Spinal Cord transection i larvestadiet zebrafisk

Summary

Efter spinal transection, voksne zebrafisk har funktionelle opsving seks uger efter skaden. At drage fordel af larvernes gennemsigtighed og hurtigere helbredelse, præsenterer vi en metode til transecting larve rygmarven. Efter transektion, observere vi sensorisk opsving begynder ved 2 dage efter skade, og C-bøjning bevægelse ved 3 dage efter skaden.

Abstract

Pattedyr mislykkes i sensoriske og motoriske restitution efter rygmarvsskade på grund af manglende axonal genvækst under niveauet for skade samt en manglende evne til reinitiere spinal neurogenesis. Men nogle anamniotes herunder zebrafisk Danio rerio udviser både sensoriske og funktionel genopretning, selv efter fuldstændig transection af rygmarven. Den voksne zebrafisk er en etableret model organisme for at studere regeneration efter rygmarvsskade, med sensoriske og motoriske inddrivelse ved 6 uger efter skaden. At drage fordel af in vivo analyse af den regenerative proces til rådighed i gennemsigtig larve zebrafisk samt genetiske værktøjer ikke tilgængelig i den voksne bruger vi larve zebrafisk at studere regenereringen efter rygmarv transection. Her demonstrerer vi en metode til reproducerbar og verificerbar transecting larve rygmarven. Efter transektion, vores data viser, sensoriske recovery begyndelsen på 2 dage efter skaden (dpi), with C-bøjning bevægelse påvises ved 3 dpi og genoptagelse af fri svømning med 5 dpi. Således foreslår vi larve zebrafisk som en følgesvend værktøj til den voksne zebrafisk for studiet af restitution efter rygmarvsskade.

Introduction

Større traumer til human rygmarv resulterer ofte i permanent lammelse og tab af følelse under niveauet for skade på grund af den manglende evne til at gro axoner eller reinitiere neurogenese ^1,2. I modsætning til pattedyr dog anamniotes herunder salamandre og zebrafisk (Danio rerio) viser robust opsving, selv efter fuldstændig rygmarv transection ^3,4.

Den voksne zebrafisk er en veletableret model for at studere helbredelsesprocessen efter rygmarvsskade ^5-7. Efter komplet rygmarv transektion observeres reetablering af sensoriske og lokomotiv funktion i den voksne zebrafisk med 6 uger efter skaden ^8. For at undersøge den regenerative proces in vivo, vi henvendte os til den gennemsigtige larve zebrafisk ^9.

Her præsenterer vi en metode til at transektere rygmarven af ​​en 5 dage efter befrugtning (DPF) larve zebrafisk using en skrå mikroinjektion pipette som en skalpel, modificeret fra Bhatt, et al. ^10. Denne metode understøtter høj kapacitet, lav dødelighed, og reproducerbarhed. Med praksis, kan 300 larver / h transected, og over 6 måneders transections, herunder mere end 3.600 dyr, 98,75% ± 0,72% overlevet indtil 7 dage efter skaden (dpi). Vores data viser hurtig genopretning af sensoriske og bevægelse samt: ved 1 dpi, bliver alle bevægelser af den forurettede fisk drevet af kun brystfinne bevægelse. , Larver begynder imidlertid at reagere på wolfram nål røre caudale til transektion med 2 dpi, genetablere C-bøjning bevægelse med 3 dpi, og vise aggressiv svømning med 5 dpi ^11. Brug antistoffarvning mod acetyleret tubulin, har vi bekræftet, at axoner er fraværende fra skaden site ved 1 dpi, men har krydset skaden site med 5 dpi. Vi mener, at denne protokol vil give en værdifuld teknik til studiet af axonal genvækst og neurogenese i rygmarven efter skade.

Protocol

Zebrafisk er blevet rejst og opdrættet ifølge standardprocedurer; eksperimenter blev godkendt af University of Utah Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1.. Udarbejdelse af Kirurgi Plates

1. Gør kirurgi plader ved hjælp 60 mm petriskåle og Sylgard 184 Silikone Elastomer Kit, efter producentens anvisninger. Fyld retter ikke mere end halvt fyldt, og tillade at polymerisere. Opbevares dækket ved stuetemperatur.

2. Fremstilling af Mikropipetter

1. Fabrikere mikropipetter ved opvarmning og trække tyndvægget borosilicat kapillarrør i en mikropipette aftrækker med de samme indstillinger for at gøre mikroinjektion nåle.
2. Under en dissektion mikroskop, bræk spidsen af ​​mikropipette til ca 200 um i diameter med en pincet.
3. Bevel brudt kant med en microgrinder indledningsvis til 35 ° C, efterfulgt af en anden facet ved 25 °. Sørg tip er skarp og SMOOTH. Store færdig skrå mikropipette i en petriskål på en lille mængde af ler.

3.. Fremstilling af zebrafisk Larver

1. 7 dage før operationen, oprettet parring tanke af mandlige og kvindelige zebrafisk.
2. Saml embryoner den følgende morgen, 3 timer efter lyser, for at sikre maksimal udbytte. Hvis du bruger en transgen reporter linje såsom Tg (elevl3: eGFP) ^knu3, sortere befrugtede æg 100/100 mm plade i 25 ml E3 ved 28,5 ° C. Hvis du bruger vildtype, sortere befrugtede embryoner 25/100-mm plade i 25 ml E3 ved 28,5 ° C.
3. Hvis du bruger en reporter linje, screene fostre for fluorescerende udtryk ved 48 HPF. Tillad identificerede embryoner til at modne ved en densitet på 25/100-mm plade i 25 ml E3 ved 28,5 ° C.
4. Når larverne er 5 dpf, forberede kirurgi plade ved at dække Sylgard med E2 + 10 mg / L gentamycinsulfat (GS) + tricaine.
   1. Forbered inddrivelse fad ved at tilsætte 25 ml E2 + GS til en 100 mm Petri distime.
   2. Forbered skalpel ved at tape sammen tre podninger. Dette vil danne et trekantet værktøj med tre riller.
   3. Monter en forberedt mikropipette på podninger ved at tape den ind i en af ​​rillerne.
5. Hvis du skal bruge mikropipetter skylles indtil klar med E2 + GS ved hjælp af en 1 ml sprøjte og en 27 G kanyle før montering på podninger.

4.. Kirurgi

1. Bedøver 1 plade af larver på et tidspunkt (25 fisk) med tricaine. Fisk er tilstrækkeligt bedøvet, når de ikke længere udviser anslagsfølsomhed. Det er vigtigt, at fisk er fuldstændig bedøvet før operationen, ellers vil de spjæt når skalpellen rører dem. Kirurgi udføres under en dissektion mikroskop.
2. Overførsel larver kirurgi plade.
   1. Under maksimal forstørrelse, rotere en larve på et tidspunkt, så den ligger på siden med ryggen nærmest hånd, der holder skalpel.
   2. Position tang, så de hviler på Sylgard,vinklet i hele bredden af ​​larve.
   3. Afstivning glasset skalpel mod en af ​​armene på tangen, skåret i den dorsale sideflade larve på niveau med den anale pore, være sikker på ikke at skære over den ventrale kant rygstrengen. Drej skalpellen at afskære rygmarven.
   4. Gentag med resterende larver.
      Bemærk: Hvis en larve bløder, vil det ikke komme fra operationen. Fjern omgående larve fra operationen pladen og aflive det via tricaine overdosis.
3. Når kirurgi på det parti larver er færdig, overførsel tilskadekomne dyr til inddrivelse pladen. Dette er at støtte rydningen af ​​anæstesi.
   1. Advarsel: ved indsamling såret larver til overførsel, sørg for at de indsamles hoved eller hale først: ikke stress skaden site ved at bøje larver.
      Bemærk: Alle anordninger, der anvendes til kirurgi kan genbruges, herunder mikropipetter.

5.. Inddrivelse

1. Transfer sårede larver fra inddrivelse plade til 100 mm plader fyldt med 25 ml E2 + GS med en tæthed på 25/plate. Tillad at inddrive i en 28,5 ° C inkubator.
2. Tjek plader dagligt, fjerne syge og døde dyr. Du må ikke ændre mediet indtil Coleps (ferskvand protozoer) er synlige i medierne. Når du ændrer medierne, ikke overfører fisk til en ny plade; i stedet, fjerne så meget medier som muligt og oversvømme den samme plade med nye medier. Gentag som nødvendigt for at mindske Coleps befolkning.
3. Feed dagligt med en lille mængde af pulveriseret yngel fødevarer.
   Bemærk: Levende mad (f.eks paramecia eller hjuldyr), kan ikke gives til tilskadekomne larver, før de har genvundet bevægelse. Ellers vil den levende foder kolonisere skaden site og dræbe larverne.

Representative Results

For at reducere alvoren af vævsbeskadigelse omkring skaden site, korrekt beveling mikropipetten er kritisk. Figur 1A viser en korrekt affaset spids. Ved hjælp af et tip, der er for bred (figur 1B) har tendens til at resultere i højere dødsfald på grund af den øgede sandsynlighed for nicking dorsale aorta, mens et tip, der er for snæver (figur 1C) har tendens til blik væk fra huden snarere end at skære væv.

At praktisere denne teknik, er det fordelagtigt at anvende et reporter linje såsom Tg (elevl3: eGFP) ^knu3 at visualisere rygmarven Figur 2A viser en helt gennemskåret rygmarv af en levende Tg (elevl3: eGFP). Zebrafisk ved 1 dpi, . mens Figur 2B viser den samme levende fisk på 3dpi Figurerne 2C og 2D viser højere forstørrelser af skaden site ved 3 dpi i fast Tg (dbx1a: eGFP) fisk, der har samarbejdetmplete (Figur 2C) eller ufuldstændig (figur 2D) rygmarv transection. Bemærk den sammenhængende region neuron mærkning langs den ventrale kant af rygmarven (gul pil).

Fig. 1. Sammenligning af skalpel kanter. A viser en korrekt skrå mikropipettespids egnet til kirurgi. Denne størrelse er let rengøres til genbrug. B viser en skrå mikropipettespids for bred til operation på en 5 dpf larve. C er et eksempel på en spids, der er for snæver. Denne størrelse er meget vanskeligt at rengøre for genbrug, og har tendens til at fremme en savning virkning af overskæring i stedet for skæring D:. Tegneserie af lesioning værktøjssamling. Tre 6 "podninger er indlejret i en pyramidal form og tapede sammen. Skalpellen hviler i en af ​​rillerne, der er dannet af de tre podninger og tapede på plads.

.. Figur 2. Kontrol fuldstændig overskæring Fluorescerende konfokal mikroskopi blev anvendt til at afbilde levende Tg (elavl3: eGFP) fisk in vivo ved 1 dpi (A) og 3dpi (B). For at bekræfte fuldstændig transektion, blev disse billedstakke behandles derefter i ImageJ (rsbweb.nih.gov) til at generere maksimal intensitet Fremskrivninger (MaxZ) som vist i A - B C - D show MaxZ fremskrivninger af HUC / D mærket Tg (dbx1a.: eGFP) fisk på 3 dpi med komplet spinal transection (C) eller ufuldstændig transection (D).Gule pile identificere skade site, D = ryg-, R = rostral. Målestok = 100 um.

Discussion

Ved første lære denne teknik, anbefaler vi forsøger ikke mere end 50-100 transections i en enkelt session. Efter mastering denne teknik, er vi i stand til at transektere op til 300 embryoner pr time; Men dette niveau af gennemløb kræver et par måneder af ugentlige praksis. Vi anbefaler også øve med en reporter linje og kontrollere fuldstændig overskæring indtil forekomsten af ​​ufuldstændig rygmarv overskæring reduceres til mindre end 1%.

Rygmarv transection i den voksne zebrafisk er en veletableret og robust teknik til at studere axonal genvækst og neurogenese efter skade. Ved at flytte denne analyse i den larve organisme, vi er i stand til at undersøge bedring in vivo. Derudover er vi også i stand til at udnytte genetiske værktøjer ikke er tilgængelige i den voksne zebrafisk at undersøge roller forskellige gener i den regenerative proces, f.eks Tcf7l1a ^12.

Oprindeligt developed at studere neurogenesis efter rygmarv transektion kan denne teknik også bruges til at undersøge inddrivelse af sensorisk funktion: tilskadekomne dyr viser en reaktion at røre kaudal til skaden site med 2 dpi, og axoner har krydset skaden site med 5 dpi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dish	VWR	82050-544
100 mm Petri dish	VWR	89038-968
PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388
borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Forceps	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Disssection microscope	Nikon	SMZ6454
Microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Cotton tipped applicator, wood, 6-inch	Fisher Scientific	23-400-101
1 ml syringe	BD	309625
27 G needle	BD	305109
Fry food	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	store at -20 °C
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Box Filament FB330B
20x E2 (1 L); store at RT
17.5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90 g CaCl2·2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 g MgSO4·7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra
0.35 g NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); store at RT
50 ml 20x E2
2 ml fresh 500x NaCO3