成功を収穫し、試験マウスへの移植から粘膜の転送です。この手順では、初めて、神経学的および精神障害の様々な高分子量治療薬の前臨床試験を可能にします。
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Disclosures
ベンジャミンS. BLEIER MDは、中枢神経系への薬物送達の仮特許被覆法のリード発明者である。
Acknowledgments
この研究は、パーキンソン病リサーチ2011迅速な応答イノベーションアワードプログラムのMcihael J·フォックス財団によって資金を供給された。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mice | Taconic | C57BL/6 | |
Isoflurane | Piramal Healthcare | ||
Student fine scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
Pneumatic drill | MTI Dental | 333-CB | |
Drill bit | |||
Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
0.9% Sodium chloride injection USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
Polystyrene Petri dish | Fisher | 08-757-12 | for temporarily storing graft |
Bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Oxygen/Isoflurane System | SurgiVet | V720100 | |
Temperature Control System | Physitemp | TCAT-2LV | |
Small animal stereotaxic instrument | KOPF | Model 940 | |
Eye ointment | |||
Electric shaver | |||
Cotton-tipped applicators | Fisher | 23-400-106 | |
7.5% Providone iodine | Betadine surgical scrub | ||
70% Ethanol | |||
Surgical blade stainless | Feather | 2976#10 | |
Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
3% Hydogen peroxide | for cleaning the skull | ||
Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
Needles | Becton, Dickinson and Company | 305176 | needle tip cut off and used as well |
Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309597 | |
Nitrile gloves | Denville Scientific Inc | G4162 | for well closure and protection of graft |
5-0 Nylon suture thread | |||
Student Halsey needle holder | Fine Science Tools | 91201-13 | |
Cyanoacrylate adhesive | commecially available super glue | ||
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque | Stoelting | 51458 | |
Isobutane (2-methylbutane) | Aldrich | M32631 | for dry ice bath |
Dry ice |
References
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