在斑马鱼幼虫脊髓横断

Summary

脊髓横断后，成年斑马鱼具有功能恢复六个周后，损伤。要利用幼虫的透明度，恢复快的，我们提出了横断幼虫脊髓的方法。横断后，我们通过后3天观察伤感觉恢复在开始后2天伤，和C-弯曲运动。

Abstract

脊髓损伤是由于缺乏低于损伤水平轴突再生，以及为无法重新开始脊髓神经发生下列哺乳动物失败的感觉和运动恢复。然而，一些anamniotes包括即使在脊髓完全切断了斑马鱼表现出感觉和功能恢复。成年斑马鱼是一个既定的模式生物再生研究脊髓损伤后，用感觉和运动恢复6周后受伤。要利用体内分析的再生过程中的透明斑马鱼幼虫可用以及遗传工具的成人无法访问，我们用斑马鱼幼虫脊髓横断后，研究再生。在这里，我们展示了一种可重复和可核查的横切幼虫脊髓。横断后，我们的数据表明感觉恢复在开始后2天伤（DPI），机智h时的C-弯曲运动检测的3 DPI和恢复自由游泳5 DPI的。因此，我们提出了斑马鱼幼虫作为一个配套工具的成年斑马鱼来进行恢复脊髓损伤后的研究。

Introduction

重大创伤人类脊髓常常导致永久性瘫痪和下面损伤水平感觉丧失，由于无法再生的轴突或重新开始神经发生^1,2。相反，哺乳动物，但是，anamniotes包括蝾螈和斑马鱼（ 斑马鱼 ），即使完全脊髓横断^3,4展现强劲复苏。

成年斑马鱼是一种行之有效的模式，研究恢复过程脊髓损伤^5-7。下面的完整脊髓横断，感觉和机车功能重建是在成年斑马鱼6周后，受伤⁸观察。为了检查体内的再生过程中，我们转向透明斑马鱼幼鱼^9。

在这里，我们提出了一个方法来样带5天后受精（DPF）的斑马鱼幼虫USI脊髓纳克斜面显微注射移液管的手术刀，从哈特改性等人 ¹⁰此方法支持高吞吐量，低死亡率，和可再现性。通过练习，幼虫300 /小时，可横切，和6个月以上个断面，其中包括超过3,600动物，98.75％±0.72％存活，直到后7天损伤（DPI）。我们的数据显示感官和运动的快速恢复，以及：1 dpi时，所有的运动者受伤的鱼只由胸鳍运动驱动。然而，幼虫开始响应由2 dpi至钨针尾触摸到横断，重新建立C-弯曲的移动由3 DPI，并通过5 dpi ^11个图显示掠夺游泳。使用抗乙酰化微管蛋白抗体染色，我们已经证实，轴突是从损伤部位在1 dpi的缺席，但拥有5 DPI越过损伤部位。我们相信，该协议将提供宝贵的技术轴突再生和神经在脊髓损伤后的研究。

Protocol

斑马鱼是按照标准程序提出和繁殖;实验已获犹他州实验动物管理和使用委员会的大学。

1，准备手术的板

1. 使手术板块下使用60毫米培养皿和的Sylgard 184有机硅弹性体套件，下列制造商的说明。填写菜不超过半满以上，并允许聚合。店铺覆盖在室温下。

2制备的微量移液器

1. 通过加热和使用作出显微注射针相同的设置拉薄壁硼硅毛细管中微量拉马制造微量。
2. 在解剖镜下，折断微量的尖端直径用钳子约200微米。
3. 锥破碎边缘与microgrinder最初至35°，接着在25℃的第二坡口。确保针尖锋利，SMO超视距。店内完成斜面微量在少量粘土的培养皿中。

斑马鱼幼虫3。准备

1. 前7天手术，成立了男性和女性的斑马鱼的交配坦克。
2. 收集胚胎第二天早上，3小时后，指示灯会亮起，以确保最大收益。如果使用的是转基因记者一行如玻璃转化温度^{（elevl3：EGFP）knu3，}排序受精胚胎100/100毫米的钢板在25毫升的E3在28.5°C。如果使用野生型，排序在28.5℃，受精胚胎25/100毫米的钢板在25毫升的E3
3. 如果使用的是记者一行，筛选胚胎的荧光表达在48 HPF。允许鉴定胚胎在25/100毫米的钢板的密度成熟在25毫升的E3在28.5°C。
4. 当幼虫在5 DPF，覆盖的Sylgard与E2 + 10 mg / L的硫酸庆大霉素（GS）+三卡因准备手术板块。
   1. 通过加入25ml E2 + GS到100 mm的Petri显示准备恢复盘小时。
   2. 用胶带在一起3拭子准备手术刀。这将形成有三个凹槽的三角形的工具。
   3. 通过绑扎它到凹槽中的一个安装在该拭子一个微量制备。
5. 如果重复使用微量，冲洗至干净为止与E2 + GS用1ml注射器和27号针头安装在拭子之前。

4。手术

1. 麻醉1盘幼体的时间（25鱼）与三卡因。鱼被充分麻醉，当他们不再表现出触摸响应。重要的是鱼完全手术前麻醉，否则当手术刀触及他们，他们会抽搐。解剖显微镜下进行手术。
2. 幼虫转移手术板块。
   1. 在最大放大倍率，旋转一个幼虫的时间，以便它是否位于其侧背面最接近手拿着手术刀。
   2. 位置钳，使他们安息在的Sylgard，角度对幼虫的宽度。
   3. 支撑对钳子的臂中的一个的玻璃手术刀，在肛门孔的水平切入幼虫的背侧侧面，即一定不要切断超出脊索的腹边缘。扭动手术刀切断脊髓。
   4. 重复剩余的幼虫。
      注意：如果一个幼虫渗出，也不会从手术中恢复。立即从手术取出钢板的幼虫，并通过三卡因过量安乐死吧。
3. 一旦完成手术对一批幼虫，转移受伤的动物恢复盘。这是为了支持麻醉结算。
   1. 注意：收集受伤幼虫转移时，请务必将其收集头部或尾部第一：不要通过弯曲应力幼虫损伤部位。
      注意：用于外科手术的所有装置可以重复使用，包括微量。

5。恢复

1. 风帆ansfer受伤幼虫从恢复盘到100mm板在25/plate的密度填充25毫升E2 + GS。允许在28.5℃培养箱中恢复。
2. 检查板每天，去除病，死动物。不要更改媒体，直到Coleps（淡水原生动物）是在媒体上看到。当改变媒体，请不要将鱼转移到一个新的板块;相反，去除尽可能多的媒体尽可能和洪水同板块新媒体。必要时重复，减少Coleps人口。
3. 每天用少量的粉状鱼苗喂食物。
   注：现场食物（ 如草履虫或轮虫）不能被输送到受伤的幼虫，他们已经恢复运动之后。否则，活食拓殖会损伤部位，并杀死幼虫。

Representative Results

以降低周围的损伤部位的组织损伤的严重程度，微量的适当斜角是至关重要的。 图1A示出一个正确的斜面的尖端。使用尖太宽（ 图1B）往往导致更高的死亡率，由于切口的背主动脉的可能性增加，同时一个提示，太窄（ 图1C）的倾向一目了然从皮肤而不是切割组织。

实施本技术，但有利的是使用一个记者线如玻璃转化温度^{（elevl3：EGFP）knu3}形象化脊髓图2A示出一个活的Tg（elevl3：EGFP）的全横断脊髓 ​​。斑马鱼在1 dpi时， ，而图2B显示了相同的活鱼在3dpi 图2C和2D的3 DPI固定的Tg显示损伤部位的放大倍数较高（dbx1a：EGFP）有共同的鱼mplete（ 图2C）或不完整（ 图2D）脊髓横断。注意沿着脊髓（黄色箭头）的腹缘神经元标签的连续区域。

手术刀沿图1比较。A显示适合手术一个正确的斜面枪头。这个尺寸是容易清洗以便再次使用。 乙示出了斜面微量移液器尖端太宽的手术上的5旦幼虫，C是一个提示，太窄的一个例子。这个大小是很难清洗可重复使用，并倾向于促进横断代替切割锯切动作D：在lesioning工具组件的动画片。 3个6“拭子嵌套成PYramidal形状和录制在一起。手术刀掌握在由3拭子所形成的槽中的一个，并且是录音到位。

。图2验证完整的横断荧光共聚焦显微镜被用来对图像进行实时的Tg（elavl3：EGFP）鱼体内在1 DPI（A）和3dpi（B）。确认完全横断，这些图像堆栈是在ImageJ的再加工（rsbweb.nih.gov）产生最大强度投影（MaxZ），如图A - B C - HUC / D的D显示MaxZ预测标记的Tg（dbx1a。： EGFP）在3 dpi的完全性横断（C）或不完全离断（D）的鱼。黄色箭头标识损伤部位，D =背，R =喙。比例尺= 100微米。

Discussion

当最初学习这个技术，我们建议尝试在单个会话不超过50-100个断面。掌握这一技术后，我们能够横切高达每300小时的胚胎;然而，吞吐量这个级别需要每周练习了几个月。我们还建议实行带记者一行和验证完整的横断直到不完全性脊髓横断伤的发生率降低到1％以下。

在成年斑马鱼脊髓横断是一个行之有效的和强大的技术研究轴突再生和神经损伤后。通过将这种分析成幼虫生物，我们能够检查恢复体内 。此外，我们还可以利用在成年斑马鱼不可用遗传工具来检查各种基因的作用在再生过程中， 如Tcf7l1a ^12。

本来ðeveloped研究神经发生以下脊髓横断，这种技术也可用于检查恢复感觉功能：受伤的动物表现出反应由2 dpi的接触尾椎到损伤部位，和轴突已经由5 dpi的越过损伤部位。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dish	VWR	82050-544
100 mm Petri dish	VWR	89038-968
PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388
borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Forceps	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Disssection microscope	Nikon	SMZ6454
Microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Cotton tipped applicator, wood, 6-inch	Fisher Scientific	23-400-101
1 ml syringe	BD	309625
27 G needle	BD	305109
Fry food	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	store at -20 °C
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Box Filament FB330B
20x E2 (1 L); store at RT
17.5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90 g CaCl2·2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 g MgSO4·7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra
0.35 g NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); store at RT
50 ml 20x E2
2 ml fresh 500x NaCO3