Summary
بعد transection الشوكي، الزرد الكبار يكون الانتعاش وظيفية لمدة ستة أسابيع بعد الإصابة. للاستفادة من الشفافية اليرقات والانتعاش بشكل أسرع، ونحن نقدم وسيلة لtransecting الحبل الشوكي اليرقات. بعد transection، نلاحظ الانتعاش الحسية ابتداء من الساعة 2 أيام بعد الإصابة، وحركة C-منحنى قبل 3 أيام بعد الإصابة.
Abstract
تفشل الثدييات في الانتعاش الحسية والحركية التالية إصابة النخاع الشوكي بسبب نقص إعادة نمو محور عصبي دون مستوى الإصابة وكذلك عدم القدرة على معاودة تكوين الخلايا العصبية في العمود الفقري. ومع ذلك، فإن بعض anamniotes بما في ذلك الزرد دانيو rerio المعرض على حد سواء الحسية والانتعاش وظيفية حتى بعد transection كاملة من الحبل الشوكي. الزرد الكبار هو نموذج حي أنشئت لدراسة التجديد التالية اصابات الحبل الشوكي، مع الانتعاش الحسية والحركية من خلال 6 أسابيع بعد الإصابة. للاستفادة من الجسم الحي في تحليل عملية التجدد المتاحة في الزرد اليرقات شفافة وكذلك الأدوات الجينية لا يمكن الوصول إليها في الكبار، ونحن نستخدم اليرقات الزرد لدراسة تجديد بعد transection الحبل الشوكي. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة لبتكاثر ويمكن التحقق منه transecting الحبل الشوكي اليرقات. بعد transection، بياناتنا تظهر الانتعاش الحسية بداية في 2 يوما بعد الإصابة (نقطة في البوصة)، وخفة دمح حركة-C منحنى كشفها بواسطة 3 نقطة في البوصة واستئناف السباحة الحرة بنسبة 5 نقطة في البوصة. وبالتالي نقترح الزرد اليرقات كأداة مصاحب لالزرد الكبار لدراسة الانتعاش بعد إصابة الحبل الشوكي.
Introduction
الصدمة الكبرى إلى الحبل الشوكي الإنسان غالبا ما يؤدي إلى الشلل الدائم وفقدان الإحساس دون مستوى الإصابة، وذلك بسبب عدم القدرة على محاور عصبية أو تجديد أعماله تنمو الخلايا العصبية 1،2. وعلى النقيض من الثدييات، ومع ذلك، بما في ذلك anamniotes السلمندر والزرد (دانيو rerio) تظهر انتعاشا قويا حتى بعد transection الحبل الشوكي كاملة 3،4.
الزرد الكبار هو نموذج راسخة لدراسة عملية الانتعاش في أعقاب إصابة الحبل الشوكي 5-7. التالية transection كاملة في النخاع الشوكي، لوحظ إعادة وظيفة الحسية وقاطرة في الزرد الكبار بنسبة 6 أسابيع بعد الإصابة 8. من أجل دراسة عملية التجدد في الجسم الحي، لجأنا إلى الزرد اليرقات شفافة 9.
ونحن هنا نقدم وسيلة لالقطع في الحبل الشوكي من 5 أيام بعد الإخصاب (DPF) اليرقات الزرد باليودنانوغرام ماصة حقن مكروي مشطوف كما مشرط أو تعديلها من بهات، وآخرون. يدعم 10 هذا الأسلوب إنتاجية عالية ومعدلات وفيات منخفضة، والتكاثر. مع الممارسة، 300 يرقة / ساعة يمكن مقطوع، وأكثر من 6 أشهر من transections، بما في ذلك أكثر من 3،600 الحيوانات، 98.75٪ ± 0.72٪ نجا حتى 7 أيام بعد الإصابة (نقطة في البوصة). وتظهر بيانات لدينا انتعاش سريع للتنقل الحسية وكذلك: في 1 نقطة في البوصة، هو الدافع وراء كل حركة من الأسماك أصيب الصدرية تحرك الزعانف فقط. ومع ذلك، تبدأ اليرقات للرد على إبرة التنغستن مسة الذيلية لtransection بنسبة 2 نقطة في البوصة، إعادة تأسيس الحركة C-منحنى بنسبة 3 نقطة في البوصة، وعرض السباحة المفترسة بنسبة 5 نقطة في البوصة 11. باستخدام الأجسام المضادة ضد تلطيخ تويولين الأسيتيل، ونحن قد أكدت أن محاور هي غائبة عن موقع الإصابة في 1 نقطة في البوصة، ولكن عبروا موقع الإصابة بنسبة 5 نقطة في البوصة. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول توفير تقنية قيمة لدراسة إعادة نمو محور عصبي وتكوين الخلايا العصبية في النخاع الشوكي بعد الاصابة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأثيرت الزرد وتربيتها وفقا للاجراءات المتبعة؛ تمت الموافقة على التجارب من قبل الجامعة لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية ولاية يوتا.
1. إعداد لوحات جراحة
- جعل لوحات الجراحة باستخدام 60 مم أطباق بتري وSylgard 184 السيليكون المرنة كيت، بعد تعليمات الشركة الصانعة. ملء أطباق لا يزيد عن نصف كامل والسماح لبلمرة. متجر تغطيتها على درجة حرارة الغرفة.
2. إعداد بال micropipettes
- افتعال بال micropipettes عن طريق تسخين وسحب رقيقة الجدار البورسليكات الشعرية أنابيب في مجتذب micropipette باستخدام نفس إعدادات لصنع إبر حقن مكروي.
- تحت المجهر تشريح، والمفاجئة قبالة غيض من micropipette إلى ما يقرب من 200 ميكرون في القطر بالملقط.
- شطبة الحافة المكسورة مع microgrinder في البداية إلى 35 درجة، تليها الميلا الثاني عند 25 درجة. ضمان طرف حاد وSMOالغير. متجر الانتهاء micropipette مشطوف في طبق بتري على كمية صغيرة من الطين.
3. إعداد الزرد اليرقات
- 7 أيام قبل الجراحة، وإنشاء خزانات التزاوج من الزرد الذكور والإناث.
- جمع الأجنة في صباح اليوم التالي، 3 ساعة بعد تتسلط الأضواء على لضمان أقصى قدر من العائد. في حالة استخدام خط مراسل المعدلة وراثيا مثل تيراغرام (elevl3: EGFP) knu3 والأجنة المخصبة نوع 100/100 مم لوحة في 25 مل من E3 في 28.5 درجة مئوية. إذا باستخدام wildtype، المخصبة نوع الأجنة 25/100 مم لوحة في 25 مل من E3 في 28.5 درجة مئوية.
- في حالة استخدام خط مراسل، وشاشة الأجنة للتعبير الفلورسنت في 48 HPF. تسمح الأجنة التي تم تحديدها لتنضج في كثافة 25/100 مم لوحة في 25 مل من E3 في 28.5 درجة مئوية.
- عندما اليرقات هي 5 DPF، وإعداد لوحة لعملية جراحية من خلال تغطية Sylgard مع E2 + 10 ملغم / لتر جنتاميسين سلفات (GS) + تريكين.
- إعداد طبق الانتعاش بإضافة 25 مل E2 + GS إلى 100 ملم ديس بيتريح.
- إعداد مشرط عن طريق تسجيل ثلاث مسحات معا. وهذه تشكل أداة الثلاثي مع ثلاثة أخاديد.
- شن micropipette أعدت على مسحات عن طريق تسجيل ذلك في واحدة من الأخاديد.
- إذا إعادة استخدام بال micropipettes، دافق حتى واضح مع E2 + GS باستخدام حقنة 1ML و27 G إبرة قبل المتزايدة على مسحات.
4. جراحة
- تخدير 1 لوحة من اليرقات في كل مرة (25 الأسماك) مع تريكين. يتم تخدير الأسماك بما فيه الكفاية عندما لم يعد يحمل استجابة اللمس. من المهم أن الأسماك هي تخدير تماما قبل الجراحة، وإلا فإنها سوف نشل عندما مشرط مسها. يتم إجراء الجراحة تحت المجهر تشريح.
- نقل اليرقات لوحة الجراحة.
- تحت الأقصى التكبير، وتناوب يرقة واحدة في وقت واحد بحيث انها تقع على جانبها مع عودتها الأقرب إلى يد تمسك مشرط.
- موقف ملقط بحيث ترتكز على Sylgard،الزاوية أكثر من عرض من اليرقة.
- تستعد مشرط الزجاج ضد واحدة من الأسلحة من ملقط، وقطع في الوجه الظهري الجانبي لليرقة على مستوى المسام الشرج، ويجري التأكد من عدم قطع ما وراء حافة بطني من الحبل الظهري. تحريف مشرط لقطع الحبل الشوكي.
- كرر مع اليرقات المتبقية.
ملاحظة: إذا ينزف يرقة، فإنه لن يتعافى من عملية جراحية. على الفور إزالة اليرقة من لوحة الجراحة والموت ببطء ذلك عبر تريكين جرعة زائدة.
- مرة واحدة لعملية جراحية على دفعة من اليرقات كاملة، ونقل الجرحى الحيوانات لوحة الانتعاش. هذا هو لدعم تبادل المعلومات من التخدير.
- تحذير: عند جمع اليرقات لنقل المصابين، تأكد من أنها جمعت الرأس أو الذيل الأول: لا تشدد على موقع الإصابة عن طريق الانحناء اليرقات.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدامها جميع الأجهزة المستخدمة لإجراء عملية جراحية، بما في ذلك بال micropipettes.
- تحذير: عند جمع اليرقات لنقل المصابين، تأكد من أنها جمعت الرأس أو الذيل الأول: لا تشدد على موقع الإصابة عن طريق الانحناء اليرقات.
5. استعادة
- آرأصيب ansfer اليرقات من لوحة الاسترداد إلى 100 ملم لوحات مليئة 25 مل E2 + GS في كثافة 25/plate. السماح لاسترداد في حاضنة 28.5 درجة مئوية.
- تحقق لوحات اليومية، وإزالة الحيوانات المريضة والنافقة. لا تتغير وسائل الإعلام حتى Coleps (البروتوزوا المياه العذبة) واضحة في وسائل الإعلام. عند تغيير وسائل الإعلام، لا نقل الأسماك إلى لوحة جديدة؛ بدلا من ذلك، إزالة وسائل الإعلام قدر الإمكان والفيضانات نفس اللوحة مع وسائل الإعلام الجديدة. كرر حسب الضرورة للحد من السكان Coleps.
- تغذية يومية مع كمية صغيرة من مسحوق يرقات الغذاء.
ملاحظة: الغذاء لايف (على سبيل المثال، أو باراميسيا الروتيفر) لا يمكن تغذية اليرقات على المصاب إلا بعد أن تعافى الحركة. خلاف ذلك، فإن الأغذية الحية استعمار موقع الإصابة وتقتل اليرقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للحد من شدة تلف الأنسجة المحيطة بموقع الإصابة، الميلا السليم من micropipette أمر بالغ الأهمية. ويبين الشكل 1A تلميح مشطوف بشكل صحيح. باستخدام تلميح بأن واسعة جدا (1B الشكل) يميل إلى نتيجة في عدد القتلى أعلى نظرا لاحتمال زيادة الخدش الأبهر الظهري، في حين أن الطرف الذي هو ضيق جدا (الشكل 1C) يميل إلى وهلة قبالة الجلد بدلا من قطع الأنسجة.
لممارسة هذه التقنية، فإنه من المفيد استخدام خط مراسل مثل تيراغرام (elevl3: EGFP) knu3 لتصور الحبل الشوكي ويبين الشكل 2A الحبل الشوكي مقطوع تماما من العيش تيراغرام (elevl3: EGFP). الزرد في 1 نقطة في البوصة، . في حين يبين الشكل 2B نفس الأسماك الحية في 3dpi أرقام 2C و 2D تظهر تكبير أعلى من موقع الإصابة في 3 نقطة في البوصة في تيراغرام الثابتة (dbx1a: EGFP) الأسماك وجود التعاونmplete (الشكل 2C) أو غير كاملة (الشكل 2D) transection الحبل الشوكي. لاحظ المنطقة متجاورة من الخلايا العصبية وضع العلامات على طول حافة بطني من الحبل الشوكي (السهم الأصفر).
الشكل 1. مقارنة بين حواف مشرط. يظهر تلميح micropipette مشطوف بشكل صحيح ومناسبة لعملية جراحية. يتم تنظيف هذا الحجم بسهولة لإعادة استخدامها. باء يظهر تلميح micropipette مشطوف واسعة جدا لإجراء عملية جراحية على يرقة 5 DPF. C هو مثال على تلميح بأن ضيق جدا. هذا الحجم من الصعب جدا لتنظيف لإعادة استخدامها، ويميل إلى تعزيز العمل نشر من transection بدلا من القطع D:. الكرتون من التجمع أداة lesioning. يتم تداخل ثلاث مسحات 6 "في السنة التحضيريةramidal الشكل وسجلت معا. تقع مشرط في واحدة من الأخاديد التي شكلتها ثلاثة مسحات، وغير مسجلة في المكان.
وقد استخدم الرقم 2 التحقق من transection كاملة متحد البؤر المجهري نيون لصورة حية تيراغرام (elavl3: EGFP). الأسماك في الجسم الحي في 1 نقطة في البوصة (A) و3dpi (B). لتأكيد transection كاملة، وهذه المداخن الصورة ثم تم معالجتها في ImageJ (rsbweb.nih.gov) لتوليد التوقعات الكثافة القصوى (MaxZ) كما هو مبين في A - B C - D التوقعات تظهر MaxZ من HUC / D المسمى تيراغرام (dbx1a.: EGFP) السمك في 3 نقطة في البوصة مع transection الشوكي كاملة (C) أو transection ناقصة (D).الأسهم الصفراء تحديد موقع الإصابة، D = الظهرية، R = منقاري. مقياس شريط = 100 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عندما تعلم هذه التقنية في البداية، ونحن نوصي محاولة لا أكثر من 50-100 transections في جلسة واحدة. بعد اتقان هذه التقنية، ونحن قادرون على القطع يصل إلى 300 الأجنة في ساعة؛ ومع ذلك، فإن هذا المستوى من الإنتاجية يتطلب بضعة أشهر من الممارسة الأسبوعية. نوصي أيضا ممارسة مع خط مراسل والتحقق من transection كاملة حتى يتم تقليل حدوث ناقصة transection الحبل الشوكي إلى أقل من 1٪.
transection الحبل الشوكي في الزرد الكبار هي تقنية راسخة وقوية لدراسة إعادة نمو الخلايا العصبية ومحور عصبي بعد الاصابة. عن طريق تحريك هذا التحليل في الحي اليرقات، ونحن قادرون على دراسة الانتعاش في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك، ونحن أيضا قادرة على الاستفادة من الأدوات الجينية غير متوفرة في الزرد الكبار لدراسة دور الجينات المختلفة في عملية التجدد، على سبيل المثال، Tcf7l1a 12.
د أصلاeveloped لدراسة الخلايا العصبية التالية transection الحبل الشوكي، وهذه التقنية يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة استعادة وظيفة الحسية: تظهر الحيوانات المصابة استجابة للمس الذيلية إلى موقع الإصابة بنسبة 2 نقطة في البوصة، وعبروا المحاور موقع الإصابة بنسبة 5 نقطة في البوصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نحن مدينون لمرفق جامعة ولاية يوتا الزرد لتربية المواشي. وأيد من قبل المعاهد الوطنية للصحة RID R56NS053897، وكان LKB متدرب دكتوراه مسبقا بدعم من مبادرة HHMI ميد حيز غراد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| Disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| Cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1 ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 G needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20 °C |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1 L); store at RT | |||
| 17.5 g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90 g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90 g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41 g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12 g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra | |||
| 0.35 g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1 L); store at RT | |||
| 50 ml 20x E2 | |||
| 2 ml fresh 500x NaCO3 | |||
References
- Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
- Mikami, Y., et al. Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery. Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).
- Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).
- Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).
- Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).
- Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).
- Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish. The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish. PloS one. 7 (2), (2012).
- Kim, C. H., et al. Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation. Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).
