Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) परिपक्वता का अध्ययन neuronal आबादी की आनुवंशिक लक्ष्यीकरण पर निर्भर करता है. हालांकि, विशिष्ट neuronal उपप्रकारों के लिए ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति को सीमित करने के कार्य की वजह से विशिष्ट प्रमोटर तत्वों के सापेक्ष कमी उल्लेखनीय चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है. GABAergic interneurons व्यापक आनुवंशिक और रूपात्मक विविधता के साथ एक neuronal जनसंख्या का गठन. दरअसल, GABAergic interneurons के 11 से अधिक विभिन्न उपप्रकारों माउस प्रांतस्था 1 में लक्षण वर्णन किया गया है. यहाँ हम GABAergic आबादी के चुनिंदा लक्ष्यीकरण के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम homeobox प्रतिलेखन के बढ़ाने तत्व का उपयोग करके GABAergic interneurons के उप चयनात्मक लक्ष्यीकरण हासिल utero electroporation में विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से ड्राइव करने के लिए Dlx5 और Dlx6, ड्रोसोफिला बाहर का कम (DLL) जीन 2,3 की homologues, कारकों.
Introduction
कॉर्टिकल GABAergic interneurons की थोक औसत दर्जे का है और दुम ganglionic eminences (क्रमशः MGE और CGE) नामक दो क्षणिक भ्रूण संरचनाओं से उत्पन्न 4. Parvalbumin और सोमेटोस्टैटिन व्यक्त interneurons interneurons CGE से उत्पन्न व्यक्त Calretinin जबकि MGE (सीआर), Vasointestinal पेप्टाइड (वीआईपी) और Reelin (आरई) में आरंभ. ये interneuron उपप्रकार उनके birthdates से प्रतिष्ठित किया जा सकता. MGE व्युत्पन्न उपप्रकार भ्रूण दिन 9.5 (E9.5) और e16.5 5,6 के बीच पैदा होते हैं. इसके विपरीत, CGE व्युत्पन्न interneurons उनके उत्पादन E15.5 6 पर बढ़ता जा साथ E18.5 से E12.5 से पैदा होते हैं. यह देर से पैदा हुए आबादी की आनुवंशिक लक्ष्यीकरण, तथापि, मायावी बनी हुई है.
murine बाहर का कम (DLX) जीन विशेष रूप से विकासशील उदर अग्रमस्तिष्क 3 में व्यक्त कर रहे हैं. GABAergic interneurons और striatal प्रक्षेपण न्यूरॉन्स लेकिन नहीं कॉर्टिकल पिरामिड कोशिकाओं Dlx1 व्यक्त, जल्दी विकास के चरणों 3 में 2,5, और 6 जीन. दरअसल, DLX जीन सभी GABAergic progenitors में MGE और CGE subventricular क्षेत्र (SVZ) में व्यक्त कर रहे हैं. इन जीनों की अभिव्यक्ति postmitotic चरणों 7-9 पर उपप्रकार को चुनने के लिए सीमित हो जाता है. पिछले प्रयोगात्मक सबूत Dlx5 / 6 बढ़ाने तत्व ट्रांसजेनिक माउस मॉडल 2 में GABAergic प्रजातियों के चुनिंदा लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है कि पता चला है. हम विकासशील माउस मस्तिष्क में episomal अभिव्यक्ति के संदर्भ में इन बढ़ाने तत्वों में से एक का उपयोग परीक्षण किया. हम एक न्यूनतम प्रमोटर और एक bluescript (बी एस) रीढ़ प्लाज्मिड में बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) (चित्रा 1) के साथ मिलकर Dlx5 / 6 बढ़ाने तत्व क्लोन उप. हम चुनिंदा Cr-, वीआईपी लक्षित करने के लिए E15.5 पर utero में electroporation के माध्यम से प्लाज्मिड शुरू की है और पुनः 3,8,10 उपप्रकार. हमारी तकनीक की सुविधा जो विरल electroporation, के लिए अनुमति देता हैझुलसाना कोशिकाओं की रूपात्मक सुविधाओं के पुनर्निर्माण. इसके अलावा, कॉर्टिकल GABAergic न्यूरॉन्स में जीन अभिव्यक्ति की असाधारण उच्च स्तर कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है. हम नुकसान और कई जंगली प्रकार और प्रमुख नकारात्मक जीन 11 का उपयोग करते हुए समारोह के अध्ययन के लाभ से बाहर किया.
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Protocol
सभी जानवरों को चिकित्सा के NYU स्कूल की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के नियमों और दिशा निर्देशों के अनुसार इलाज किया गया.
माउस उपभेदों
Taconic द्वारा प्रदान स्विस वेबस्टर मादा चूहों इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया. विशेष रूप से सतही परत interneurons को लक्षित करने के लिए, E15.5 भ्रूण का इस्तेमाल किया गया.
नोट: मानक क्लोनिंग तकनीक का उपयोग कर उत्पन्न किया गया यह काम (Dlx5 / 6.eGFP प्लाज्मिड 3 माइक्रोग्राम / μl) में इस्तेमाल किया प्लाज्मिड. EGFP सीडीएनए एक Dlx5 / 6 Pmin-Pólya प्लाज्मिड में क्लोन किया गया था. यह प्लाज्मिड अनुरोध (demarn02@nyumc.org) पर उपलब्ध है.
Microinjection pipettes के 1. तैयारी
- 860 को खींचने हीट # 2 सेट.
- प्लेस और फिलामेंट के पास गिलास केशिका सुरक्षित. पिपेट की बाहरी व्यास (ओवर ड्राफ्ट) लगभग 30 माइक्रोन है कि जाँच करें.
- "खींच" बटन दबाएँ.
- ध्यान से केशिका हटा दें. नीचे हिस्से सुई है. शीर्ष भाग त्यागें.
2 संज्ञाहरण प्रक्रिया
- एक isoflurane युक्त कक्ष तैयार. नोट: Isoflurane इसकी वजह से तेजी से कार्रवाई और दुष्प्रभाव का कम भार के लिए पसंदीदा संवेदनाहारी है. Pentobarbital एक और विकल्प है; हालांकि, इस दवा की सहिष्णुता चर रहा है और isoflurane तुलना में एक उच्च मृत्यु दर को जन्म दे सकती है.
- 0.5-1 एल / मिनट ओ 2 में 4-5% की isoflurane के प्रवाह निर्धारित करें.
- सिर एडाप्टर के लिए वाल्व बंद कर दिया है जबकि चैम्बर के लिए वाल्व खुला है कि सुनिश्चित करें.
- कक्ष में गर्भवती माउस रखें.
- माउस संज्ञाहरण के प्रभाव के नीचे जाने की अनुमति दें. इस बारे में 2-3 मिनट का समय लगेगा. साँस लेने की दर की जाँच करें. माउस hyperventilating शुरू होता है, isoflurane की खुराक कम है.
- माउस anaesthetized है, के बाद तुरंत कक्ष से हटा दें. हीटिंग पैड पर यह उदर पक्ष प्लेस और मैंसर्जरी के दौरान isoflurane आपूर्ति जारी रखेगा कि नकाब में सिर nsert. सिर एडाप्टर टुकड़ा जोड़ने ट्यूबिंग को कक्ष से isoflurane के प्रवाह स्विच करने के लिए सुनिश्चित करें. हर आंख में आंख चिकनाई की एक बूंद रखो और आँखें बंद करो.
- हाइपोथर्मिया को कम से कम 36 डिग्री सेल्सियस डिग्री हीटिंग पैड सेट करें.
- रियर पंजे और पूंछ pinching द्वारा पैर और पूंछ सजगता के अभाव के लिए जाँच करें.
3 सर्जरी
- 70% इथेनॉल के साथ पेट को कवर त्वचा को साफ.
- ऊपर की तरफ त्वचा खींच संदंश का प्रयोग करें. प्रत्येक सर्जरी के बाद, डिटर्जेंट और पानी के साथ सभी उपकरणों धोने, और 72 ° कंपनी / एन में निष्फल.
- स्तन ग्रंथियों के तीसरे और चौथे जोड़े के बीच रास्ते के मध्य में शुरू होने वाले midline के साथ एक छोटे ऊर्ध्वाधर चीरा (लगभग 2 सेमी) बनाते हैं. ठीक सर्जरी कैंची का प्रयोग करें. पेट की दीवार को नुकसान नहीं करने के लिए ध्यान रखना.
- धीरे पेरिटोनियम से त्वचा को अलग.
- धमनियों कल्पनाऔर पेट की दीवार पर नसों. उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए (जहाजों से बचने) पेरिटोनियम के माध्यम से एक और 2 सेमी ऊर्ध्वाधर चीरा.
- धमनियों clamping परहेज प्रत्येक पक्ष पर त्वचा और पेट की दीवार दबाना. नोट: धमनियों गलती से हवा निकाल रहे हैं, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या isoflurane अधिक मात्रा प्रदर्शन से पशु तुरंत त्याग.
- 37 डिग्री सेल्सियस तक बाँझ पीबीएस गर्म पूर्व. किम पोंछे नम पीबीएस के साथ clamps कवर.
- पीबीएस के साथ संपर्क में उदर गुहा moisturize. सर्जरी प्रदर्शन करते हुए इस कदम को कई बार दोहराएँ.
- दौर संदंश का प्रयोग, धीरे दूर गुहा से भ्रूण श्रृंखला (E15.5) खींच. गीले पोंछे पर श्रृंखला बाकी चलो. पहले गर्भाशय से एक आधा उजागर द्वारा शुरू करो. इसमें भ्रूण electroporated कर रहे हैं एक बार, अंदर इसे वापस लाने के लिए तो दूसरी छमाही पर काम करते हैं.
4 Electroporation
- भ्रूण में हेरफेर करने के दौर संदंश का उपयोग जारी है.
- वीआईपार्श्व ventricles sualize. midline (चित्रा 1 बी) के साथ चलाने के पार्श्व ventricles.
- फास्ट ग्रीन (शेयर: 10% w / वी) जोड़ें एक 01:20 मिश्रण के लिए डीएनए समाधान करने के लिए इंजेक्शन के दौरान यह कल्पना करने के लिए. आसुत जल में एक मानक मैक्सी प्रस्तुत करने का शोधन प्रोटोकॉल से प्राप्त गोली भंग करके डीएनए समाधान तैयार है.
- फास्ट ग्रीन के साथ डीएनए समाधान (Dlx5 / 6 EGFP, 3 माइक्रोग्राम / μl) के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन करने के लिए एक सवार के साथ पूर्व खींचा micropipettes का प्रयोग करें. पिपेट लोड करने से पहले सुई की नोक के अंत तक कंधे की शुरुआत से 6 मिमी लंबाई को छोड़ने के लिए एक ठीक forcep # 5 (Dumont) के साथ micropipette की नोक काटें. दौर चिमटी के साथ भ्रूण का सिर पकड़. Midline के पास स्थित पार्श्व वेंट्रिकल के लिए लक्ष्य एक 45 डिग्री के कोण पर विंदुक के साथ मस्तिष्क लिखें. सुई वेंट्रिकल के माध्यम से प्रवेश अगर आप डीएनए इंजेक्षन सवार उपयोग के रूप में, धीरे धीरे पिपेट वापस लेना. निलय हरी बारी चाहिए जबसमाधान यह भरने के लिए शुरू होता है. इस बिंदु पर, पिपेट बढ़ रोकने और डीएनए के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन. धीरे, पिपेट वापस ले लें.
- 950 मिसे के अंतराल पर 50 मिसे के पांच 45V दालों को CUY21 electroporator सेट करें.
- E15.5 भ्रूण के लिए 5 मिमी चप्पू इलेक्ट्रोड का उपयोग करें. कुशल वर्तमान संचरण सुनिश्चित करने के लिए पीबीएस में इलेक्ट्रोड डुबकी.
- डीएनए समाधान युक्त निलय पर सकारात्मक चप्पू से भ्रूण के सिर के चारों ओर इलेक्ट्रोड paddles रखें. थोड़ा ganglionic eminences के माध्यम से एक उदर वर्तमान बनाने के लिए नकारात्मक एक के सम्मान के साथ सकारात्मक चप्पू कम है. इस हेरफेर पिरामिड कोशिकाओं में अस्थानिक अभिव्यक्ति कम कर देंगे.
- इलेक्ट्रोड रखने के बाद, एक बार पैर पेडल दबाकर एक नाड़ी पहुँचा.
- इलेक्ट्रोड निकालें और उन्हें साफ पोंछे. दोहराएँ प्रत्येक भ्रूण के साथ 4.6-4.9 कदम.
- सभी भ्रूण electroporating के बाद, उदर गुहा में पीबीएस के 3 मिलीलीटर डालना और उदर गुहा में उन्हें वापस.
- सबसे पहले सीवन एक घुमावदार सुई और 5-0 रेशम सिवनी और फिर त्वचा के साथ पेट की दीवार. घाव पर Lidocaine (4%) लागू करें. Analgesia के लिए एस्पिरिन इंट्रा पेरिटोनियम से 120 मिलीग्राम / किग्रा प्रशासन.
नोट: इस पूरी प्रक्रिया में 20 मिनट या उससे कम समय में किया जाना चाहिए. यह शुरुआती के केवल छोटे आपरेशन समय रखने के लिए कुछ भ्रूण electroporate कि सलाह दी जाती है. लम्बे समय तक सर्जरी भ्रूण के जीवित रहने की दर में कमी होगी. - संज्ञाहरण ट्यूबिंग से पशु निकालें और एक कागज पर हीटिंग पैड पर वसूली मिटा देते हैं.
- , पिंजरे में पशु लौटें 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग पैड पर रखने और स्वास्थ्य की स्थिति पर नजर रखने के. जानवरों आम तौर पर सर्जरी अच्छी तरह सहन और वे संज्ञाहरण ट्यूबिंग से हटा रहे हैं के बाद जल्द ही धीरे से स्थानांतरित करने के लिए शुरू करते हैं. अत्यधिक रक्तस्राव या सुस्ती मनाया जाता है, IACUC ऐसे ग्रीवा अव्यवस्था या संज्ञाहरण अधिक मात्रा के रूप में इच्छामृत्यु प्रक्रियाओं अनुमोदित प्रदर्शन से तुरंत पशु बलि.
- चिरायु को पिंजरे लौटेंrium. महिलाओं जन्म स्वाभाविक रूप से दे देंगे.
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Representative Results
हम परिपक्व न्यूरॉन्स की कोशिका प्रकार विशिष्ट लक्षित प्राप्त करने में utero electroporation तकनीक रूपांतरित किया. CGE व्युत्पन्न interneurons में EGFP की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए, हम Dlx5 / 6 बढ़ाने तत्व का इस्तेमाल किया और E15.5 करने के लिए हमारे इंजेक्शन प्रतिबंधित, चरण CGE व्युत्पन्न interneurons के बहुमत उत्पन्न कर रहे हैं. हम P8 पर विश्लेषण किया जाता है और P15 11 (आंकड़े 1 और 2). हम E15.5 पर equimolar सांद्रता में एक सीएजी-mCherry और एक Dlx5 / 6 EGFP plasmids electroporating सह द्वारा electroporated न्यूरॉन्स के उदर मूल की पुष्टि की. इस प्रयोग में, हम subventricular क्षेत्र (SVZ) के सह में स्थित केवल उदर progenitors दोनों प्रोटीन 11 व्यक्त कि मनाया. फ्लोरोसेंट प्रोटीन का यह स्थानिक लौकिक अभिव्यक्ति निलय लेकिन subventr में व्यक्त नहीं कर रहे हैं जो Dlx5 और 6 जीन की सामान्य विकास अभिव्यक्ति, साथ मेल खाता हैicular जोन 4. इसके अलावा, हम एक GAD67-EGFP Knockin माउस लाइन में Dlx5 / 6 mCherry electroporated interneurons की GABAergic पहचान का आकलन किया. हम electroporated न्यूरॉन्स के विशाल बहुमत GAD67, सभी GABAergic कोशिकाओं 11 द्वारा व्यक्त एक एंजाइम व्यक्त पाया. इसके अलावा, हम P15 पर immunohistochemistry और electrophysiological विश्लेषण प्रदर्शन से electroporated interneurons के उप प्रकार पहचान निर्धारित की. उप प्रकार विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति के पैटर्न cryostat वर्गों 11 (चित्रा 2) में immunofluorescence से पता चला था. हम E15.5 पर electroporated interneurons लगभग विशेष NPY, Reelin, वीआईपी और सीआर व्यक्त पाया कि, पहले से CGE व्युत्पन्न interneuron मार्करों 6 का वर्णन किया. इसके अलावा, इन न्यूरॉन्स की आंतरिक electrophysiological गुण पहले से भाग्य मानचित्रण पढ़ाई 6,11 में वर्णित एक साथ समझौते में हैं. सब एक साथ, इन परिणामों कि electropo का संकेतE15.5 पर Dlx5 / 6 बढ़ाने तत्व के साथ राशन चुनिंदा CGE व्युत्पन्न interneuron उपप्रकार लक्ष्य.
Electroporation प्रयोगों की 1 योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा. एक) आरेख प्रयोगात्मक रणनीति illustrating) Dlx5 / 6 EGFP प्लाज्मिड. बी के लिए रणनीति subcloning.
चित्रा 2 Electroporated interneurons CGE व्युत्पन्न उप प्रकार मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा चित्रित कर रहे हैं. ए) CGE व्युत्पन्न interneurons एक Dlx5 / 6 EGFP प्लाज्मिड साथ electroporated. विविध CGE उपप्रकार की विरल electroporation. बी) P8 पर एक वीआईपी व्यक्त interneuron नोट. EGFP अभिव्यक्ति रूपरेखा बनाती हैपूरे dentritic पेड़ और एकल न्यूरॉन्स की axonal कुंज. सी) P8 पर एक NPY व्यक्त interneuron. NPY अभिव्यक्ति neurogliaform कोशिकाओं. डी) P15 पर एक NPY व्यक्त interneuron रूपरेखा बनाती है. स्केल बार ए, 100 मिमी; बी, 50 मिमी
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Discussion
तकनीक की सीमाएं
इस तकनीक को सेल प्रक्रियाओं की सेल स्वायत्त विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, यह जनसंख्या के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है. electroporations मस्तिष्क प्रति electroporated कम से कम एक हजार कोशिकाओं के साथ बहुत विरल हैं. एक परिणाम के रूप में, तकनीक CGE व्युत्पन्न interneurons की आनुवंशिक हेरफेर से उत्पन्न होने वाले व्यवहार के परिणामों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता.
Electroporations E13.5-E14.5 लक्ष्य MGE व्युत्पन्न उपप्रकार में किए गए जबकि, दक्षता कम 10 है. हम Dlx5 / 6 बढ़ाने कम से कम episomal अभिव्यक्ति के संदर्भ में postmitotic MGE उपप्रकार में कम सक्रिय है कि अटकलें.
मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व
तकनीक interneurons के अध्ययन के लिए पहले से electroporation के तरीकों 12,13 से उन्नति का प्रतिनिधित्व करता है. कारण उनके रिश्तेदार कमी और उदर भ्रूण कोएनआईसी की उत्पत्ति, न्यूरॉन्स की इस आबादी को लक्षित करने के लिए मुश्किल साबित हो गया है. हमारी तकनीक CGE व्युत्पन्न interneurons की सेल स्वायत्त विश्लेषण बाहर ले जाने के लिए साधन प्रदान करता है. EGFP अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को भी interneurons का दृश्य और विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं.
भविष्य के अनुप्रयोगों
विशिष्ट प्लास्मिड और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों के उपयोग के संयोजन से यह ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति में अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण प्राप्त करने के लिए संभव है. उदाहरण के लिए, हम teto inducible transgenes की अभिव्यक्ति पर बारी करने के लिए एक Dlx5 / 6 टीटी A प्लाज्मिड इस्तेमाल किया. इन प्रयोगों में, हम डॉक्सीसाइक्लिन 8 administrating द्वारा transgene अभिव्यक्ति मौन करने में सक्षम थे. वर्तमान में हम CreER प्रणाली के साथ संयोजन में तकनीक का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित कर रहे हैं.
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
कुशल electroporation और अस्तित्व को प्राप्त करने के लिए, Exces से बचने की कोशिशभ्रूण और / या अंगों के हेरफेर निर्णायक. इसके अलावा, धमनियों और नसों बन्द रखो बचें. खून बह रहा होता अगर माउस जल्दी hypovolemic बन जाएगा. Electroporation के बाद पूरा हो गया है, तो आप हाइपोक्सिया का कारण बन सकता है कि पैदा सनक से बचने के लिए उन्हें मिल गया है, जहां एक ही स्थिति में भ्रूण और अंगों की जगह है. 20 मिनट या उससे कम सर्जरी समय के लिए निशाना लगाओ. सर्जरी के दौरान पीबीएस कई बार साथ उदर गुहा moisturize. Electroporation के दौरान, केशिका सुई के साथ केवल एक बार वेंट्रिकल पंचर करने की कोशिश. दोहराए puncturing जीवित रहने की दर में कमी होगी. प्रशिक्षण अवधि के बाद, जीवित रहने की दर 80% या अधिक होना चाहिए.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम तकनीकी सहायता के लिए Lihong यिन के लिए आभारी हैं. NVD एक NARSAD युवा अन्वेषक पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है और भी एनआईएच (5 K99 MH095825-02) से अनुदान द्वारा समर्थित है. Fishell प्रयोगशाला में अनुसंधान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, मानसिक स्वास्थ्य (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09) के राष्ट्रीय संस्थान, मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक (5 R01 NS081297-02 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित है 1 P01 NS074972 -01A1) और सिमंस फाउंडेशन.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
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