Summary
Spinal Transeksiyon sonra, yetişkin zebrabalıkları altı hafta sonrası yaralanma ile fonksiyonel iyileşme var. Larva şeffaflık ve hızlı iyileşme yararlanmak için, larva omurilik transecting için bir yöntem mevcut. Transeksiyon sonra, 3 gün sonrası yaralanma ile 2 gün sonrası yaralanma başlayan duyusal iyileşme gözlemlemek, ve C-bend hareketi.
Abstract
Memeliler nedeniyle yaralanma seviyesinin altında aksonal yeniden büyüme eksikliği yanı sıra spinal nöron yeniden başlatmak için bir yetersizlik omurilik yaralanması aşağıdaki duyusal ve motor kurtarma başarısız. Ancak, hatta omurilik tam kesilerinden sonra duyusal ve fonksiyonel iyileşme hem Zebrafish Br.rerio sergi olmak üzere bazı anamniotes. Yetişkin zebrabalıkları 6 hafta sonrası yaralanma ile duyusal ve motor iyileşme ile, omurilik yaralanmasının ardından rejenerasyon eğitim için kurulmuş bir model organizmadır. Saydam larva zebrabalıkları mevcut rejeneratif işleminin in vivo analiz avantajı hem de yetişkin genetik araçlar erişilemiyor almak için, omurilik transeksiyonu sonra rejenerasyon çalışma larva zebrafish kullanın. Burada yeniden üretilebilir ve verifiably larva omurilik bölücü için bir yöntem ortaya koymaktadır. Transeksiyon sonra, veri 2 gün sonrası yaralanma (dpi) duyusal kurtarma başlangıcını gösterir, zekâh 3 dpi ve 5 dpi tarafından ücretsiz yüzme sürdürme saptanabilen C-bend hareketi. Böylece omurilik yaralanması sonrası kurtarma çalışmaları için yetişkin Zebra balığı bir arkadaşı aracı olarak larva Zebra balığı öneriyoruz.
Introduction
Insan omurilik büyük travma nedeniyle sık sık aksonlar regrow veya nörogenezi 1,2 yeniden başlatmak için yetersizlik, kalıcı felç ve yaralanma seviyesinin altında duyu kaybı ile sonuçlanır. Memelilerde aksine, ancak, semenderler ve Zebra balığı (Br.rerio) dahil anamniotes bile tam omurilik kesisi 3,4 sonra sağlam iyileşme göstermektedir.
Yetişkin zebrabalıkları omurilik yaralanması 5-7 aşağıdaki kurtarma işlemini incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir. Tam omurilik kesisi sonrası, duyusal ve lokomotif işlevi yeniden kurulması 6 hafta sonrası yaralanma 8 ile yetişkin zebrabalıkları görülmektedir. In vivo olarak rejeneratif proses incelemek amacıyla, şeffaf larva zebrabalıkları 9 döndü.
Burada bir 5 gün sonrası fertilizasyon (DPF) larva Zebra balığı USI ve omurilik transect için bir yöntem mevcutBhatt değiştirilmiş bir neşter gibi bir eğimli mikroenjeksiyon pipet, ng vd. 10. Bu yöntem, yüksek verim, düşük mortalite ve tekrarlanabilirlik destekler. Uygulama ile, 300 larva / saat nakledilmiş olabilir, ve 98.75% 0.72% ± 3.600 üzerinde hayvanlar dahil kesilerde 6 aydan fazla, 7 gün sonrası yaralanma (dpi) kadar yaşadı. Bizim veri de duyusal ve hareket hızlı iyileşme gösterir: 1 dpi, yaralı balıklar tarafından tüm hareketleri sadece göğüs yüzgeci lokomosyon tarafından tahrik edilmektedir. Ancak, larva 2 dpi tarafından transection iğne dokunmatik caudal tungsten yanıt başlar, 3 dpi tarafından C-bend hareketini yeniden ve 5 dpi 11 ile yırtıcı yüzme gösterilecek. Asetilenmiş tübülinin karşı antikor boyama kullanarak, aksonlar 1 dpi yaralanma sitesinden bulunmadığına olduğunu doğruladı, ancak 5 dpi tarafından yaralanma siteyi geçti. Biz bu protokol aşağıdaki yaralanma omurilik aksonal yeniden büyüme ve nöron çalışma için değerli bir teknik sağlayacağına inanıyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafish standart prosedürlere göre yükseltilmiş ve yetiştirilen; deneyler Utah Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
Cerrahi Plakların 1. Hazırlanması
- Üreticinin talimatlarına göre, 60 mm Petri kapları ve Sylgard 184 Silikon Elastomer Kit kullanılarak cerrahi plakaları olun. Yarı dolu daha fazla yemekleri doldurun ve polimerize izin. Mağaza, oda sıcaklığında kapalı.
Mikropipetler 2.. Hazırlanması
- Isıtma ve mikroenjeksiyon iğneler yapmak için aynı ayarları kullanarak bir mikropipet çektirmenin ince duvar borosilikat kılcal boru çekerek mikropipetler Üretiyor.
- Diseksiyon mikroskobu altında, forseps ile çapı yaklaşık 200 um mikropipet ucu kopar.
- Konik kırık 25 ° 'de ikinci bir beveling ardından 35 ° başlangıçta microgrinder ile kenar. Ucu keskin ve smo olduğundan emin olunoth. Mağaza kil küçük bir miktar üzerinde bir Petri kabındaki eğimli mikropipet tamamladı.
Zebra balığı Larva 3. Hazırlanması
- Ameliyat öncesinde 7 gün, erkek ve kadın zebrabalıkları çiftleşme tankları kurmak.
- Işıklar maksimum verim sağlamak için gel 3 saat sonra, ertesi sabah embriyolar toplayın. Knu3, 28.5 ° C'de çeşit döllenmiş embriyo 100/100 mm levha E3 25 ml: Böyle Tg (eGFP elevl3) gibi bir transgenik muhabir hattı kullanıyorsanız Yabani-tip kullanıldığında, sıralama 28.5 ° C'de E3 25 ml embriyolar 25/100 mm plaka döllenmiş
- Bir muhabir hattı kullanıyorsanız, 48 hpf floresan ifade embriyolar ekran. Embriyolar 28.5 ° tespit C'de E3 25 ml 25/100 mm levha yoğunluğunda olgun izin verin
- Larva 5 dpf olduğunda, E2 + 10 mg / L Gentamisin Sülfat (GS) + Tricaine ile Sylgard kaplayarak cerrahi plaka hazırlanması.
- 100 mm Petri dis 25 ml E2 + GS ekleyerek kurtarma tabak hazırlayınh.
- Birlikte üç bezlerden bantlama tarafından neşter hazırlayın. Bu, üç oluklar ile üçgen bir araç oluşturacak.
- Oluklardan birine içine bantla tarafından bezlerden hazırlanmış bir mikropipet monte edin.
- E2 + GS ile net bir 1ml şırınga ve önceki bezlerden montaj için bir 27 G iğne kullanılarak kadar sifon mikropipetler, yeniden eğer.
4. Cerrahi
- Tricaine ile bir süre (25 balık) de larva 1 tabak anestezisi. Artık dokunmatik tepki gösterirler zaman Fish yeterince uyuşturulur. Bu neşter onları dokunduğu zaman aksi takdirde seğirme, balık tamamen ameliyat öncesi anestezi olması önemlidir. Cerrahi bir diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirilir.
- Cerrahi plakasına larva aktarın.
- O neşter tutan elin sırtını en yakın olan yan yatıyor böylece maksimum büyütme altında, bir seferde bir larva döndürün.
- Onlar Sylgard dayanacak şekilde pozisyon, forsepslarva eni boyunca açılı.
- Forseps kollarına birine karşı cam neşter Brace emin Notokordun ventral kenarının ötesine kesmek için olan, anal gözenek düzeyinde larva dorsal yan yüzüne halinde kesilir. Omurilik sever neşter bükün.
- Kalan larvaları ile tekrarlayın.
Not: Bir larva kanarsa, bu ameliyatın olmaz. Hemen ameliyat plakadan larva kaldırmak ve Tricaine doz aşımı yoluyla euthanize.
- Larvaların toplu üzerinde ameliyat tamamlandıktan sonra, transfer kurtarma plakasına hayvanları yaralandı. Bu anestezi takas desteklemektir.
- Dikkat: transferi için yaralı larvaları toplarken, onlar ilk baş veya kuyruk toplanır emin olun: larvaları bükerek yaralanma siteyi stres yok.
Not: cerrahi için kullanılan tüm cihazlar mikropipetler dahil, yeniden kullanılabilir.
- Dikkat: transferi için yaralı larvaları toplarken, onlar ilk baş veya kuyruk toplanır emin olun: larvaları bükerek yaralanma siteyi stres yok.
5. Kurtarma
- Transfer kurtarma plakasından 25/plate bir yoğunlukta 25 ml E2 + GS ile doldurulmuş 100 mm levhalarına larva yaralandı. 28,5 ° C inkübatör kurtarmak için izin verin.
- Hasta ve ölü hayvanlar kaldırarak, günlük plakaları kontrol edin. Coleps (tatlı su protozoa) medyada görünür olana kadar ortamı değiştirmek etmeyin. Ortamı değiştirirken, yeni bir plaka balık transferi yok; Bunun yerine, mümkün olduğunca medyayı çıkartın ve yeni medya ile aynı plaka sel. Coleps nüfusu azaltmak için gerektiği kadar tekrarlayın.
- Toz yavru yiyecek küçük bir miktar ile günlük besleyin.
Not: Canlı yem (örneğin, Paramecia ya rotifer) da lokomosyonu kurtarıldı sonra kadar yaralı larvalarına karşı beslenen olamaz. Aksi takdirde, canlı gıda yaralanma siteyi kolonize ve larvaları öldürür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hasarı bölgesini çevreleyen doku hasarının ciddiyetini azaltmak için, mikropipet doğru eğim verme kritiktir. Şekil 1A, bir doğru eğimli uç gösterir. Çok dar olan bir uç (Şekil 1C) yerine doku kesici daha derisini bakışta eğiliminde iken çok geniş olan bir ucu (Şekil 1 B) kullanarak, bağlı olarak dorsal aort nicklemek artan olasılığı daha yüksek ölüm neden olma eğilimindedir.
, 1 dpi zebrabalıkları.: Şekil 2A, canlı bir Tg (eGFP elevl3) bir tamamen nakledilmiştir omurilik gösterir omurilik görselleştirmek için knu3: Bu teknik uygulama için, bu tür Tg (eGFP elevl3) gibi bir haberci hattı kullanmak avantajlıdır . balık co sahip: Şekil 2B 3DPI de aynı canlı balık gösterirken 2C ve 2D (eGFP dbx1a) sabit Tg 3 dpi yaralanma sitenin daha yüksek büyütme göstermektedirmplete (Şekil 2C) veya eksik (Şekil 2B) omurilik transseksiyon. Omurilik (sarı ok) ventral kenarı boyunca nöron etiketleme bitişik bölge not edin.
Neşter kenarları Şekil 1.. Karşılaştırılması. Bir cerrahi için uygun bir doğru eğimli mikropipet ucu gösterir. Bu boyut kolayca yeniden kullanım için temizlenir. B, 5 dpflik larva ameliyat için çok geniş bir eğimli mikropipet ucu gösterir. C çok dar bir ucu bir örnektir. Bu boyut yeniden kullanım için temizlenmesi çok zordur ve bunun yerine kesim kesisi bir kesme eylemi teşvik eğilimindedir D:. Lezyona takım tertibatının karikatür. Üç 6 "bezlerden bir py içine yuvalanmışşekil ve birbirine bantlanmış ramidal. Neşter üç bezlerden oluşan olukların biri aittir ve yerine bantlanır.
.. Balık in vivo 1 dpi (A) ve 3DPI (B): Şekil 2 tamamen kesilmesini doğrulanıyor Floresan konfokal mikroskopi görüntü canlı Tg (eGFP elavl3) için kullanılmıştır. B - C - tamamen kesilmesini onaylamak için, bu görüntü kümeleri daha sonra A gösterildiği gibi (rsbweb.nih.gov) Maksimum Yoğunluk Projeksiyonu (MaxZ) oluşturmak için ImageJ işlendi HUC / D D gösterisi MaxZ projeksiyonları Tg'sini (dbx1a etiketli.: tam omurilik kesisi (C) veya eksik kesisi (D) ile 3 dpi eGFP) balık.Sarı oklar yaralanma sitesi tanımlamak, D = dorsal, R = rostral. = 100 mikron ölçekli bar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Başlangıçta bu tekniği öğrenirken, biz tek bir seansta en fazla 50-100 den kesilirken teşebbüs öneririz. Bu tekniği mastering sonra, saat başına 300 embriyo kadar transect edebiliyoruz; Ancak, üretilen bu düzeyde haftalık uygulama birkaç ay gerektirir. Ayrıca, bir raportör çizgi ile uygulama ve eksik omurilik kesisi sıklığı% 1'den daha az azalır kadar tamamen kesilmesini doğrulanması önerilir.
Yetişkin zebrafish omurilik hasarı sonrası transseksiyon akson büyümesini ve nöron okuyan için köklü ve sağlam bir tekniktir. Larva organizmanın içine bu analizi hareket ederek, biz in vivo iyileşme incelemek mümkün. Ayrıca, biz de, örneğin, rejeneratif sürecinde Tcf7l1a 12 çeşitli genlerin rollerini incelemek için yetişkin zebrabalıkları mevcut değil genetik araçları kullanmak mümkün.
Başlangıçta dyaralı hayvanlar 2 dpi tarafından yaralanma siteye caudal dokunmak bir tepki göstermek ve aksonlar 5 dpi tarafından yaralanma siteyi geçti: omurilik kesisi sonrası nöron çalışma eveloped, bu teknik, aynı zamanda duyusal fonksiyon kurtarma incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz hayvancılık için Utah Üniversitesi Zebrafish tesisine borçluyuz. RID NIH R56NS053897 tarafından desteklenen ve LKB HHMI Med-içine-Grad girişimi tarafından desteklenen bir predoctoral stajyer oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| Disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| Cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1 ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 G needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20 °C |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1 L); store at RT | |||
| 17.5 g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90 g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90 g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41 g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12 g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra | |||
| 0.35 g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1 L); store at RT | |||
| 50 ml 20x E2 | |||
| 2 ml fresh 500x NaCO3 | |||
References
- Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
- Mikami, Y., et al. Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery. Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).
- Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).
- Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).
- Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).
- Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).
- Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish. The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish. PloS one. 7 (2), (2012).
- Kim, C. H., et al. Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation. Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).
