Summary
磁気ピンセット、強力な単一分子操作技術は、生体高分子で（磁気トルクピンセットと呼ばれる構成を使用して）およびトルク（磁気ピンセットを自由に旋回と呼ばれる構成を使用して）ツイストを直接測定するように適合させることができる。このような測定を行うためのガイドラインは、DNAおよび関連する核 - タンパク質フィラメントの研究への応用を含めて、与えられる。
Abstract
単一分子技術は、リアルタイムで、溶液中の個々の生物学的分子の挙動を調査することを可能にする。これらの技術は、原子間力顕微鏡などのいわゆる力分光法のアプローチは、光ピンセット、延伸流れ、磁気ピンセットが含まれる。これらのアプローチの中で、磁気ピンセットは、一定の伸縮力を維持しつつトルクを付与する能力によって自分自身を区別している。ここでは、図示されている方法、例えば「従来型」の磁気ピンセットの実験構成は、横方向磁場の大きさを最小にする、そのフィールド構成の簡単な改変により、生物学的分子のねじれの程度を測定するように構成することができる。結果の設定は自由に周回磁気ピンセットと呼ばれる。さらに、それはフィールド構成のさらなる変更は＆＃との中間大きさの横のフィールドを得ることができる方法を紹介している8220;従来の「磁気ピンセット、それが可能で直接生体分子に記憶されたトルクを測定することができる自由に旋回磁気ピンセット。この構成は、磁気トルクピンセットと呼ばれる。付属のビデオは自由に軌道磁気ピンセットや磁気トルクピンセットに従来の磁気ピンセットの変換を行うことができる方法を詳しく説明し、これらの技術の使用方法を示します。大幅にこの強力な機器の汎用性を拡大しながら、これらの適応は、従来の磁気ピンセットのすべての長所を維持します。
Introduction
近年では、単一分子技術は、それらの動力学および基礎となるメカノへの洞察を得プロセッシブモータータンパク質および他の酵素の研究において、その幅広い適用性が証明されている。力分光法の文脈において、重要な貢献は、原子間力顕微鏡の流れ延伸し、光および磁気ピンセットによってなされている。光学および磁気ピンセット（MT）は、特に、高い空間分解能と時間分解能で分子操作の面で優れた柔軟性を組み合わせることに成功しました。ここでは、表面と超常磁性ビーズ1-3の間でつながれ、生物学的分子にストレッチ力とトルクの両方を適用することができる、モンタナ州に焦点を当てています。
磁気ピンセット（MT、 図1a）は、機械的核酸の性質ならびにタンパク質との相互作用の両方を監視するために使用されてきた非常に汎用性の単一分子技術である。 MTは、多くの強度を有する実験的な実装の 全体的なシンプルさと堅牢性、一定の力モード4、並列測定が5の拡張で、6、サンプルを加熱し、光損傷がない場合のトルク、自然な操作と簡単なキャリブレーションの容易なアプリケーションを含む、S、。他の単一分子アプローチと比較して、MTは≈10 fNの程度の低い力での力依存性測定を実行し、率直に超らせんの程度を制御する能力を有する方法を提供する。 MTは、主に核酸の7,8関与する生物学的プロセスを調査するための実験ツールとして使用されてきたが、それらはまた、タンパク質または9-13セル10、14-17の機械的特性の研究に応用されている。数々の有用な参照は、MT 4、18〜20をビルドして実行する方法について説明し、利用可能である。
HowevER、従来のMTは、彼らがトルクをかけながら、彼らは直接トルクを測定しない、直接回転運動を追跡し、しないでください。さらに、それらは、核酸テザーの自由回転を拘束する。ここでは、マグネットピンセットの2つの拡張を提示する。最初は、自由に旋回磁気ピンセット（FOMT、 図1b）21 と呼ばれる、テザー軸周りの回転運動を制限することなく、平衡角度変動や係留核酸分子のねじれの変化の測定を可能にする。第二に、直接適用され、単一の生体分子22-27に力およびトルクの両方を測定する能力を有する磁気トルクピンセット（MTT、 図1c）を 、と呼ばれる。
以下のプロトコールでは、読者が彼/彼女の処分で「従来の」MT器具を有することを前提。我々はセットアップし、MTをビルドして実行する方法についての参照のための検討を読者だけでなく、consideを参照してください。磁性ビーズは、磁石、及び追跡ルーチンの選択において考慮しなければならない飼料。また、議定書のテキストのセクション1と2は、我々は一般的に、MTで使用するためのDNAサンプルだけでなく、従来のMTに単一のDNAに対して実行できる予備測定を準備し、インキュベート方法について説明します。プロトコルのテキストの表示部3,4は、MT器具は容易に適合さFOMTおよびMTT測定のために使用することができる方法を示す。
Protocol
1。DNAサンプルの調製およびインキュベーションを
- それぞれ18複数のビオチンおよびジゴキシゲニン基で官能化された端を（通常は≈600塩基対のDNAのPCR断片を採用）デュプレックスに連結するDNA構築物を準備します。開始するには、> 1のDNAテザーの長さはミクロン、 例えば 、ここで用いられるような〜2.7ミクロンの延伸長さに相当する7.9 kbpのは、使いやすさのためにお勧めします。特に、類似またはビードの半径よりも短いDNAの長さを使用することにより、MTT及びFOMTにおける取付形状に問題がある。 DNAの長さ、角度、ドメイン内の時間応答にどのように影響するかを説明するための説明を参照してください。
- 単一分子実験用フローセルを組み立てます。フローセルは、二枚のガラス顕微鏡は二層パラフィルムスペーサーにより分離カバースリップ使用。トップ顕微鏡カバースリップは、セルに2流体用の穴内および店舗を持っている必要があります。それはに便利です穴を開けるためにサンドブラスターを使用しています。底部カバースリップをニトロセルロース（酢酸アミル中0.1％重量/容量）で被覆されている。下のスライドのニトロセルロースでコーティングされた側にパラフィルムスペーサを配置し、クリーンなトップスライドがトップを閉じます。
- フローセルを封印。物理的なピンセットを用いて、約1分間、80〜100℃に設定され、ヒータプレート上に組み立てたフローセルを配置する。パラフィルムは、インとコンセントに接続するスルーホールを閉鎖し、ガラススライドがよく合っていることをしないことを、フローセルをよく密閉されていることを注意してください。
注記：良好なシール性を確保するためには、大規模な綿棒を使用して、ストロークうちパラフィルムに気泡をすることをお勧めします。フローセルは、その後磁気ピンセット装置に取り付けることができる。 - バッファを準備します。テザリングTE緩衝液（10mMトリス-HCl、pH8.0、1mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、及び200mMのNaCl）を調製する。あるいは、（137mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのリン酸緩衝液、pH7.4）を補充したPBS wの緩衝液を使用することができテザリングバッファとしてi番目の100μg/ mlのBSA、0.1％のTween及び5mMのアジ化ナトリウム（PBS +）。フローセルに2〜3セルのボリュームのTEテザリングバッファーをフラッシュします。
- 約30分間、フローセル中0.5又は1.5μmの半径非磁性ラテックスビーズをインキュベートする。これらのビーズは、いずれか（ すなわち、フローセル）対物レンズと試料ホルダとの間のドリフトの影響を最低限に抑えることができ、磁気ピンセット測定中に基準ビーズとして作用する。 TEテザリングバッファの2〜3セル容量で洗浄することにより付着していない非磁性ビーズを洗い流す。
- 少なくとも1時間、PBS中の100μg/ mlの抗ジゴキシゲニンとのインキュベーションにより、フローセルの底部表面を官能（好ましくはより長い、一晩インキュベーションを行うことができる）、DNA結合のために提供する。 TEテザリングバッファの2〜3セル容量ですすいでください。最後に、表面保護のために30分間、TEテザリング緩衝液中で2 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）を用いてフローセルをインキュベートする。
- の一定量を取る2ミリリットルストレプトアビジンでコーティングされた超常磁性のMyOneビーズ（材料の考察と表を参照）、10ミリリットルのTEテザリング緩衝液で希釈する。磁性粒子濃縮器を用いて10ミリリットルのTEテザリング緩衝液で2回洗浄し、10ミリリットルのTEテザリングバッファーに再懸濁。 30分間のTEテザリングバッファー中でインキュベートすることにより、これらのビーズにDNA分子（約1 NG）の〜1ミリリットルを取り付けます。
- 90ミリリットルのTEテザリングバッファを追加することによって、DNA-つなが超常磁性ビーズ10倍の溶液を希釈する。最後に、フローセル内に溶液を注入し、抗ジゴキシゲニンで被覆された表面へのDNA付着を可能にするために約1時間インキュベートする。 TEテザリング緩衝液で徹底的にフローセルを洗浄します。 DNA-テザー構築物をインキュベートした後、すべての非接続型ビーズを除去するために（これは、TEテザリングバッファすることができます）、実験バッファーで強く洗浄します。
- 磁気ビーズに結合した基準マーカービーズを必要とし、角のトラッキングプロトコルを採用する測定のための
従来の磁気ピンセットでの単一のDNA分子上の2。測定
- フローセル内に回転拘束されたDNA分子を検索し、従来のMT（説明を参照）は、適切なフィールド構成を有する（ 図1a）及び翻訳と磁石の回転位置制御の両方を使用する。 ≥1 PN（磁気ピンセットの力校正に関する参考文献4、19、20、28、29を参照してください）の力を引っ張っで、つながれたビーズは簡単に焦点が彼らの様々な高さによって底部スライドの表面に付着したビーズと区別することができる。 DNA分子が回転拘束されているかどうかを20〜30ターンを導入することにより評価することができる≈0.25 pNの力で磁石のS：ここでは、テザーの長さは0.4〜0.5程度で減少するはずである。
注：磁気ピンセット実験を実行するには、画像処理を係留DNA-ビーズのx、y、およびz位置を決定するために使用される。この目的のためのカスタムLabVIEWソフトウェアは、要求に応じて作成者から提供されています。- ビーズは単一のDNAテザーによって接続されていることを確認します。これは、> 1 pNで（ 図2a）の力で正および負の巻下動作を比較することによって行うことができる。単一DNAテザーが非対称応答を生じさせるであろう、一方、この力レジームでは、複数のDNAテザーの存在は、正と負のターンを導入する際の伸長で約対称な低下を生じさせるであろう。
- 参考ビーズとして機能することができ、関心のテザーの近くで底面に付着し、適切な固定ビーズを検索します。
- Tの長さを校正彼は、DNA、L。フローセル表面の位置が（0.2 pNで以下の力で60〜交互に磁石を回転させることにより、 例えば ）表面と接触して係留ビードせることによって決定することができる。この面に対してつながビーズの垂直位置の測定は、その後、Lの絶対値を報告する。
注：ドリフトのその後の影響を最小限にするために、表面に固定された基準ビードの位置リットルの相対的な測定を実行することをお勧めします。 - ≈0.25 PN（ 図2a）の伸縮力で回転曲線（ターン数の関数としてのDNA伸長すなわち測定）を記録。
- これは、DNA分子がねじれ緩和される状態に対応するように拡張は、最大となるターン数を決定します。そのためには、中心POSITIを決定するために、放物線又はガウシアン関数で局所的に回転曲線にフィットするのに有用である上。 「ゼロターン」として、この点を定義します。
注意：この目的のためにカスタム作成ルーチンは、要求に応じて作成者から提供されています。
- これは、DNA分子がねじれ緩和される状態に対応するように拡張は、最大となるターン数を決定します。そのためには、中心POSITIを決定するために、放物線又はガウシアン関数で局所的に回転曲線にフィットするのに有用である上。 「ゼロターン」として、この点を定義します。
- 〜20磁石位置のシリーズでは、Z-トレースから（「ゼロターン」、ステップ2.4.1を参照のIE）ねじれ緩和分子の平均延長を決定。
- ステップ2.5において、各測定点については、正確にxまたはy位置20、28、29の変動から延伸力を決定する、または、ビーズの磁化が局所磁場勾配4の知識を用いて、周知提供される。力-拡張曲線（ 図2b）の平均拡張結果に対する延伸力をプロットする。
- Bouchiat ら 30による多項式近似を用いて、ワームのようなチェーン式に生じる力、拡張データをフィットします。
注：より密接に、従来のMTの構成で生じた線維輪の半径が小さいDNA分子は磁気ビーズの「南極」につなが近い。一つはFOMT構成に切り替えると、このようなDNA分子は、（x、y）は位置（考察を参照）からの回転角度の確実な追跡を可能にする磁気ビーズの「赤道」に密接に繋留される。
自由に軌道磁気ピンセットを用いたDNAのねじれ3。測定
- 手動FOMT（ 図1b）に使用された円筒状の磁石によって従来の磁気ピンセットの二乗磁石を交換してください。この操作では、選択したDNAテザーが視野内に留まるように行われるべきである。
- 粗アライメントは7.9 kbpのテザーとのMyOneビーズ例のために15分以内に達成し、円を描く（ 図3b、中央）の観察では（x、y）の遠足結果の時に測定完了することができます。
注：粗アライメントは、一般的に事実にもかかわらず、付属の2次元ヒストグラムは、そのカウントを持っていない可能性があり、FOMT構成21、31にあるつながつのDNAと結合するタンパク質（代表的な結果、 図5）によって引き起こさねじれの変化を観察するのに十分である絶対に一様に円形の環状部（ 図3c）に沿って分布。
注： 図4のように、ヒストグラムやサーモの変動をプロットするためのMATLABスクリプトは、要求に応じて作成者から提供されています。
注：ファインアライメントは7.9 kbpのテザーとのMyOneビーズの場合の45分以内に達成することができ、小さいビーズより短いテザーための還元時間枠内に（説明を参照）が用いられる。
注：ファインアライメントは、典型的には、裸またはタンパク質でコーティングされたDNA（代表的な結果、 図4）のねじり剛性の測定を行う必要がある。
4。磁気トルクのピンセットを用いたDNAトルクの測定
- 手動で円筒形の磁石のプラスのMTTのための側（永久）磁石（ 図1c）でFOMTに使用された円筒状のマグネットを交換してください。この操作では、選択したDNAテザーが視野内に留まるように行われるべきである。
- これを実現する最も簡単な方法は、手動で1分以内に達成することができる適切な場所での側磁石を追加することである。これ以上の再編は必要ありません。
注意：側磁石の代わりに使用することである32電磁石 。
- これを実現する最も簡単な方法は、手動で1分以内に達成することができる適切な場所での側磁石を追加することである。これ以上の再編は必要ありません。
- 分析に必要な場合には、ビーズのxまたはyの変動のいずれかを使用して、MTと同様の方法で力を較正または、ビーズの磁化が局所磁場勾配21の知識を用いて、周知提供される。
- 基準ベースの追跡プロトコル23または、添付のビデオに示すように、（x、y）の位置を（説明を参照）の監視に基づいて角速度トラッキングプロトコルのいずれかを使用して時間θ（t）の関数としての角度の変動を追跡する。前者の場合には、後続の画像処理のための時間の関数としてのビーズの完全な画像を記録する。後者の場合には、このステップにおいて、ビーズの（x、y）の変動を記録するのに十分である。
注：基準ベースの追跡プロトコルにおける時間の関数としてのビーズの完全な画像からθ（t）を決定するためのMATLABスクリプトは、あるリクエストに応じて、著者からvailable。- ディスカッションで述べたように、（x、y）の位置を監視に基づいて、角度の追跡プロトコルのためには、磁石がゆっくりと（典型的には0.1 Hzで）数回転によって回転する時間トレースを記録することをお勧めいたします。これは1が正確に議論の式3-5を用いて、極座標（R、θ）に直交座標（x、y）を変換することができるようになります。
注：（x、y）の位置を監視に基づいた角度トラッキングスクリプトのためのMATLABスクリプトは、要求に応じて作成者から提供されています。
注：測定時間が所望のトルク分解能に主に依存する。詳細な議論はリッペルトら 24に記載されている。のMyOneビーズと8 kbpのDNAのテザーのために、30〜100秒間測定することは、〜1 pNの·20nmの範囲のトルク分解能を与えるに十分であるべきである。
- ディスカッションで述べたように、（x、y）の位置を監視に基づいて、角度の追跡プロトコルのためには、磁石がゆっくりと（典型的には0.1 Hzで）数回転によって回転する時間トレースを記録することをお勧めいたします。これは1が正確に議論の式3-5を用いて、極座標（R、θ）に直交座標（x、y）を変換することができるようになります。
- 目からねじりトラップの剛性を決定する角度変動のEの分散（σラジアンで、2θ）を使用した：
Kθ= K Bは 、T /σθ2（1）
注：MTTで達成典型的な回転トラップ剛性は、従来の磁気ピンセットのためのより低い10〜1,000 PN·NM /ラジアンの範囲である。 - また、（これもステップ2.4-2.7参照）ビーズのz位置を記録し、テザーの長さlを決定するためにこれを使用する。
- ローテートNがオンになり、再びθ（t）とL（T）を記録。
注：MTに比べてMTTの還元回転トラップ剛性は、単一分子トルクの測定に適したレンダリングが発揮できる最大トルクが低下することを意味する。これは、MTTは、急速な回転による高い抗力トルクを相殺することができない場合があることを意味します。お手入れは、したがって、最高速度を超えないように注意する必要があります。 Typically 0.1ヘルツに近い速度で回転する。 - Nは使用してオンにした後、核酸テザーに蓄積されたトルクを決定します。
Γ= - Kθ<θN - θ0>（2）
ここで、<...>平均、θ0を示し、θNゼロ回転（ねじれリラックスしたテザーに対応し、CFの角度である。それぞれ、2.3に進み、Nが点灯します。 - 反復は、完全に単一の測定ラン（代表的な結果、 図6）中の分子のトルク応答を決定するために、4.5および4.6は、必要に応じて繰り返す。
Representative Results
MT（ 図1a）からの代表的結果を図2に示す。 図2aは、F = 0.25、0.5、2.0 pNので採取7.9キロバイトのDNAのための回転伸長曲線を示す。回転に単一のDNAの応答は、正または負の超らせんplectonemicの形成の結果として減少したDNAの拡張子を持つ、最も低い力（0.25 PN）で対称である必要があります。当初は回転に制約のDNAテザー（2.1ステップ）を検索するときに、この反応の定性的な知識が役立ちます。テザーの追加の検査は、それが単一のDNA分子から構成されていることを確認する必要があることに注意してください：ここでは、0.5 pNのを超えた力で回転する単一のDNAの非対称応答は、複数のDNA（ステップ2.1.1）と区別するために役立ちます。これが確認されると、一方がオンの磁石の正確な数を決定するために、少なくとも0.25 pNの回転応答を返すでの単一DNA iを1は、 図2のBのようになります。力伸長曲線をとる場合には、ねじれリラックスしたよ。この特定の測定では、ワームのような鎖モデル（実線）へのデータのフィット嵌合輪郭長さL C = 2.71ミクロンおよび曲げ持続長さL P = 45ナノメートルを得た。二本鎖DNAの場合は、持続長の適合値は、バッファー条件33に応じて、範囲40〜55ナノメートルであるべきである、とフィット輪郭長は、DNA構築物に期待される値に近い（通常は10％以内）する必要があること関係LのDNA = 0.34Å/塩基·塩基対の数を用いて、測定に使用される。
図3は FOMT（ 図1b）のアライメントの手順や結果を示している。ステップ3.2において記録された初期の（x、y）は、エクスカーション関数としてのoを変動の全体図と比較することができるFOMTに保持された磁石とDNA係留ビード間のその後の相対変位を案内するために使用することができる「渦」パターンを示す図3aに示す横断磁石位置で、f。後続の粗い位置合わせが完了したときにも、 図3bの黒のトレースで示されるように、ビードの（x、y）は 、変動は、円形軌道を描く。このとき、z軸の周りの磁石からのトルクは、熱揺らぎがその取り付け点の周りにビードを回転させるために十分である点に縮小される。得られた円形の環状部（嵌合円が赤で示されている）の半径Rの円は、DNA結合点とビーズの中心（ 図1b）との間の半径方向距離を表す。 図3cに示されるように、しかしながら、 図3bのデータのヒストグラムは、粗い位置合わせが均一な被覆を保証するものではないことを示して円形の環状部に沿ってすべての可能な位置の。熱変動が円上の全ての回転角を探索するのに十分であっても、自由に回転する（熱エネルギーのk B T のオーダーの）小さなエネルギー障壁が残っている。
より微細な位置合わせがFOMT（ステップ3.4）で行う場合、機器はDNA（ 図4）のねじり弾性係数を決定するために使用することができる。まず、試料の微細な位置合わせは、その二次元ヒストグラム今均一な被覆（ 図4b）を示すべきで円運動（図4a）を得るために使用される。 （（x、y）は 、位置の変換された、下記参照）の角度変動の痕跡Q（T）に対応する時間がない周期性（ 図4c）360˚に対応していない表示され、いくつかの完全なターンに対応する大規模なツアーを明らかにした（ 図4D）。暗黙のエネルギー地形>千˚（ 図4e）の範囲にわたって高調波である。変動の標準偏差はkの角度トラップ剛性に対応し、σθ= 223°でθ= K Bは 、T /σθ2 = 0.27 pNで··今度は効果的なねじり持続長の推定を与えるNM / RAD、測定された力で、C =のL、C /σθ2〜76ナノメートル（本測定で使用される3.4 kbpのDNAのためのL、C = 1150 nm）のと同じDNAの。
FOMTタンパク質31、34の結合を介して係留DNA分子に誘起される撚りの変化を測定するために使用できる方法の例を図5に示す。ここでは、倍にRAD51タンパク質の結合を監視している一本鎖DNA; RAD51は、両方の長く知られており、それが核タンパク質フィラメント31を形成しているとしてDNAをほどくされる。フローセルにRAD51をフラッシュする際に、我々は、ビーズがFOMT（ 図5a）内の螺旋軌道を受けることを確認します。上述したようにqの（t）に時間の関数として（x、y）の動きの軌跡を変換することによって、我々は、RAD51はDNAテザーの長さと巻き戻しの程度に及ぼす影響をプロットを共存でき（ 図5b、c）の 。
DNAの捩り特性を測定するための別のアプローチは、MTT（ 図1c、図6）である。 図6aの回路図は、測定原理を示しています。overwinding（またはunderwinding）の後に、NによるDNAテザーは変わり、DNAは、θNのθ0から平衡角度位置にあるシフトをもたらすビーズ上の復元トルクを発揮する。 MTTの磁場の横方向成分は、依然として（ 図1）ビーズの回転を許容しつつ、このような角度のシフトの測定を容易にMTに比べて低減される。 7.9 kbpのDNAにN = 45のターンを適用した後に測定された角度のシフトの大きさは、 図6bに示されている。 MTT計測プロトコルおよびDNAのための回転曲線に対するトルクの得られた結果の完全な配列を、 図6cは、-fに示されている。ここで、角座標の標準偏差（ 図6c）および平均（図6d）の測定は、標準偏差が角度トラップの剛性（式1）に反比例すると、過剰とunderwindingの関数として示されている。まとめると、これらの量は、中心の一つが線形応答領域を示すべきDNAのための回転曲線（ 図6fの ）対トルクを構築することができるように、約0ターン2回目でプラトーれる正および負の回転時のトルクが飽和し、それぞれ。回転曲線に対するこのようなトルクは、それによって、DNAの座屈や変性を伴う遷移を定量化する、回転曲線（ 図6E）対延長で情報を補完します。
図1：従来の磁気ピンセット（MT）の回路図、自由に旋回磁気ピンセット（FOMT）、磁気トルクピンセット（MTT）、回転角度を追跡するための2つの戦略。 （a）は、磁気ピンセットの3つ全ての実装形態では、磁性ビーズを官能化高分子によってフローセル表面に繋留された、 例えば二本鎖DNA分子を模式的に示す。基準ビーズをフローセル表面に付着しDRIFためにトラッキングされるトン補正。すべての3つのMTのセットアップは、それゆえ、DNAのテザーを磁気ビーズに上向きの伸縮力を適用するために磁石を採用し。従来のMTにおいては、一対の磁石をしっかりとDNA-テザー軸周りにビードの回転を拘束する、横方向にテザー軸に対して配向された磁場を与える。 FOMT形態では、円筒形の磁石は、テザーの方向に沿って配向された磁場を提供する。テザーは、円筒状磁石の中心に位置合わせされると、残りの横方向のフィールドはMTTでテザー軸回りの自由な回転を可能にする、最小化され、側磁石を提供するために、FOMTで用いた円筒状のマグネットに加えられる（MTに比べて大きさが減少した）小さな横方向のフィールド。この小さな横方向磁場は、トルクを印加するだけでなく、その測定を可能にする。（b）の DNA-テザー軸の周りの磁気ビーズの回転角度を測定するための2つの戦略が示されている。 1）：マーカービーズ（GREE磁気ビーズ（茶色）に接続されたNは）による分析を想像追跡角度を可能にする非対称な像を提供します。 0.5μmの半径基準マーカと1.4μmの半径磁気ビーズの2つのCCD画像が焦点とアウトオブフォーカスが示されている。 2）：DNAは離れて、ビーズのサウスポールから離れた位置に磁気ビーズにつながれたとき、ビーズの中心は、中心角位置を定義する円弧に沿って変動する。テザーがねじれ、従って単一分子トルクの測定が可能、（右の上のトレース）に歪むように、どちらの戦略は、回転角度を追跡するために、角度位置のシフトをモニターするために使用することができる。
従来のMTの図2。のDNA較正測定。、F = 0で撮影された7.9キロバイトのDNAについて（A）回転拡張曲線0.25、0.5、および2.0 pNの。単一の二本鎖DNAテザーの正および負の巻数に回転下非対称応答は、テザー付着 の便利な試験として使用することができる。一緒に当てはめ7.9 kbのDNAのための（b）に強制伸長曲線、ウォーム嵌合輪郭長さL C = 2.71程度と持続長さL P = 45nmの曲げを生じ、チェーンモデル（実線）が挙げられる。全ての測定は、PBS緩衝液中で行った。
図3。FOMTにおけるアライメント。 （a）は、（x、y） は 、磁石位置の関数としてFOMTに保持されたDNA-テザービーズの変動。円筒形の磁石の位置は、x方向 250μmの工程におけるフローセル表面を横切る3mmの一定の高さで走査し、そして
図4 FOMTを用いてDNAねじり剛性の測定 （x、y）の軌跡（a）及びヒストグラム（b）は DNA-テトFOMTの相対磁石テザー位置を微合わせた後、ビーズの変動をエー。このような状況下では、ヒストグラムは、円上の位置を本質的に均一な被覆を明らかにする。（x、y）は 、の位置から決定されたビーズ（c）の回転変動。回転変動（d）のヒストグラム。赤い線はσθ= 223°のガウスフィットです。（E）の回転変動（c）からの密度及び（d）によって暗黙エネルギー地形。 （Kθ= K Bは 、T /σθ2 = 0.27 pN-nm/radで）回転変動と調和近似によって暗黙エネルギー地形の違いは、数ターンオーバー熱エネルギーK BのTよりもはるかに小さい。データは、θ0 = 0、その明確にするためにオフセットされています。幅変動は、本文を参照して、DNAのねじり剛性を決定するために使用することができる。測定は1〜pNでの延伸力でPBS緩衝液中で行った。データがリッペルトら 21から適応されています。
図5 DNAのRAD51タンパク質の結合は、FOMTを用いて測定した。 （a）は、繋留7.9 kbpの二本鎖DNAへのRAD51タンパク質の組み立ては3.5 pNので監視。アセンブリの最初の200秒の間に磁気ビーズ（直径1.0ミリメートル）で実行される（x、y、z）の軌跡は、時間青から赤に色分けされたと示されている。dsDNAの推定の（b）に伸長推定される二本鎖DNAテザーの軸の周りの（a）時間の関数としての（c）は回転角度でビード軌道のz成分から時間の関数としての（a）はビード軌跡からのX、y成分。
図6 MTTにおける単一DNAテザー上のトルク測定値であって、（a）図は、トルク測定の原理を示す。オーバー（または過小）NによるDNAテザーをオン巻き後、DNAをθNに0θから平衡角度位置にあるシフトをもたらすビーズ上の復元トルクを発揮する。使用される角度トレースの（b）の例トルクを測定するには、次のようにねじれてリラックスした7.9 kbpのDNA分子につながビーズの角度変動（青）の前と40ターン（暗赤色）を導入した後に（CF）トルク測定をSTで開催されたPBS緩衝液中の7.9 kbpのDNA分子上。基準マーカビーズに基づく角度トラッキングプロトコルを使用して3〜pNの力をレッチング。角度の変動（b）に印加巻数の関数として記録した。（c）の角度の変動の標準偏差を印加巻数の関数として示すように。変動の幅が一定の角度トラップ剛性を示す、ほぼ一定である。（d）に印加巻数の関数としての平均回転角のずれ。過剰とunderwinding時平均角度の体系的シフトは明らかである。（E）を適用ターンの関数として同時にモニターするDNAテザー伸展。（F）（D）に示す平均角度から決定されたDNAテザーによって及ぼされるトルクは、 、本文を参照してください。過剰ゼロの周りターンunderwindingする線形トルク対を生じさせる（約7実効ねじり持続長を決定するために使用することができるDNA-テザー（嵌合グレー斜面イオン（d）及び（f））の応答を回すこのデータ·セットの7）である。さらに座屈と（概略挿入図に示されている）plectonemic超らせんの形成、（〜26 pNの·nmの（F）に正のターンで黒線）のトルク高原、および発行数とともにテザー伸展の直線的減少に対応するリードをoverwindingターン（）E（の黒い傾き）。線形領域を超えて巻き戻すことは、局所的に、DNAの原因となる、（左の挿入図に示されている）溶融溶融トルク（〜-11 pNの·nmの（F）に負のターンで黒線）と同等のトルク高原でマーク。
Discussion
MTTまたはFOMTを用いた実験を実行する場合は、選択肢の数が行うべき最良の選択肢は、関心のある実験に依存することになるビーズ、磁石、トラッキングプロトコル、等に関して行う必要がある。以下では、特定の実験のための選択を容易にするべきか、さまざまな選択肢を伴うトレードオフについて説明します。次に、我々は、MTTとFOMT実験のアライメントおよび実行に伴ういくつかの重要な手順について説明します。最後に、我々は既存の方法に関しては、MTTとFOMTの意義だけでなく、将来のアプリケーションについて説明します。
以前は、MTTとFOMT実験開始への考慮
いずれの実験では、使用するために磁気ビーズの種類を選択する1が必要です。一つは、 例えば 、いくつかの市販のストレプトアビジンでコーティングされた超常磁性ビーズの間で0.25μmの半径ビーズ、0.5μmの半径ビーズ、1.4μmの半径ビーズ（Sを選択することができます）材質テーブルは、EE。より大きいビーズはより小さいビーズ（およそボリュームとしてスケーリング）と比較して増加した磁気モーメントを有し、従って、それらの使用は、より高い力（我々の器具で達成典型的な部隊で、 表1を参照）の適用を容易にする。マーカービーズを使用して、角度の追跡が必要なとき、私たちは一般的に1.4ミクロン径で動作し、（対応するアタッチメントプロトコルの段落1.9を参照）が0.5μm半径マーカービーズのような非磁性ビオチン化ビーズを使用しています。ビーズ回転τCに特徴的な時間スケールは、そのばね定数γ/ Kθを介してシステムのドラッグの比率に等しいように小さいビーズの使用は、特に、FOMTをお勧めします。重要なことには、〜R ビード 3、 すなわち半径の3乗と同様に角度測定の時間スケールスケールに関連する回転抗力係数（ 表2を参照特性時間）はFOMTおよびMTT測定で複数のビーズのDNAの組み合わせに対してスケールします。適用することができる最大の力の減少は、添付の円筒状磁石27のフリップスタックを使用することによって対処することができる。それにもかかわらず、FOMT測定で、時には最高の達成可能な時間分解能と最大印加力と妥協する必要があるかもしれない。
さらに、実験は磁石構成を選択する必要があります。従来の磁気ピンセット構成（ 図1a）では、我々は通常、磁石4の間に0.5または1ミリメートル間隔で垂直方向に5×5×5ミリメートルの立方一対の磁石を使用しています。磁石をx（y）軸に沿って配置されているとき、これは主に、×（y）軸に沿って導かれる磁界を生じる。 FOMT実験のために、円筒形の磁石をその中心磁場が主に向けられている時に選択されるz軸に沿った（ 図1b）。実際には、我々は6mmの厚さの合計のために、3つのこのような円筒状のマグネット、6mmの直径および2mmの直径の中心穴を有する各々のスタックを使用する。高い引張力が望まれる場合には、底部磁石が反対の磁化とが積層された「フリップスタック」磁石構成が好ましい。 MTT構成（ 図1c）を達成するために、我々は、FOMT構成、直径4mmと7mmの高さが典型的に円柱の主磁石スタックの側面に付加的な磁石を加える。私たちの楽器で達成される最大の力が磁石構造にどのように依存するかを確認するには、 表1を参照してください。
MTTとFOMT実験のアラインメント
磁気ビーズ（約）を均一に官能面を持っているので（通常はストレプトアビジン）及び官能Nの両方の取り付け以降ucleic酸テザーとマーカービーズ（ケースにマーカービーズベースの角度トラッキングが採用されている）を溶液中での単純なインキュベーションを介して起こるテザーおよび/またはマーカービーズ、磁気ビーズに付着した場合、1は制御しません。磁気ビーズは、外部磁場の方向に沿って整列する傾向が好ましい磁化容易軸を有している。我々は、好ましい磁化軸がN極とS極のようなビーズの表面と交差する点を示している場合は、DNA-テザーが近い赤道に接続されているビーズは、に近いかよりもわずかに大きい半径の円形の環状部をトレースしますFOMTビード半径;対照的に、南極に近い取り付けられたビーズは、式3-5を用いて、円のフィッティングを排除することができる、FOMT非常に小さい半径の円形の線維輪に変動します。我々は、単純な球面形状によって、赤道付近で取り付ける確率が正確に極での添付ファイルよりもはるかに大きいことに注意してください。したがって、ほとんどのBEADSは、係留される（x、y）に基づく角度トラッキングが正常に行うことができるようになっている。
同様の議論は角追跡を基に基準マーカーに対するマーカービーズの取り付けのために保持している。マーカービーズは、角度の追跡を可能にする磁気ビーズの像の非対称性を生成するために使用される。マーカービーズ（ すなわち 、直接上に置くか、底の）ビーズのN極またはS極に正確に接続されている場合は、結果の画像はまだ回転対称であり、角のトラッキングプロトコルが失敗します。しかし、同じ球形引数によって、マーカービーズ極の1で直接接続するためのチャンスは比較的小さい。私たちは、実際には、ほとんどのマーカービーズが、角度の追跡を可能にするのに十分な非対称性を与えることがわかります。最後に、我々は、従来の磁気ピンセットで磁場の方向（x、y）が平面内にあることに注意してください。そのため、ビーズの好ましい磁化軸が目に整列するE（x、y）を平面とN極とS極、上で定義したように、ビードの両側には低い極が上にFOMTまたはMTTの状況、および下であることを行っている。
FOMT実験において、重要なステップは、半径方向の磁場がビーズに近接して無視できるように、円筒磁石のアラインメントである。アライメントは、一度に単一のビーズが行われる。 FOMTビード運動が均一に円形の弁輪に分配されるか否かを判断する、測定時間は20·τCを超えるべきである。 τC 8 kbpのDNAと半径0.5mmビーズのため〜45秒に等しいように、測定時間は、アラインメントの最終段階〜900秒である。比較のために、1.9 kbpのDNAおよび0.25ミリメートルの半径ビーズの使用は、（ 表2を参照のこと）〜2秒のτCの 20倍を減少させる。
女の間の追跡のための重要なステップと考慮事項OMTおよびMTT実験
面内変動をビードのを追跡するために、その（x、y）の位置、すなわち 、我々は、後続の時間間隔35、36でビーズによって表示される強度プロファイルの相互相関解析を使用する。これは、数ナノメートルの精度で20サブピクセル解像度で行うことができる。 z方向のビーズの動きを追跡するために、我々は、典型的には、核酸20に取り付けられたビーズの回折リングを撮像しながら、対物レンズの焦点面（OFP）は正確に垂直な方向にシフトされた第1、ゴスとコロッケによって設計された方法を使用。このようにして、較正プロファイルは、ビードとOFP 19との間の距離にビードの回折パターンを相関が生成される。この較正プロファイルが補間されると、ビーズの垂直変位はまた、数nmから20までの精度で測定することができる。私たちは、より洗練された追跡アルゴリズム37、38と同様に、複数のビーズ5、6、37の追跡をパラレルへの応用について説明し、追加の参照を読者に参照してください。
角座標に（x、y）は 、位置の変換に依存していた角度の追跡を使用するとき、我々は以下の手順を実行することをお勧めします。ビーズは使用の円形輪を描くする時間トレースから（x iは 、yのi）の位置（ここで、iは 、その後の測定点を表す指標）円の中心（x 0、y 0）とする半径R の円をフィットする最小化することにより（ 図2A）。
（3）
合計は、すべてのデータポイント上で実行される場所。 fitti後にngのX 0、Y 0、及びR 円は 、使用した時間トレース内の各データ点の極座標（rをiを、θi）を決定する。
（4）
（5）
1が±π、適切な場合の位相ジャンプを追加するには、 すなわち 、角度θを 「アンラップ」するように注意する必要があることに注意してください。 （R、θ）座標に（x、y）とのフィッティングと変換のためのカスタム書かれたコードは、要求に応じて作成者から提供されています。 FOMTにおいて、ビーズは円形の環状部をトレースする時間トレースは粗アライメント（参照：工程3.3）を達成し、ビーズの熱変動を記録することによって得ることができる。 MTTは、熱fluctu管理ポイントは、円環形をトレースするには不十分である。代わりに、磁石をゆっくりと（典型的には0.1 Hzで）式3-5を使用して円に合わせて数回転によって回転する時間トレースを使用しています。
我々は、 すなわち 、角追跡マーカー（ 図1c、図1d、図3a）を介して、または角度座標（内の（x、y）の位置の変換を介して、MTTのために、それは適切な角度トラッキングアプローチを選択することが重要であることに注意図1d、図2b）。典型的には、（x、y）は 、位置及びマーカービーズの使用からの角度トラッキングの精度は同等であるが、に記載のように、それは、クロストーク（x、y）の中に、角度でビードの変動の間に起こることを理解することが重要であるヤンセンらは 32：このように、（X、Y）位置からの角度の追跡が提供のみ有効であることに（Xのブラウンの変動、Y）座標の角度の不確実性、および（x、y）の追跡が側磁石の位置の調整を経由して回転トラップ剛性のチューニングが必要になる場合があり、その適切な使用のみに無視できる程度貢献しています。典型的には、より高い剛性トラップの使用は、マーカービーズを使用して、角度の追跡の使用を必要とする。マーカービーズの使用は（ステップ1.9の添付プロトコールを参照）使用可能なテザーの数を減らすことができる付加的な取り付け工程を必要とする。マーカービーズベースの追跡を使用する場合は、マーカービードが最良の結果を得るために、赤道付近に装着されている磁気ビーズを選択することが重要である。
既存の方法と応用に比べてFOMTおよびMTTのアプローチの重要性
上記において、我々は簡単にMTTまたはFOMTに器具を変換するための磁石構成を変更し、一つは、従来のMTから開始する方法を示している。この単純な男odification、角度追跡マーカーの使用が望まれる角度トラッキングの導入を伴うことができる、それはに応じて、トルクを加えるトルクを測定、またはねじれを測定することをユーザに許可するように、両方の構成の即時の強い点である手元の実験。冒頭で述べたように、FOMTも並列測定を5、の機能の恩恵を受け、特にMTTで、特にその単純、MTの既存の強みの多くからのMTTの利益の両方6（これらは与えられたように簡単にFOMTで達成されない円筒状の磁石の中心に対するテザーの位置合わせの要件）。注目すべきことに、MTTやFOMTは他の技術、特別に製造されたナノ粒子22、39、40、複雑な光学設計41、またはつなが内に追加のビーズの導入（DNA）分子42とは対照的に、必要としません。例えばOTHER技術は、それにもかかわらず、より高い時間分解能27、43、44のような他の利点を提供することができる。 DNA上の分子モーターの動作は、両方の影響を受けて、地元のねじれとトルクのための結果を持っているようFOMTおよびMTTの両方が、ゲノム処理の研究に将来のアプリケーションを見つける必要があります。追加アプリケーションは、DNAナノテクノロジー27の新興分野で、または生物学的処理7、45に積極的に回転モータの広い分野で見つけることができます。
| M270（R ビーズ = 1.4ミクロン） | のMyOne（R ビーズ = 0.5ミクロン） | アデムテック（Ademtech）（R ビーズ = 0.25ミクロン） | |
| 従来のMT（立方5×5×5mmの3対の磁石、1mmのギャップ、垂直配向） | 70 pNの | 8 pNの | 1.6 pNの |
| FOMT又はMTT（* 3本の円柱状の磁石の積層体、直径6mm、直径2mmギャップ） | 9 pNの | 1 pNで | 0.2 pNの |
| FOMT又はMTT（* 3本の円柱状の磁石の積層体、直径6mm、直径1mmギャップ） | 18 pNの | 2 PN | 0.4 pNの |
| FOMTまたはMTT *（最後の1と3の円筒状磁石スタックは、直径1mmのギャップをひっくり返さ） | 〜50 pNの | 9 pNの | 1.8 pNの |
* MTTの小さな側磁石の存在は、伸縮力にほとんど影響を持っている
表1。最大の力は、通常、異なる磁石構成とビードタイプに達成しました。
| R ビーズ = 1.4ミクロン | R ビーズ = 0.5ミクロン | R ビーズ =0.25ミクロン | |
| 摩擦係数* | 120 pNの·nmで·秒 | 5.5 pNの·nmで·秒 | 0.7 pNの·nmで·秒 |
| 特徴的な時間スケール：FOMT、10 kbpのDNA ** | 1200秒 | 55秒 | 7秒 |
| 特徴的な時間スケール：FOMT、1 kbpのDNA | 120秒 | 5.5秒 | 0.7秒 |
| 特徴的な時間スケール：MTT、K、Q = 100 pNの·NM / RAD | 1.2秒 | 0.06秒 | 0.007秒 |
| 特徴的な時間スケール：MTT、K、Q = 1000 pNの·NM / RAD | 0.12秒 | 0.006秒= 6秒 | 0.0007 S = 0.7ミリ秒 |
*「赤道」を通る軸の周りの回転のための摩擦係数（ 図1bに示される状況、すなわち）、Hはバッファの粘度である14·P·H·R ビード 3で与えられる。
** FOMTでは、回転トラップ剛性がDNAで、k qのねじり剛性によって与えられ、Cが有効なねじり持続長であるDNA = C·k個のBの T / L Cは 、（ここでは80nmであると仮定その中間の力体制、F〜1 PN）の特徴であり、L、Cは DNAの輪郭長であり、塩基対あたり0.34程度。
表2。摩擦係数とFOMTおよびMTTのための特徴的な時間スケール。
Disclosures
この作品に関連する特許は、参照PCT/NL2011/050446の下で提出されている。
Acknowledgments
この作品は、デルフト工科大学、科学研究費オランダ機構（NWO）、物質に関する基礎的研究財団、欧州科学財団によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
| Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
| Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
| Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
| Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
| Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
| Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
| Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
| Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
| Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
| Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
| Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
| Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
| Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
| Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
| High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
| Software for coding analysis routines | The Mathworks | MATLAB | custom-written routines are available from the authors |
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