Summary
Het manuscript beschrijft de stappen die nodig zijn om de heterotopische harttransplantatie uit te voeren in de muis.
Abstract
Het is nu meer dan veertig jaar geleden dat deze techniek voor het eerst werd gemeld door Corry, Wynn en Russell. Hoewel het duurde een aantal jaren voor andere laboratoria bekwamen in te worden en gebruik maken van deze techniek, is het nu veel gebruikt door vele laboratoria over de hele wereld. Een belangrijke verfijning van de oorspronkelijke techniek werd ontwikkeld en gerapporteerd in 2001 door Niimi. Hier beschreven, zijn de technieken die in de loop van meer dan een decennium in de handen van drie chirurgen (Plenter, Grazia, Pietra) in ons centrum. Deze technieken worden nu doorgegeven aan een jongere generatie van chirurgen en onderzoekers.
Grotendeels gebaseerd op de Niimi ervaring, hebben de procedures die vrijkomt bij de fijne details - details die we zullen trachten hier betrekking op zo'n manier dat anderen in staat zijn om deze zeer bruikbaar model te gebruiken. Net Niimi, hebben we ontdekt dat een video hulpmiddel bij het leren is een onbetaalbare bron voor de beginner.
Introduction
In een tijdperk waarin het mogelijk is om nier, long, lever en pancreas transplantaties uit te voeren in muizen, de hoeksteen van de fundamentele orgaantransplantatie en immunologie onderzoek sinds 1973 1-4 blijft heterotopisch harttransplantatie model in de muis. In de tussenliggende jaren zijn verschillende kranten zijn gepubliceerd detaillering verbeteringen / verfijningen 5,6 tot deze procedure.
Als een model van solide orgaan voornamelijk vascularized transplantatie deze procedure is ongeëvenaard. Zodra knie procedure leent voor onderzoek naar allogene afstotingsreacties 7, de ontwikkeling van chronische vasculopathieën 8 en de mechanismen van ischemie reperfusie schade 9.
De sleutels tot succesvol leren van deze procedure zijn net als elke andere operatie, geduld van de kant van de instructeur en de leerling en aandacht voor detail. Aan het begin van het proces de nieuwe chirurg dat they zal vele uren besteden aan elke transplantatie. Naarmate de ervaring toeneemt, zal chirurgische tijden, en dus ischemie, drastisch te verminderen. Met aandacht voor de details van elke stap zal vroeg of laat leiden tot succes.
Terwijl de instructeur hun best kunnen doen om door te geven, en te anticiperen, alle mogelijke valkuilen die bij deze operaties kunnen worden aangetroffen, zal de "creatieve" trainee waarschijnlijk vinden sommige van hun eigen!
De basis van de procedure zijn als volgt. De donor stijgend aortaboog end-to-side anastomose aan de ontvanger abdominale aorta en de longslagader donor end-to-side anastomose aan de ontvanger abdominale inferieure vena cava (IVC). Bloed stroomt van de begunstigde aorta retrograde wijze via donor aorta naar de coronaire slagaders. Nadat het bloed stroomde door het coronaire systeem het riool in het rechter atrium via de coronaire sinus wordt gepompt in de rechter ventrikel envervolgens via de longslagader naar de ontvanger IVC. Zo het coronaire systeem wordt geleverd arteriële en sinusritme terug naar het transplantaat in 1-2 minuten reperfusie. Aangezien de linker kamers van het hart zijn in wezen druk onder-loaded de linker ventrikel vrije wand zal verschrompelen na verloop van tijd.
Protocol
Alle dieren werden gehuisvest onder-pathogeen-vrije omstandigheden aan de Universiteit van Colorado Barbara Davis Center Animal Facility onder IACUC goedkeuring en verzorgd volgens de NIH richtlijnen.
Diepte van de anesthesie wordt beoordeeld door teen knijpen in eerste instantie en door de naleving van de ademhalingsfrequentie, zodra de procedure is begonnen.
1. Donorhart Harvest
- Verdoven van de donor muis door het injecteren van pentobarbital (60 mg / kg IP).
- Immobiliseren de muis door het 4-way beperkingen en knip de vacht. Veeg de huid met alcohol.
- Na het ontleden weg van de huid, opent de buikholte door een dwarse insnijding net inferieur aan het middenrif.
- Snijd het middenrif posterior aan ribben inbrengen en til de voorste borstwand ventraal en superiorly blootstellen van het hart.
- Verleng een volledige dikte verknipt de posterieure laterale borstholte aan de linker-en rechterkant van de borst.
- Isoleer deonderste vena cava (IVC) en plaats een losse 5-0 zijden hechtdraad in de IVC naast de insertie in het rechter atrium.
- Injecteer 1,0 cc van 4 ° C gehepariniseerde zoutoplossing (200 u / cc) in de IVC, dan afbinden het vat met de 5-0 zijden hechtdraad en delen.
- Isoleer de rechter superieure vena cava (rSVC) op dezelfde manier en afbinden met 5-0 zijden hechtdraad en delen.
- Schud het hart naar de rechterkant van de dieren en het isoleren van de linker vena cava superior (lSVC), afbinden met een 5-0 zijden hechtdraad en verdeel het blootstellen van de linker longslagader.
- Beveilig het hart onder een natte gaasje terwijl de thymus is stomp verwijderd van de belangrijkste longslagader (PA) en de linker en rechter PA takken ontleed en oplopende aortaboog.
- Blunt ontleden de aortaboog vrij van de omliggende weefsels. Micro-schaar worden gebruikt om de proximale aorta verdelen rechts brachialis-cefale arterie, dwz er mogen geen vertakkingen tussen het hart en de verdelingpunt van de aorta.
- Dit gedeelte van de aorta-boog vormt de arteriële manchet voor het implantaat proces.
- Afspiegeling van de aorta manchet inferiorly aan de PA romp en links en rechts takken van de PA bloot.
- Stompe ontleden de linker en rechter PA takken van het omringende weefsels ver van het hart mogelijk. Dit maakt gemakkelijke ontleding van de PA stam van omringende weefsels.
- Verdeel de PA romp zo distaal mogelijk, net proximaal van de splitsing. Dit gedeelte van de longslagader vormt de veneuze manchet voor het implantaat proces.
- Plaats een 5-0 zijden hechtdraad rond de basis van het hart en stropdas. Het hart wordt dan vrij gesneden op de basis, en geplaatst in 4 ° C zoutoplossing. Totale oogst is ca.. 10-15 min.
2. Hart Implant Techniek
- Verdoven de ontvangende muizen met pentobarbital (60 mg / kg IP initiële dosis 25 mg / kg IP supplementaire dosis indien nodig).
- Knip de vacht enimmobiliseren de muis door het 4-way beperkingen en prep de huid met povidonjood en laken in een steriele wijze.
- Maak een 2 cm middellijn verticale incisie in de buik en vul de buikholte.
- Trek de darm superieur en naar buiten gebracht op de borst. Houd verpakt in steriele vochtig gaas (steriele zoutoplossing) gedurende het geval.
- Isoleer de abdominale aorta en inferior vena cava (IVC) in de niervaten en plaats 4-0 katoen banden rond de aorta en IVC beter dan inferieur aan de anastomosisplaats.
- Elke lumbale schepen binnen het veld te identificeren en afbinden met 10-0 nylon hechtdraad.
- Knoop de katoenen banden, eerst de inferieure, gevolgd door de leidinggevende. Zo bloed wordt vastgehouden in de aorta die de aortotomy vergemakkelijken.
- Vorm het aortotomy met een 30 G naald in het lumen van de aorta voeren. Verleng de incisie met fijne micro schaar om een lengte van ongeveer 2 mm. De incisie wordt gemaakt in een rechte lijn langs de langeitudinal as van het vat.
- Maak een einde aan de zijkant anastomose van de donor aorta aan de ontvanger aorta in de volgende mode. Plaats een 10-0 nylon hechtdraad verblijf steek in de donor aorta en de inferieure hoek van de incisie in de ontvanger aorta en stropdas. Plaats een tweede 10-0 nylon tegenover de eerste in de donor aorta en de superieure hoek van de incisie in de abdominale aorta en stropdas.
- Maak een draaiende hechting van superieur aan inferieure in de laterale wand van de aorta en stropdas tegen de eerder geplaatste verblijf steek. Zorg ervoor dat u de Intimas (oppervlakte binnenvat) bij elkaar te brengen als je steek. Hechten dan de mediale zijde in een lopende mode en stropdas. De eerste en laatste steek aan weerszijden dient zo verblijf steken mogelijk geplaatst. Probeer vervolgens 3 st gelijkmatig tussen beide tot een totaal van 5 hechtingen.
- Maak een einde aan de zijkant anastomose van de donor longslagader naar de ontvanger IVC in de volgende mode. PunctUre het IVC met een 30 G naald en uitbreiden van de incisie voor ca. 2 mm met fijne micro schaar. De incisie wordt gemaakt in een rechte lijn langs de langsas van het vat.
- Bind de donor longslagader naar de inferieure hoek van de incisie in de IVC met 10-0 nylon. Plaats een tweede 10-0 nylon tegenover de eerste in de donor slagader en de superieure hoek van de incisie in de IVC en stropdas.
- Maak een draaiende hechting tussen de longslagader en de IVC en stropdas. De eerste en laatste steek aan weerszijden dient zo verblijf steken mogelijk geplaatst. Probeer vervolgens 5 st gelijkmatig tussen beide tot een totaal van 7 hechtingen.
- Laat de distale 4-0 katoen tie het herstel van veneuze flow.
- Zodra hemostase van de veneuze anastomose is waargenomen de proximale 4-0 katoen stropdas geleidelijk losgemaakt en de arteriële anastomose waargenomen voor hemostase. Wanneer beide anastomosen veilig worden beschouwd, verwijdert u de cotton banden van de muis.
- De terugkeer van de darm naar de buik. De buikwand is gesloten in twee lagen met behulp van 5-0 zijden hechtdraad in een actieve manier.
- Dien een 1,0 ml bolus van steriele, warme fysiologische zoutoplossing in de buik als vochttoediening bij het sluiten, en 0,8 ml normale fysiologische zoutoplossing wordt subcutaan postoperatief geïnjecteerd. Geen andere ondersteunende maatregelen nodig zijn tijdens de operatie. Recover het dier op een warmtedeken. Totaal implantaat is ca.. 90-120 min voor beginners, 45-60 min. met ervaring. Dien buprenorfine analgesie, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml aan het begin van de procedure en elke 6-12 uur gedurende 72 uur na de operatie.
3. Graft assessment
- Beoordelen graft function dagelijks door trans-abdominale palpatie.
- Houd de muis alsof het moeten worden om intraperitoneale injectie.
- Druk zachtjes op het topje van een wijsvinger tegen de buikwand en na te gaan de kloppende strength en regelmatigheid van het transplantaat.
- Geef palpatie kwaliteit een score van 4 (normale amplitude en frequentie) op 0 (niet-kloppend afgewezen graft).
BELANGRIJKE OPMERKINGEN:
Alle instrumenten worden gesteriliseerd, steriele handschoenen worden gedragen tijdens de gehele procedure en een steriel veld wordt gehandhaafd. De donor en ontvanger operaties worden uitgevoerd met gebruik van een operatiemicroscoop. Zorg ervoor dat de anastomosen zijn "schone". Dat is, dat de achterwanden niet gevangen bij het plaatsen st. Dit zal leiden tot een significante vernauwing aan die zal meer dan waarschijnlijk resultaat vloeien in een mislukte ent en in extreme gevallen tot achterste ledematen verlamming. Het is ook van vitaal belang dat volledige dikte passeert waaronder de vasculaire adventitia en de intima van de hechtdraad naald worden bereikt. Evertion van de randen zorgt dat er intima-aan-intima contact, hetgeen helpt bij het afdichten en genezing van de anastomose. Een ander vitaal belang feitof is ervoor te zorgen dat de spanning van de anastomose sutuurlijnen is optimaal. Te los en er zal onomkeerbaar lekken zijn, te strak en vernauwing te stromen zal resulteren. Als aan de arteriële kant zal dit leiden tot een slechte doorbloeding van het transplantaat, indien aan de veneuze zijde een overbelaste hart zal leiden.
Representative Results
Het gebruik van deze chirurgische techniek opent de weg voor zowel eenvoudige graft survival / afwijzing studies, of heel complexe experimentele protocollen. In het onderzoek kort beschreven in de onderstaande figuur, zochten we de betrokkenheid te bepalen, indien aanwezig, van Fas en / of perforine als mechanismen van CD4 T-cel gemedieerde cardiale afwijzing. Dit werd mogelijk gemaakt door de buitengewone reeks muis stammen die vandaag beschikbaar zijn. Resultaten tonen aan dat de directe afwijzing van cardiale allogene door CD4-effector-T-cellen nodig de alternatieve bijdrage van graft Fas expressie en T-cel perforine expressie. Voor zover ons bekend, is dit de eerste demonstratie dat cytolytische activiteit van CD4 T-cellen een obligaat rol voor primaire acute allograftafstoting in vivo kunnen spelen.
1.jpg "/>
. Figuur 1 Perforine en Fas Represent Verplichte en Parallelle Wegen van CD4 T-cel gemedieerde Cardiac Afwijzing B6, B6 PFPKO (perforine knock-out), en B6 gld (Fas-ligand deficiënt) CD4 T-cellen werden gebruikt om B6 rag reconstrueren - / - ontvangers van C3H wild type of Fas-deficiënte C3H lpr cardiale transplantaten. Verwijdering van Fas alleen (♦, p = NS versus controle Wt C3H + B6 CD4 T-cellen) van de donor harten of verwijdering of perforine alleen van de CD4 T-cellen (■, p = NS versus controle Wt C3H + B6 CD4 T cellen) niet afschaffen afwijzing. Interessant is dat de verwijdering van FasL van effector CD4 T-cellen hebben vertraging afstoting aanzienlijk (●, p <0,02 vs G C3H + B6 CD4 T-cellen, p <0,01 vs G C3H + B6 PFPKO CD4 T-cellen en p <0,01 vs . C3H lpr + B6 CD4 T-cellen). Echter, werden de meeste allografts steeds afgewezen (4 of 5). Aanzienlijk, de gelijktijdige verwijdering van donor Fas en CD4 T-cel perforinevolledig afgeschaft afwijzing (○, p <0.002 versus controle Wt C3H + B6 CD4 T-cellen, Wt C3H + B6 PFPKO CD4 T-cellen, en C3H lpr + B6 CD4 T-cellen). Deze intrekking aanzienlijk robuuster dan de afzonderlijke verwijdering van CD4 T-cel FasL was (○, p <0.003 versus controle Wt + B6 C3H gld CD4 T-cellen). Van Grazia et al. 10. Met toestemming overgenomen.
Discussion
Deze chirurgische techniek is niet gemakkelijk onder de knie, maar eenmaal onder de knie is een krachtig onderzoeksinstrument. De onderzoeker / chirurg wordt beloond door de samenhang van techniek en door de aandacht voor detail. Geduld tijdens de leerfase is de sleutel. Zoals gepubliceerd door Niimi 3, met behulp van een video gebaseerde leermiddel duurt gemiddeld 11 pogingen om de eerste succesvolle behandeling en 78 pogingen om een 90% slagingspercentage behalen bereiken. Video's zijn een belangrijk leermiddel in de chirurgie 11,12 geworden.
Problemen oplossen
Bloeden uit de anastomose optreden en dit is waarschijnlijk te wijten aan een gebrek aan juiste spanning in de hechtingen of te weinig hechtingen. Terwijl een stolling inducerend middel zoals Gelfoam nuttig voor het verminderen van lekken kan zijn, raden wij aan dat de chirurg moet rekenen op een goede techniek. Overbelaste niet-kloppend hart is meestal te wijten aan anastomosen die te strak zijn, met name op de veneuze zijde. Een niet-beating niet-geperfundeerde transplantaat wordt meestal veroorzaakt door een luchtbel die bezocht in een van de kransslagaders. Het is belangrijk om een damp-naar-nat handhaven; om de invoer van bellen in de vaten te voorkomen.
Beperkingen van de Techniek
Deze techniek is niet geschikt als een onderzoeker wil effecten op een volledig functionerend hart onderzoeken. Dat zou een orthotope transplantatie techniek die tot nu toe onmogelijk is gebleken voeren vereisen.
Belang met betrekking tot bestaande methoden
Wil men de effecten op een volledig gevasculariseerd, solide orgaantransplantatie in de muis te bestuderen, dan is het hart model is waarschijnlijk de eenvoudigste om te overmeesteren. Muismodellen van long-, nier-en levertransplantatie bestaan, maar zijn veel moeilijker te leren en perfect.
Kritische stappen Binnen het Protocol
Het is van vitaal belang dat volledige dikte pezels, waaronder het vasculaire adventitia en de intima van de hechtdraad naald worden bereikt. Evertion van de randen zorgt dat er intima-aan-intima contact, hetgeen helpt bij het afdichten en genezing van de anastomose. Een andere factor is van vitaal belang te waarborgen dat de spanning van de anastomose sutuurlijnen is optimaal. Te los en er zal onomkeerbaar lekken zijn, te strak en vernauwing te stromen zal resulteren. Als aan de arteriële kant zal dit leiden tot een slechte doorbloeding van het transplantaat, indien aan de veneuze zijde een overbelaste hart zal leiden.
Boven alles, zal herhaling, consistentie van de procedure en de voortdurende aandacht voor detail goede resultaten en financierbaar en publiceerbaar maken van gegevens opleveren.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen dr. Biagio Pietra bedanken voor zijn eerdere werk in ons lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5 m spool | 18020-50 | ||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Biogel from Medex Supply | ||
| Drapes | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | B-D 1 cc insulin, #329424 | ||
| Cotton applicators | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | PDI, #B40600 | ||
| 4/0 Cotton ties | Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5 (1), 733 (1973).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343 (1973).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3,000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123 (2001).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. J Invest Surg. 26 (4), 223 (2013).
- Su, S., et al. Modified suture technique in a mouse heart transplant model. Asian J Surg. 34 (2), 86 (2011).
- Mao, M., et al. A novel and knotless technique for heterotopic cardiac transplantation in mice. J Heart Lung Transplant. 28 (10), 1102 (2009).
- Csencsits, K. L., Bishop, D. K. Contrasting alloreactive CD4+ and CD8+ T cells: there's more to it than MHC restriction. Am J Transplant. 3 (2), 107 (2003).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2 (3), 471 (2007).
- Linfert, D., Chowdhry, T., Rabb, H.
- Grazia, T. J., et al. Acute cardiac allograft rejection by directly cytotoxic CD4 T cells: parallel requirements for Fas and perforin. Transplantation. 89 (1), 33 (2010).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Plenter, R. J.
