Abstract
중추 신경계 (CNS) 성숙의 연구는 신경 세포 집단의 유전자 타겟팅에 의존한다. 그러나, 특정 신경 세포 아형의 관심의 유전자의 발현을 제한하는 작업으로 인해 특정 프로모터 요소의 상대적 부족에 현저 도전 입증되었다. GABA 성의의 interneurons 광범위한 유전 적, 형태 적 다양성을 가진 신경 세포의 인구를 구성한다. 실제로, GABA 성의의 interneurons의 11 개 이상의 서로 다른 하위 유형 마우스 피질 한 것을 특징으로하고있다. 여기에서 우리는 GABA 성 인구의 표적으로 선택에 대한 적응 프로토콜을 제시한다. 우리는 호 메오 박스 (homeobox) 전사의 증강 요소를 사용하여 GABA 성의의 interneurons의 하위 표적으로 선택 달성 자궁 일렉트로 특정 유전자의 발현을 통해 운전 Dlx5 및 Dlx6, 초파리 말초없는 (DLL) 유전자 2,3의 상 동체를, 요인.
Introduction
대뇌 피질의 GABA 성의의 interneurons의 대부분은 중간과 꼬리 신경절 eminences (각각 MGE 및 CGE)을 명명 된이 과도 배아 구조에서 발생 4. Parvalbumin 및 소마토스타틴 (somatostatin) 표현의 interneurons는의 interneurons는 CGE에서 발생 표현 Calretinin 반면 MGE 크롬 (Cr), Vasointestinal 펩티드 (VIP) 및 Reelin (재)에서 발생. 이 interneuron 하위 유형은 자신의 생일에 의해 구별 될 수있다. MGE 파생 된 하위 유형은 배아 일 9.5 (E9.5)와 e16.5 5,6 사이에서 태어난다. 반면, CGE 유래의 interneurons는 생산이 E15.5 6 고점으로 E18.5 통해 E12.5에서 태어난다. 늦게 태어난 인구의 유전자 타겟팅은, 그러나, 어려운 남아있다.
쥐의 말초없는 (DLX) 유전자를 독점적으로 개발 복부 전뇌 3 표현됩니다. GABA 성의 선조체의 interneurons 및 투영 아니라 피질 뉴런 피라미드 세포 Dlx1 표현할초기 발달 단계 3에서 2,5, 6 유전자. 실제로, DLX 유전자는 모든 GABA 성 전구 세포의 MGE 및 CGE 뇌실 영역 (SVZ)로 표현된다. 이들 유전자의 발현은 postmitotic 단계 7-9에서 서브 타입을 선택하도록 제한된다. 이전 실험적 증거는 Dlx5 / 6 인핸서 요소가 형질 전환 마우스 모델 2에서 GABA 성 계통의 선택 타겟팅을 허용 것으로 나타났다. 우리는 현상 마우스 뇌에서 에피 솜 발현의 문맥에서 이들 인핸서 요소 중 하나의 사용을 시험 하였다. 우리는 최소한의 발기인 및 bluescript (BS) 백본 플라스미드의 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는) (그림 1)과 함께 Dlx5 / 6 증강 요소를 복제 서브. 우리는 선택적으로 CR-, VIP를 대상으로 E15.5에서 자궁 일렉트로에 의해 플라스미드를 도입 재는 3,8,10을 아류. 우리의 기술은 용이 스파 스 일렉트로, 수 있습니다그을음 세포의 형태 학적 특징의 재건입니다. 또한, 피질 GABA 성 뉴런의 유전자 발현의 예외적으로 높은 수준의 기능 연구를 허용한다. 우리는 손실과 여러 야생 유형 및 지배적 인 부정적인 유전자 11를 사용하여 기능 연구의 이득을 실시했다.
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Protocol
모든 동물은 의학의 NYU 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 규정 및 지침에 따라 처리 하였다.
마우스 균주
코닉 의해 제공 암컷 스위스 웹스터 마우스는이 실험에 사용 하였다. 특히 표면층의 interneurons를 타겟팅하기 위하여, E15.5 태아 사용 하였다.
주 : 표준 클로닝 기술을 사용하여 생성 된 본 작업 (Dlx5 / 6.eGFP 플라스미드 3 μg / μL)에 사용 된 플라스미드. eGFP는 cDNA를 Dlx5 / 6 PMIN-polyA 플라스미드에 클로닝 하였다. 이 플라스미드를 요청 (demarn02@nyumc.org)에 따라 사용할 수 있습니다.
미세 주입 피펫의 1 준비
- 860에 끌어 당기는 열 # 2를 설정합니다.
- 놓고 필라멘트 근처 유리 모세관을 고정합니다. 피펫의 외경 (OD)이 약 30 μm의 있는지 확인합니다.
- "풀"버튼을 눌러.
- 조심스럽게 캐 필러를 제거합니다. 하단 부분은 바늘이다. 상단 부분을 폐기하십시오.
2 마취 절차
- 이소 플루 란 수용 실을 준비합니다. 참고 : 아이소 플루 란으로 인해 자사의 빠른 동작과 부작용의 낮은 발생 빈도를 선호하는 마취제입니다. 펜 토바 비탈 다른 옵션입니다; 그러나,이 약의 허용 오차 변수 이소 플루 란보다 높은 사망률의 원인이됩니다.
- 0.5 L / 분 O이 4-5 %의 이소 플루 란의 흐름을 설정합니다.
- 헤드 어댑터의 밸브가 닫혀있는 반면, 챔버의 밸브가 열려 있는지 확인합니다.
- 챔버에 임신 한 마우스를 놓습니다.
- 마우스를 마취의 영향 아래에 갈 수 있습니다. 이 약 2 ~ 3 분 소요됩니다. 호흡 속도를 확인합니다. 마우스가과 호흡 시작하면, 이소 플루 란의 복용량을 낮 춥니 다.
- 마우스를 마취 한 후, 즉시 챔버에서 제거합니다. 가열 패드에 복부 측면을 놓고 전수술을 통해 이소 플루 란을 공급하기 위해 계속 마스크를 머리를 nsert. 헤드 어댑터 조각을 연결하는 튜브에 챔버에서 이소 플루 란의 흐름을 전환해야합니다. 각각의 눈에서 눈 윤활유 한 방울을 넣고 눈을 닫습니다.
- 저체온증을 최소화하기 위해 36 ° C 정도에 전기 패드를 설정합니다.
- 뒷발과 꼬리를 집어 발과 꼬리 반사의 부재를 확인합니다.
3 외과
- 70 % 에탄올로 복부를 덮는 피부를 정화.
- 위쪽으로 피부를 당겨 집게를 사용합니다. 각 수술 후 세제와 물을 모든 기기를 세척하고, 72 ° CO / N 살균.
- 유선의 세 번째와 네 번째 쌍 사이의 중간에 시작 정중선을 따라 수직 작은 절개 (약 2 ㎝)를 확인. 미세 수술 가위를 사용합니다. 복부 벽을 손상하지 않도록주의하십시오.
- 조심스럽게 복막으로부터 피부를 구분합니다.
- 동맥을 시각화및 복벽에 정맥. 복강을 노출 (선박을 피) 복막을 통해 다른 2cm 수직 절개를합니다.
- 동맥을 클램핑 피하는 양쪽에있는 피부와 복부 벽을 클램프. 주 : 동맥이 실수로 구멍이있는 경우, 자궁 경부 전위 또는 이소 플루 란 과다 복용을 수행하여 동물을 즉시 희생.
- 37 ° C로 멸균 PBS를 따뜻하게 사전. 김 물티슈 촉촉한 PBS와 클램프를 커버.
- PBS와 노출 복강 보습. 수술을 수행하는 동안이 단계를 여러 번 반복합니다.
- 라운드 집게를 사용하여 부드럽게 떨어져 공간에 배아 체인 (E15.5)을 당깁니다. 물티슈의 체인 휴식을 보자. 첫번째 자궁의 절반을 노출함으로써 시작합니다. 그 안에 배아 전기 천공되면, 내부를 돌아 오게 한 후 하반기에 작동합니다.
4 일렉트로
- 배아를 조작하는 라운드 집게를 계속 사용합니다.
- 바이올렛측면 심실을 sualize. 중간 선 (그림 1b)을 따라 실행 측면 심실.
- 빠른 그린 (주식을 10 % / w V) 추가 1:20 혼합물에 대한 DNA 용액에 주입하는 동안 시각화 할 수 있습니다. 증류수 표준 맥시 프렙 정제 프로토콜로부터 얻어진 펠릿을 용해시킴으로써 DNA 용액을 준비한다.
- 빠른 그린으로 DNA 용액 (Dlx5 / 6-eGFP는, 3 μg / μL) 1 ㎖를 주입하는 플런저 미리 뽑아 마이크로 피펫을 사용합니다. 피펫을 넣기 전에 바늘의 팁 단부에 어깨의 선두로부터 6mm 길이를 남겨 미세 forcep # 5 (듀)를 마이크로 피펫의 선단을 잘라. 라운드 핀셋으로 태아의 머리를 잡아. 중간 선 근처에있는 뇌실 목표로하는 45 ° 각도로 피펫 뇌를 입력합니다. 바늘이 뇌실을 관통하는 경우가 DNA를 주입 플런저를 사용할 때, 천천히 피펫을 철회. 심실이 녹색해야 할 때솔루션을 작성하기 시작합니다. 이 시점에서, 피펫을 움직이는 멈추고 DNA 1 ㎖를 주입. 조심스럽게 피펫을 철회.
- 950 밀리 초 간격으로 50 밀리의 오 45V 펄스 CUY21의 electroporator을 설정합니다.
- E15.5 배아에 대한 5mm 패들 전극을 사용합니다. 효율적인 전류 전송을 보장하기 위해 PBS에 전극을 담근다.
- DNA 솔루션을 포함하는 심실에 긍정적 인 패들과 태아의 머리 주위에 전극 패를 놓습니다. 약간 신경절 eminences을 통해 복부 전류를 만들 수있는 음의 일의 대한 긍정적 인 패를 내립니다. 이 조작은 피라미드 세포에서 이소 식을 최소화 할 수 있습니다.
- 전극을 배치 한 후, 한 번 풋 페달을 눌러 펄스를 제공한다.
- 전극을 제거하고 깨끗하게 닦아주십시오. 반복 각 배아와 4.6-4.9 단계를 반복합니다.
- 모든 배아를 electroporating 후 복강에 PBS 3 ㎖를 부어 복강에 반환.
- 제 봉합사 곡선 바늘과 5-0 실크 봉합사 후 피부 복벽. 상처에 리도카인 (4 %)을 적용합니다. 진통제 아스피린 내 복막의 120 ㎎ / ㎏을 관리 할 수 있습니다.
주 : 전체 절차는 20 분 이하로 수행되어야한다. 그것은 초보자는 짧은 수술 시간을 유지하기 위해 몇 배아를 electroporate하는 것이 좋습니다. 장시간 수술 배아의 생존율을 감소한다. - 마취 튜브에서 동물을 제거하고 종이에 가열 패드에 복구를 닦아 수 있습니다.
- 케이지에 동물을 돌려 37 ° C에서 가열 패드에 그것을 유지하고 건강 상태를 모니터링 할 수 있습니다. 동물은 일반적으로 수술을 잘 견딜 그들이 마취 튜브에서 제거 된 직후 서서히 이동하기 시작합니다. 과도한 출혈이나 혼수가 관찰되는 경우, IACUC는 자궁 경부 전위 또는 마취 과다 복용으로 안락사 절차를 승인 수행하여 즉시 동물을 희생.
- 비바에 케이지를 반환rium. 여성은 분만 자연적으로 줄 것이다.
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Representative Results
우리는 성숙 뉴런 세포 유형 특정한 타겟팅을 달성하기에 자궁 일렉트로 기법을 적응. CGE 유래의 interneurons에서 eGFP는의 발현을 구동하기 위해, 우리는 Dlx5 / 6 증강 요소를 사용 E15.5에 우리의 주사를 제한, 무대 CGE 유래의 interneurons의 대부분이 발생하는 경우. 우리는 P8에서 분석을 수행하고 P15 (11) (도 1 및도 2). 우리는 E15.5에서 몰 농도에서 CAG-mCherry 및 Dlx5 / 6 eGFP는 플라스미드를 electroporating 공동으로 electroporation하여 신경 세포의 복부 출처를 확인했다. 이 실험에서, 우리는 뇌실 영역 (SVZ)의 공동에있는 유일한 복부 전구 세포가 모두 단백질 11을 표명 것을 관찰했다. 형광 단백질의 발현이 시공 시간은 심실하지만 subventr 표현되지 Dlx5 6 유전자의 정상적인 발달 식, 일치icular 영역 4. 또한, 우리는 GAD67-eGFP는 올림피아 마우스 라인에 Dlx5 / 6 mCherry 전기 천공의 interneurons의 GABA 성 정체성을 평가 하였다. 우리는 electroporation하여 신경 세포의 대부분이 GAD67 모든 GABA 성 세포 (11)에 의해 표현 된 효소를 표명 한 것으로 나타났습니다. 또한, 우리는 P15에서 면역 조직 화학 및 전기 생리 분석을 수행하여 전기 천공의 interneurons의 하위 유형의 정체성을 결정했다. 하위 유형 특정 마커의 발현 패턴은 저온 유지 장치 섹션 11 (그림 2)에 면역에 의해 밝혀졌다. 우리는 E15.5에 전기 천공의 interneurons가 거의 독점적으로 NPY, Reelin, VIP 및 크롬을 표현하는 것을 발견, 이전에 CGE 파생 interneuron 마커 6을 설명했다. 또한, 이러한 신경 세포의 고유 전기 생리 특성은 이전에 운명 매핑 연구 6,11에 설명 된 하나와 일치합니다. 모두 함께, 이러한 결과는 electropo을 나타냅니다E15.5에서 Dlx5 / 6 인핸서 요소와 배급 선택적으로 CGE 파생 interneuron의 하위 유형을 대상으로.
일렉트로 실험의 도식 표현을 그림. ) 다이어그램 실험 전략을 설명) Dlx5 / 6 eGFP는 플라스미드. 나에 대한 전략을 서브 클로닝.
그림 2 전기 천공의 interneurons는 CGE 파생 된 하위 마커의 발현에 의해 묘사된다. A) CGE 유래의 interneurons는 Dlx5 / 6 eGFP는 플라스미드 electroporation하여. 다양한 CGE 서브 타입의 스파 스 일렉트로. B) P8에서 VIP 발현 interneuron을합니다. eGFP는식이 묘사한다전체 dentritic 나무와 단일 신경 세포의 축삭의 아버. C) P8에서 NPY 발현 interneuron. NPY 표현은 neurogliaform 세포. D) P15에서 NPY 발현 interneuron을 묘사한다. 스케일 바, 100mm; BD, 50mm
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Discussion
기술의 한계
이 기술은 셀 프로세스 셀 자율적 분석이 가능하지만,이 집단 분석에 적합하지 않다. electroporations 뇌 당 electroporation하여보다 천 세포와 매우 드물다. 결과적으로, 기술은 CGE의 interneurons 유래의 유전자 조작으로 인한 행동 결과를 평가하기 위해 사용될 수 없다.
electroporations가 E13.5-E14.5 대상 MGE에서 파생 된 하위 유형에서 수행하지만, 효율이 낮은 10입니다. 우리는 Dlx5 / 6 증강 적어도 에피 솜 표현의 맥락에서 postmitotic MGE의 하위 유형이 덜 활성화되어 있음을 추측.
기존 방법에 대한 의의
이 기술의 interneurons의 연구 이전에 전기 천공 법 (electroporation) 방법 (12, 13)에서 발전을 나타냅니다. 때문에 상대적 부족과 복부 배아에NIC의 기원은, 신경 세포의이 인구 대상으로하기 어려운 입증되었습니다. 우리의 기술은 CGE 유래의 interneurons의 세포 자율적 인 분석을 수행 할 수있는 수단을 제공합니다. eGFP는 발현의 높은 수준은 단일의 interneurons의 시각화 및 분석을 허용한다.
미래의 응용 프로그램
특정 플라스미드 및 유전자 변형 마우스 라인의 사용을 조합하여 관심의 유전자의 발현의 공간적 제어를 달성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 우리는 Teto의 유도 유전자의 발현을 켭니다 Dlx5 / 6-TTA 플라스미드를 사용했다. 이 실험에서 우리는 독시 싸이클린 팔을 투여하여 형질 전환 유전자 발현을 침묵 할 수 있었다. 우리는 현재 CreER 시스템과 조합 기술을 사용하는 프로토콜을 개발하고있다.
프로토콜 내에서 중요한 단계
효율적인 전기 천공 및 생존을 달성하기 exces 피하려고배아 및 / 또는 기관의 조작 시브. 또한, 동맥과 정맥을 곤란하게하지 마십시오. 출혈이 발생하는 경우 마우스를 빨리 저 혈량 성이 될 것입니다. 일렉트로이 완료되면, 당신은 저산소증의 원인이 만드는 꼬임을 방지하기 위해 그들을 발견 된 동일한 위치에 배아 및 기관을 배치합니다. 20 분 이하의 수술 시간을 목표로하고 있습니다. 수술 중 PBS 많은 시간이 복강 보습. 일렉트로 동안 모세관 바늘 번만 뇌실 천공하려고. 반복 천공은 생존율을 감소한다. 훈련 기간 후 생존율은 80 % 이상이어야한다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원을 Lihong 음에 감사하고 있습니다. NVD는 NARSAD 젊은 연구자 상을받는 사람이며, 또한 NIH (5 K99 MH095825-02)에서 보조금에 의해 지원됩니다. Fishell 실험실에서 연구는 건강의 국립 연구소, 정신 건강 (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09)의 국립 연구소, 신경 질환 및 뇌졸중 (5 R01 NS081297-02의 국립 연구소에서 지원 한 P01 NS074972 -01A1)와 시몬스 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
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