Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis

Summary

Na spinale doorsnijding, volwassen zebravissen hebben functioneel herstel van zes weken na het letsel. Om te profiteren van larvale transparantie en sneller herstel nemen, presenteren we een methode voor het doorsnijden van de larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, zien we zintuiglijke herstel vanaf 2 dagen na het letsel, en C-bocht beweging door 3 dagen na het letsel.

Abstract

Zoogdieren falen in sensorische en motorische herstel na dwarslaesie door gebrek aan axonale hergroei onder het niveau van zowel de schade als een onvermogen om spinale neurogenese hervatten. Sommige anamniotes waaronder de zebravis Danio rerio vertonen zowel sensorische en functioneel herstel zelfs na volledige doorsnijding van het ruggenmerg. De volwassen zebravis is een gevestigde modelorganisme voor het bestuderen van regeneratie na dwarslaesie, met sensorische en motorische herstel van 6 weken na het letsel. Om te profiteren van in vivo analyse van het regeneratieve proces in de transparante larvale zebravis en genetische hulpmiddelen niet in de volwassen toegankelijke nemen, gebruiken we de larvale zebravis regeneratie studie na ruggenmerg doorsnijding. Hier laten we een methode voor het reproduceerbaar en verifieerbaar transecting het larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, uit onze gegevens blijkt zintuiglijke recovery begin op 2 dagen na het letsel (dpi), with de C-bocht beweging detecteerbaar met 3 dpi en hervatting van de gratis zwemmen met 5 dpi. Zo stellen wij de larvale zebravis als een metgezel instrument om de volwassen zebravissen voor de studie van herstel na dwarslaesie.

Introduction

Belangrijke trauma aan het menselijke ruggenmerg resulteert vaak in permanente verlamming en gevoelsverlies onder het niveau van schade als gevolg van het onvermogen om axons teruggroeien of hervatten neurogenese ^1,2. In tegenstelling tot zoogdieren, echter anamniotes waaronder salamanders en zebravis (Danio rerio) tonen krachtig herstel, zelfs na volledige ruggenmerg doorsnijding ^3,4.

De volwassen zebravis is een goed uitgewerkt model voor het bestuderen van het herstelproces na dwarslaesie ^5-7. Na volledige ruggenmerg doorsnijding, is herstel van sensorische en locomotief functie waargenomen in de volwassen zebravissen met 6 weken na het letsel ^8. Om het regeneratieve proces in vivo onderzoeken we kwamen de transparante larvale zebravis ^9.

Hier presenteren we een methode om het ruggenmerg van een 5 dagen na de bevruchting (DPF) larvale zebravis usi doorsnijdenng een afgeschuinde micro-injectie pipet als een scalpel, gewijzigd van Bhatt, et al.. ¹⁰ Deze methode ondersteunt high throughput, lage sterfte en reproduceerbaarheid. Met de praktijk, kan 300 larven / uur worden doorsneden, en meer dan 6 maanden van doorsnijdingen, waaronder meer dan 3600 dieren, 98.75% ± 0,72% overleefde tot 7 dagen na het letsel (dpi). Onze gegevens blijkt snel herstel van de sensorische en motoriek ook: op 1 dpi, wordt alle verkeer door de gewonde vis gedreven door slechts borstvin motoriek. Echter, larven beginnen te reageren op de naald contact caudaal wolfraam te doorsnijden met 2 dpi, herstel de C-bocht beweging door 3 dpi, en weer roofzuchtige zwemmen met 5 dpi ^11. Met behulp antilichaamkleuring tegen geacetyleerd tubuline, hebben we bevestigd dat axonen afwezig zijn van het letsel site op 1 dpi, maar het letsel website hebben doorkruist door 5 dpi. Wij geloven dat dit protocol een waardevolle methode voor de studie van axonale hergroei en neurogenese in het ruggenmerg na verwonding.

Protocol

Zebravis zijn gerezen en gefokt volgens standaardprocedures; experimenten werden goedgekeurd door de Universiteit van Utah Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Voorbereiding van de Chirurgie Platen

1. Maak chirurgie platen met behulp van 60 mm petrischaaltjes en Sylgard 184 siliconelastomeerfase Kit, na instructies van de fabrikant. Vul gerechten hoogste halfvol en laten polymeriseren. Opslag bij kamertemperatuur.

2. Bereiding van micropipetten

1. Fabriceren micropipetten door verhitting en trekken dunwandige borosilicaatglas capillaire buis in een micropipet trekker met dezelfde instellingen voor het maken van micro-injectie naalden.
2. Onder een dissectie microscoop, breek punt van micropipet tot ongeveer 200 micrometer in doorsnede met een pincet.
3. Schuine gebroken rand met een microgrinder aanvankelijk 35 °, gevolgd door een tweede afschuining bij 25 °. Zorgen tip is scherp en SMOOTH. Store afgewerkt afgeschuind micropipet in een petrischaal op een kleine hoeveelheid klei.

3. Voorbereiding van de zebravis Larven

1. 7 dagen vóór de ingreep, het opzetten van paring tanks van mannelijke en vrouwelijke zebravis.
2. Verzamel embryo's de volgende ochtend 3 uur na de lampjes gaan branden om maximaal rendement te garanderen. Bij gebruik van een transgene reporter lijn zoals Tg (elevl3: eGFP) ^knu3, sorteren bevruchte embryo's 100/100 mm plaat in 25 ml van de E3 op 28.5 ° C. Bij gebruik van wild-type, soort bevruchte embryo's 25/100 mm plaat in 25 ml van de E3 op 28.5 ° C.
3. Bij gebruik van een verslaggever lijn, screenen van embryo's voor fluorescentielampen expressie op 48 hpf. Laat geïdentificeerd embryo's rijpen bij een dichtheid van 25/100 mm plaat in 25 ml E3 28,5 ° C.
4. Als larven zijn 5 dpf, bereiden chirurgie plaat door het bedekken Sylgard met E2 + 10 mg / L gentamycinesulfaat (GS) + tricaïne.
   1. Bereid herstel gerecht door toevoeging van 25 ml E2 + GS om een ​​100 mm Petri dish.
   2. Bereid scalpel met tape bij elkaar drie swabs. Dit zal een driehoekig instrument met drie groeven vormen.
   3. Monteer een micropipet bereid op de zwabbers door met tape in een van de groeven.
5. Als hergebruik micropipetten, spoelen totdat duidelijk met E2 + GS met behulp van een 1 ml spuit en een 27 G naald voorafgaand aan montage op swabs.

4. Chirurgie

1. Verdoven 1 plaat van larven in een tijd (25 vissen) met tricaïne. Vis voldoende verdoofd als ze niet langer contact reactie vertonen. Het is belangrijk dat de vis volledig voorafgaand aan chirurgie worden verdoofd, anders zullen zij trillen wanneer de scalpel ze aanraakt. Operatie wordt uitgevoerd onder een dissectie microscoop.
2. Transfer larven aan de operatie plaat.
   1. Onder maximale vergroting, draai een larve in een tijd, zodat het ligt op zijn kant met zijn rug het dichtst bij de hand houden van de scalpel.
   2. Positie tang zodat ze rusten op de Sylgard,schuin over de breedte van de larve.
   3. Bracing de glazen scalpel tegen een van de armen van de tang, gesneden in de dorsale laterale vlak van de larve ter hoogte van de anale poriën, waarbij u niet te snijden dan de ventrale rand van de notochord. Draai de scalpel om het ruggenmerg te verbreken.
   4. Herhaal met de rest larven.
      Opmerking: als een larve bloedt, zal het niet herstellen van de operatie. Verwijder direct de larve van de operatie bord en euthanaseren het via tricaïne overdosis.
3. Zodra een operatie aan de partij van de larven is voltooid, overdracht gewonde dieren aan het herstel plaat. Dit is om de clearing van anesthesie ondersteunen.
   1. Let op: bij het verzamelen gewond larven voor de overdracht, zorg ervoor dat ze worden eerst verzameld kop of staart: niet de verwonding niet benadrukken door het buigen van de larven.
      Opmerking: Alle toestellen voor operatie kan worden hergebruikt, waaronder de micropipetten.

5. Recovery

1. Transfer gewonden larven van het herstel plaat 100 mm platen gevuld met 25 ml E2 + GS bij een dichtheid van 25/plate. Laat om te herstellen in een 28,5 ° C incubator.
2. Controleer platen dagelijks, het verwijderen van zieke en dode dieren. Laat de media niet veranderen totdat Coleps (zoetwater protozoa) zijn zichtbaar in de media. Bij het wijzigen van de media, hoeft de vis niet over te dragen aan een nieuwe plaat; in plaats daarvan, verwijder zoveel media mogelijk en overspoelen de zelfde plaat met nieuwe media. Herhalen als nodig is om Coleps bevolking te verminderen.
3. Dagelijks te voeden met een kleine hoeveelheid poeder bak eten.
   Opmerking: Levend voedsel (bv, pantoffeldiertjes of rotiferen) kan niet aan benadeelden larven worden gevoed nadat zij motoriek hebben hersteld. Anders wordt het levend voer de verwondingsplaats koloniseren en doodt de larven.

Representative Results

Om de ernst van de beschadiging van het weefsel rondom de verwonding te verminderen, een goede afschuining van de micropipet is van cruciaal belang. Figuur 1A toont een correct afgeschuinde punt. Het gebruik van een tip die te breed (figuur 1B) meestal in hogere doden vanwege de verhoogde kans op knikken de dorsale aorta, terwijl een tip die te smal (figuur 1C) neigt blik van de huid in plaats van snijden weefsel.

Om deze techniek te oefenen, is het voordelig om een reporter lijn gebruiken zoals Tg (elevl3: eGFP) ^knu3 het ruggenmerg visualiseren Figuur 2A toont een volledig doorgesneden ruggenmerg van een levende Tg (elevl3: eGFP). Zebravis 1 dpi, . terwijl Figuur 2B toont dezelfde levende vis op 3dpi figuren 2C en 2D tonen sterkere vergrotingen van het letsel site op 3 dpi in vaste Tg (dbx1a: eGFP) vis met complete (figuur 2C) of onvolledige (figuur 2D) ruggenmerg doorsnijding. Let op de aangrenzende regio neuron etiket langs de ventrale rand van het ruggenmerg (gele pijl).

Figuur 1. Vergelijking van de scalpel randen. A toont een correct afgeschuinde micropipet tip geschikt voor een operatie. Deze maat is gemakkelijk gereinigd voor hergebruik. B toont een afgeschuinde micropipet tip te breed voor een operatie op een 5 dpf larve. C is een voorbeeld van een tip dat is te smal. Deze maat is zeer moeilijk schoon voor hergebruik, en de neiging om een zagende werking van doorsnijding plaats van snijden promoten D:. Cartoon van de laesie werktuigsamenstel. Three 6 "swabs zijn genest in een pyramidal vorm en aan elkaar geplakt. De scalpel ligt in een van de groeven gevormd door de drie swabs, en vastgebonden plaats.

.. Figuur 2 Controleren van volledige doorsnijding TL confocale microscopie werd gebruikt om het live-Tg (elavl3: eGFP) vissen in vivo bij 1 dpi (A) en 3dpi (B). Om volledige doorsnijding te bevestigen, werden deze afbeelding stapels vervolgens verwerkt in ImageJ (rsbweb.nih.gov) tot maximale intensiteit Projecties (MaxZ) genereren zoals in A - B C - D tonen MaxZ projecties van HuC / D label Tg (dbx1a.: eGFP) vis op 3 dpi met volledige spinale transsectie (C) of onvolledige doorsnijding (D).Gele pijlen identificeren verwondingsplaats, D = rug-, R = rostral. Schaal bar = 100 micrometer.

Discussion

Bij de eerste leren van deze techniek, raden we proberen niet meer dan 50-100 doorsnijdingen in een enkele sessie. Na het beheersen van deze techniek zijn we in staat om het doornemen tot 300 embryo's per uur; echter, dit niveau van throughput vereist een paar maanden van wekelijkse praktijk. We raden ook aan het oefenen met een verslaggever lijn en verifiëren volledige doorsnijding tot de incidentie van onvolledige ruggenmerg doorsnijding wordt teruggebracht tot minder dan 1%.

Ruggenmerg doorsnijding in de volwassen zebravis is een gevestigde en robuuste techniek voor het bestuderen axonale hergroei en neurogenese na een blessure. Door het verplaatsen van deze analyse in het larvale organisme, zijn we in staat om het herstel te onderzoeken in vivo. Daarnaast zijn we ook in staat om genetische hulpmiddelen niet beschikbaar te gebruiken in de volwassen zebravissen om de rol van verschillende genen te onderzoeken in het regeneratieve proces, bijvoorbeeld, Tcf7l1a ^12.

Oorspronkelijk developed om neurogenese te studeren na het ruggenmerg doorsnijding Deze techniek kan ook worden gebruikt om het herstel van sensorische functie te onderzoeken: gewonde dieren tonen een reactie op caudaal te raken om de schade site van 2 dpi, en axonen zijn de schade-terrein doorkruist door 5 dpi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dish	VWR	82050-544
100 mm Petri dish	VWR	89038-968
PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388
borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Forceps	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Disssection microscope	Nikon	SMZ6454
Microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Cotton tipped applicator, wood, 6-inch	Fisher Scientific	23-400-101
1 ml syringe	BD	309625
27 G needle	BD	305109
Fry food	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	store at -20 °C
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Box Filament FB330B
20x E2 (1 L); store at RT
17.5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90 g CaCl2·2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 g MgSO4·7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra
0.35 g NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); store at RT
50 ml 20x E2
2 ml fresh 500x NaCO3