Summary
Después de la transección de la médula, el pez cebra adulto tenga la recuperación funcional a las seis semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas de la transparencia de las larvas y una recuperación más rápida, se presenta un método para seccionar la médula espinal de las larvas. Después de transección, se observa la recuperación sensorial a partir de los 2 días después de la lesión, y el movimiento C-doble por 3 días después de la lesión.
Abstract
Mamíferos fallan en la recuperación sensorial y motora después de una lesión de la médula espinal debido a la falta de regeneración axonal por debajo del nivel de la lesión, así como una incapacidad para reiniciar la neurogénesis médula. Sin embargo, algunos anamniotes incluyendo el pez cebra exposición Danio rerio tanto sensorial y la recuperación funcional, incluso después de la transección completa de la médula espinal. El pez cebra adulto es un organismo modelo establecido para el estudio de la regeneración después de una lesión de la médula espinal, con la recuperación motora y sensitiva a las 6 semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas del análisis in vivo del proceso regenerativo disponible en la larvas de pez cebra transparente, así como herramientas genéticas no son accesibles en el adulto, usamos la larvas de pez cebra para estudiar la regeneración después del corte transversal de la médula espinal. Aquí se demuestra un método para reproducible y verificable transección de la médula espinal de las larvas. Después de transección, nuestros datos muestran principio de recuperación sensorial a los 2 días después de la lesión (ppp), ingenioh del movimiento C-bend detectable por 3 dpi y la reanudación de la natación libre por 5 dpi. Por lo tanto se propone la larvas de pez cebra como una herramienta complementaria para el pez cebra adulto para el estudio de la recuperación después de una lesión de la médula espinal.
Introduction
Mayor trauma en la médula espinal humana a menudo resulta en la parálisis permanente y pérdida de la sensación por debajo del nivel de la lesión, debido a la incapacidad para volver a crecer los axones o reiniciar la neurogénesis 1,2. A diferencia de los mamíferos, sin embargo, anamniotes incluyendo salamandras y el pez cebra (Danio rerio) muestran recuperación robusta, incluso después de la sección completa de la médula espinal 3,4.
El pez cebra adultos es un modelo bien establecido para estudiar el proceso de recuperación tras la lesión de la médula espinal 5-7. Después de la transección completa de la médula espinal, restablecimiento de la función sensorial y la locomotora se observa en el pez cebra adultos por 6 semanas después de la lesión 8. Con el fin de examinar el proceso de regeneración in vivo, recurrimos a la larvas de pez cebra transparente 9.
Aquí presentamos un método para seccionar la médula espinal de un 5 días después de la fertilización (dpf) larval usi pez cebrang de una pipeta de microinyección biselado como un bisturí, modificado a partir de Bhatt, et al. 10 Este método es compatible con alto rendimiento, baja mortalidad, y la reproducibilidad. Con la práctica, 300 larvas / hr puede secciona, y más de 6 meses de cortes transversales, incluyendo más de 3.600 animales, 98,75% ± 0,72% sobrevivió hasta 7 días después de la lesión (dpi). Nuestros datos muestran una rápida recuperación de la locomoción y sensorial, así: al 1 dpi, todos los movimientos de los peces heridos es impulsado por pectoral sólo locomoción aleta. Sin embargo, las larvas comienzan a responder al tungsteno aguja toque caudal a la transección por 2 dpi, restablecer el movimiento C-doble por 3 dpi, y mostrar la natación predatorias de 5 11 dpi. El uso de la tinción de anticuerpos contra la tubulina acetilada, hemos confirmado que los axones están ausentes en el sitio de la lesión en 1 dpi, pero hemos cruzado el sitio de la lesión por 5 dpi. Creemos que este protocolo proporcionará una técnica valiosa para el estudio de la regeneración axonal y la neurogénesis en la médula espinal después de una lesión.
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Protocol
El pez cebra fueron criados y criados según procedimientos estándar; experimentos fueron aprobados por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Utah.
1. Preparación de las placas Cirugía
- Hacer platos de cirugía usando 60 mm placas de Petri y Sylgard 184 Kit de caucho silicona, siguiendo las instrucciones del fabricante. Llenar los platos no más que medio lleno y deje que se polimeriza. Tienda cubierto a temperatura ambiente.
2. Preparación de Micropipetas
- Fabrique micropipetas calentando y tirando de pared delgada tubos capilares de borosilicato en un extractor de micropipeta con la misma configuración para la toma de las agujas de microinyección.
- Bajo un microscopio de disección, romper la punta de la micropipeta a aproximadamente 200 m de diámetro con pinzas.
- Bisel borde roto con un microgrinder inicialmente a 35 °, seguido de un segundo biselado a 25 °. Asegúrese de punta está afilada y smooth. Tienda finalizó micropipeta biselada en una placa de Petri en una pequeña cantidad de arcilla.
3. Preparación de Pez cebra larvas
- 7 días antes de la cirugía, crearon tanques de apareamiento de los peces cebra macho y hembra.
- Recoger los embriones a la mañana siguiente, 3 horas después de que las luces se encienden para garantizar el máximo rendimiento. Si utiliza una línea reportero transgénicos como Tg (elevl3: eGFP) knu3, los embriones fertilizados tipo 100/100 mm de placa en 25 ml de E3 a 28,5 ° C. Si se utiliza de tipo salvaje, especie fertilizado embriones placa 25/100 mm en 25 ml de E3 a 28,5 ° C.
- Si se utiliza una línea de reportero, cribar embriones para la expresión fluorescente a las 48 HPF. Permitir embriones identificados maduren a una densidad de placa 25/100 mm en 25 ml de E3 a 28,5 ° C.
- Cuando las larvas son 5 dpf, preparar la placa de la cirugía, cubriendo Sylgard con E2 + 10 mg / L de sulfato de gentamicina (GS) + tricaína.
- Preparar el plato de recuperación mediante la adición de 25 ml de E2 + GS a unos 100 mm dis Petrih.
- Preparar bisturí grabando juntos tres hisopos. Esto formará una herramienta triangular con tres ranuras.
- Montar una micropipeta preparado sobre los hisopos con cinta adhesiva en uno de los surcos.
- Si vuelve a utilizar micropipetas, enjuague hasta que se aclare con E2 + GS con una jeringa de 1 ml y una aguja de 27 G antes de montar en hisopos.
4. Cirugía
- Anestesie 1 plato de larvas en un momento (25 peces) con tricaína. Los peces son suficientemente anestesiado cuando ya no muestran respuesta al toque. Es importante que los peces están completamente anestesiados antes de la cirugía, de lo contrario se contracción cuando el bisturí los toca. La cirugía se realiza bajo un microscopio de disección.
- Transfiera las larvas a la placa de la cirugía.
- Bajo un aumento máximo, girar una larva en un momento de forma que quede en su lado con la espalda lo más cerca de la mano que sostiene el bisturí.
- Posición fórceps, para que estén sobre el Sylgard,ángulo recto sobre la anchura de la larva.
- Refuerzo El escalpelo de vidrio contra una de las ramas de la pinza, cortado en la cara lateral dorsal de la larva a nivel del poro anal, asegurándose de no cortar más allá del borde ventral de la notocorda. Gire el bisturí para cortar la médula espinal.
- Repita con larvas restante.
Nota: si una larva sangra, no va a recuperarse de la cirugía. Quitarse de inmediato la larva de la placa de la cirugía y practicar la eutanasia a través de la sobredosis tricaína.
- Una vez que la cirugía en el lote de larvas es completa, la transferencia de los animales lesionado a la placa de recuperación. Esto es para apoyar la limpieza de la anestesia.
- Precaución: al recoger larvas heridos para la transferencia, asegúrese de que se recojan ni pies ni cabeza primero: no insistir en la zona de la lesión, doblando las larvas.
Nota: Todos los dispositivos que se utilizan para la cirugía pueden ser reutilizados, incluyendo las micropipetas.
- Precaución: al recoger larvas heridos para la transferencia, asegúrese de que se recojan ni pies ni cabeza primero: no insistir en la zona de la lesión, doblando las larvas.
5. Recuperación
- Transfer lesionado larvas de la placa de recuperación a placas de 100 mm rellenas con 25 ml de E2 + GS a una densidad de 25/plato. Permitir a recuperarse en una incubadora de 28.5 ° C.
- Compruebe placas diaria, eliminando los animales enfermos y muertos. No cambie los medios hasta Coleps (protozoos de agua dulce) son visibles en los medios de comunicación. Al cambiar los medios de comunicación, no transfiera el pescado a una nueva placa; en su lugar, eliminar la mayor cantidad posible de medios y la inundación de la misma placa con los nuevos medios. Repita según sea necesario para reducir la población Coleps.
- Diario de alimento con una pequeña cantidad de freír los alimentos en polvo.
Nota: El alimento vivo (por ejemplo, los paramecios o rotíferos) no se pueden alimentar a las larvas lesionada hasta después de que se haya recuperado la locomoción. De lo contrario, la comida en vivo será colonizar el lugar de la lesión y matar a las larvas.
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Representative Results
Para reducir la gravedad de los daños en los tejidos que rodean el sitio de la lesión, biselado adecuado de la micropipeta es crítica. Figura 1A muestra una punta biselada correctamente. Utilizando una punta que es demasiado amplia (Figura 1B) tiende a provocar víctimas más altas debido a la mayor probabilidad de mellar la aorta dorsal, mientras que el dato de que es demasiado estrecha (Figura 1C) tiende a mirar fuera de la piel en lugar de cortar tejido.
Para practicar esta técnica, es ventajoso utilizar una línea indicadora tal como Tg (elevl3: eGFP) knu3 para visualizar la médula espinal Figura 2A muestra una médula espinal completamente seccionado de un Tg (elevl3: EGFP) en vivo. Pez cebra en el 1 dpi, . mientras que la Figura 2B muestra el mismo pez vivo en 3dpi Figuras 2C y 2D muestran aumentos superiores de la zona de la lesión a las 3 ppp en Tg fijo (dbx1a: eGFP) peces que tiene complete (Figura 2C) o incompleta (Figura 2D) transección de la médula espinal. Nota la región contigua de etiquetado de la neurona a lo largo del borde ventral de la médula espinal (flecha amarilla).
Figura 1. Comparación de los bordes de bisturí. A muestra una punta de micropipeta biselado correctamente aptos para la cirugía. Este tamaño se limpia fácilmente para su reutilización. B muestra una punta de micropipeta biselado demasiado ancho para la cirugía en una larva 5 dpf. C es un ejemplo de una punta que es demasiado estrecho. Este tamaño es muy difícil de limpiar para su reutilización, y tiende a promover una acción de aserrado de la transección del lugar de corte D:. Dibujos animados del conjunto de herramienta lesioning. Tres esponjas 6 "se anidan en un pyramidal forma y pegadas con cinta adhesiva. El escalpelo descansa en una de las ranuras formadas por los tres hisopos, y se asegura en su lugar.
.. Figura 2 Verificación de la transección completa microscopía confocal de fluorescencia se utiliza para la imagen Tg vivo (elavl3: EGFP) peces in vivo a 1 dpi (A) y 3dpi (B). Para confirmar la transección completa, estas pilas de imágenes fueron procesadas en ImageJ (rsbweb.nih.gov) para generar proyecciones de intensidad máxima (maxZ) como se muestra en A - B C - D proyecciones muestran maxZ de HuC / D etiquetados Tg (dbx1a.: eGFP) pescado en 3 ppp con transección espinal completa (C) o transección incompleta (D).Las flechas amarillas identifican sitio de la lesión, D = dorsal, R = rostral. Barra de escala = 100 micras.
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Discussion
Cuando se aprende inicialmente esta técnica, se recomienda intentar no más de 50 a 100 transectos en una sola sesión. Después de dominar esta técnica, que son capaces de seccionar hasta 300 embriones por hora; Sin embargo, este nivel de rendimiento requiere de unos meses de práctica semanal. También se recomienda la práctica con un reportero línea y la verificación de la transección completa hasta la incidencia de la transección de la médula espinal incompleta se reduce a menos de 1%.
Transección de la médula espinal en el pez cebra adulto es una técnica bien establecida y sólida para el estudio de regeneración axonal y la neurogénesis después de la lesión. Moviendo este análisis en el organismo de las larvas, que son capaces de examinar la recuperación in vivo. Además, también somos capaces de utilizar herramientas genéticas que no están disponibles en el pez cebra adulto para examinar el papel de los diferentes genes en el proceso de regeneración, por ejemplo, Tcf7l1a 12.
Originalmente developed para estudiar la neurogénesis tras la transección de la médula espinal, esta técnica también puede usarse para examinar la recuperación de la función sensorial: los animales heridos muestran una respuesta al tacto caudal al sitio de la lesión por 2 dpi, y los axones han atravesado el sitio de la lesión por 5 dpi.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos en deuda con la instalación de pez cebra de la Universidad de Utah para la cría de animales. RID fue apoyado por el NIH R56NS053897 y LKB era un aprendiz predoctoral con el apoyo de la iniciativa del HHMI Med-Into-Grad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| Disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| Cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1 ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 G needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20 °C |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1 L); store at RT | |||
| 17.5 g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90 g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90 g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41 g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12 g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra | |||
| 0.35 g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1 L); store at RT | |||
| 50 ml 20x E2 | |||
| 2 ml fresh 500x NaCO3 | |||
References
- Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
- Mikami, Y., et al. Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery. Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).
- Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).
- Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).
- Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).
- Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).
- Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish. The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish. PloS one. 7 (2), (2012).
- Kim, C. H., et al. Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation. Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).
