Abstract
De studie van het centrale zenuwstelsel (CZS) rijping is gebaseerd op genetische doelgerichtheid van neuronale populaties. Echter de taak van de expressie van genen van belang specifieke neuronale subtypes beperkt opmerkelijk moeilijk gebleken vanwege de relatieve schaarste aan specifieke promotor elementen. GABA-erge interneuronen vormen een neuronale populatie met uitgebreide genetische en morfologische diversiteit. Sterker nog, meer dan 11 verschillende subtypes van GABA-erge interneuronen gekarakteriseerd in de muis cortex 1. Hier geven we een geschikt protocol voor het selectief richten van GABAerge populaties. We bereikten subtype selectieve targeting van GABAerge interneuronen door de enhancer element van het homeobox transcriptiefactoren Dlx5 en Dlx6, homologen van het Drosophila distale minder (Dll) gen 2,3, om de expressie van specifieke genen rijden door in utero elektroporatie.
Introduction
Het grootste deel van de corticale GABAergische interneuronen zijn afkomstig van twee tijdelijke embryonale structuren genaamd de mediale en caudale ganglion grootheden (MGE en CGE respectievelijk) 4. Parvalbumine en somatostatine uiten interneuronen hun oorsprong in de MGE terwijl calretinin (Cr), Vasointestinal peptide (VIP) en Reelin (Re) uiten interneuronen zijn afkomstig uit de CGE. Deze interneuron subtypen kunnen worden onderscheiden door hun geboortedata. MGE afgeleide subtypen zijn geboren tussen embryonale dag 9.5 (E9.5) en E16.5 5,6. In tegenstelling, zijn CGE afgeleid interneuronen geboren uit E12.5 door E18.5 met hun productie een piek van E15.5 6. De genetische targeting van dit late geboren bevolking blijft echter ongrijpbaar.
Het murine distale minder (Dlx) genen exclusief tot expressie in de ontwikkeling ventrale voorhersenen 3. GABA-erge interneuronen en striatum projectie neuronen maar niet corticale piramidale cellen brengen Dlx1, 2,5, en 6 genen in de vroege ontwikkelingsstadia 3. Inderdaad, de Dlx genen die in de MGE en CGE subventriculaire zone (SVZ) in alle GABAerge voorlopers. Expressie van deze genen wordt beperkt tot subtypen te selecteren op postmitotische stadia 7-9. Vorige experimenteel bewijsmateriaal bleek dat de Dlx5 / 6 versterkend element zorgt voor de selectieve targeting van GABAergic geslachten in transgene muismodellen 2. We testten het gebruik van een van deze enhancer elementen in de context van episomale expressie in de zich ontwikkelende hersenen van muizen. We sub gekloneerd de Dlx5 / 6 enhancer element met een minimale promotor en versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) in een Bluescript-(BS) backbone plasmide (Figuur 1). We introduceerden het plasmide door middel van in utero elektroporatie op E15.5 om selectief richten Cr-, VIP en Re- subtypes 3,8,10. De techniek maakt sparse elektroporatie, welke vergemakkelijktde reconstructie van de morfologische kenmerken van singe cellen. Bovendien, de uitzonderlijk hoge niveaus van genexpressie in corticale GABAerge neuronen zorgt voor functionele studies. Voerden we verlies en winst van functie studies met behulp van verschillende wild-type en dominant negatieve genen 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de voorschriften en richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de NYU School of Medicine.
Muizestammen
Swiss Webster vrouwtjesmuizen door TACONIC werden voor deze experimenten. Om specifiek te richten oppervlaktelaag interneuronen, werden E15.5 embryo's gebruikt.
Opmerking: Het plasmide gebruikt in dit werk (Dlx5 / 6.eGFP plasmide 3 ug / ul) werd onder toepassing van standaard kloneringstechnieken. De eGFP cDNA werd gekloneerd in een Dlx5 / 6-Pmin-polyA plasmide. Dit plasmide is op aanvraag (demarn02@nyumc.org) beschikbaar.
1 Bereiding van Microinjection Pipetten
- Zet de trekker Heat # 2-860.
- Plaats en bevestig de glazen capillair in de buurt van de gloeidraad. Controleer of de buitendiameter (OD) van de pipet is ongeveer 30 micrometer.
- Druk op de "pull"-knop.
- Verwijder de capillaire zorgvuldig. Het onderste deel is de naald. Gooi het bovenste deel.
2 Anesthesie Procedure
- Bereid een isofluraan bevattende kamer. Opmerking: Isofluraan de voorkeur verdoving door zijn snelle werking en lage incidentie van bijwerkingen. Pentobarbital is een andere optie; echter tolerantie van deze drug is variabel en kan leiden tot een hogere sterfte dan isofluraan.
- Stel de stroom van isofluraan 4-5% in 0,5-1 L / min O2.
- Zorg ervoor dat de klep van de kamer open, terwijl de klep voor het hoofd-adapter is gesloten.
- Plaats de zwangere muis in de kamer.
- Laat de muis te gaan onder invloed van verdoving. Dit duurt ongeveer 2-3 min duren. Controleer de ademhaling. Als de muis begint te hyperventileren, hoe lager de dosis van isofluraan.
- Nadat de muis is verdoofd, direct verwijderen uit de kamer. Plaats het ventrale zijde naar boven op de verwarming pad en insert de kop masker die blijft isofluraan leveren gedurende de operatie. Zorg ervoor dat de stroom van isofluraan schakelen van de kamer naar de buis verbindt de hoofd verloopstuk. Doe een druppel oog smeermiddel in elk oog en sluit de ogen.
- Zet de verwarming pad tot 36 ° C graden om onderkoeling te voorkomen.
- Controleren op de afwezigheid van de voet en de staart reflexen door te knijpen de achterste poten en de staart.
3 Chirurgie
- Reinigt de huid die de buik met 70% ethanol.
- Gebruik een tang om de huid omhoog trekt. Na elke operatie, wassen alle instrumenten met water en zeep, en gesteriliseerd bij 72 ° CO / N.
- Voeg een kleine verticale incisie (ongeveer 2 cm) langs de middellijn vanaf halverwege tussen de derde en vierde paar borstklieren. Gebruik fijne operatie schaar. Zorg ervoor dat de buikwand niet beschadigen.
- Voorzichtig los van de huid van het buikvlies.
- Visualiseer de slagadersen aders op de buikwand. Maak nog 2 cm verticale incisie door het buikvlies (het vermijden van de schepen) naar de buikholte bloot.
- Klem de huid en abdominale wand aan weerszijden vermijden vastklemmen van de slagaders. Opmerking: als de slagaders ongeluk worden doorboord, offeren het dier onmiddellijk door het uitvoeren van cervicale dislocatie of isofluraan overdosis.
- Pre warm de steriele PBS tot 37 ° C. Bedek de klemmen met PBS vochtige doekjes Kim.
- Bevochtig de blootgestelde buikholte met PBS. Herhaal deze stap meerdere malen tijdens het uitvoeren van de operatie.
- Met behulp van ronde tang, trek de embryonale keten (E15.5) uit de buurt van de holte. Laat de ketting rust op de natte doekjes. Begin met het blootstellen van de helft van de baarmoeder eerste. Zodra het embryo erin zijn geëlektroporeerd, breng het terug binnen, dan werken aan de tweede helft.
4 Electroporatie
- Blijf ronde tang gebruiken om de embryo's te manipuleren.
- Visualize de laterale ventrikels. De laterale ventrikels langs de middellijn (figuur 1b).
- Voeg snel groen (Stock: 10% w / v) aan de DNA-oplossing voor een 01:20 mengsel visualiseren tijdens de injectie. Bereid de DNA-oplossing door oplossen van de pellet verkregen uit een standaard maxi-prep zuiveringsprotocol in gedestilleerd water.
- Gebruik vooraf getrokken micropipetten met een zuiger te injecteren 1 ml van de DNA-oplossing (Dlx5 / 6-eGFP, 3 ug / ul) met Fast Green. Verwijder de punt van de micropipet met een fijne pincet # 5 (Dumont) tot 6 mm lengte vertrekken vanaf het begin van de schouder aan het einde van de punt van de naald voordat de pipet. Houd de kop van de embryo met ronde pincet. Voer de hersenen met de pipet in een hoek van 45 ° te streven naar de laterale ventrikel in de buurt van de middellijn. Als de naald dringt door het ventrikel, langzaam trekken de pipet als je de zuiger gebruikt om te injecteren van DNA. Het ventrikel moet groen wanneer deoplossing begint te vullen. Op dit moment stoppen met bewegen de pipet en injecteer 1 ml DNA. Zachtjes, trekken de pipet.
- Stel de CUY21 electroporator vijf 45V pulsen van 50 msec gescheiden door 950 msec.
- Met 5 mm peddel elektroden voor E15.5 embryo's. Dompel de elektroden in PBS om efficiënte huidige overdracht te garanderen.
- Elektrode schoepen rond het hoofd van de embryo met de positieve paddle op de ventrikel die de DNA-oplossing. Iets lager de positieve peddel met betrekking tot de negatieve naar een ventrale stroom creëren door middel van het ganglion grootheden. Deze manipulatie zal ectopische expressie in piramidale cellen te minimaliseren.
- Na het plaatsen van de elektroden, levert een puls door een keer op het voetpedaal.
- Verwijder de elektroden en veeg ze schoon. Herhaal de stappen 4,6-4,9 met elk embryo.
- Na electroporating alle embryo Giet 3 ml PBS in de buikholte en terug naar de buikholte.
- Eerst hechtdraad de buikwand met een gekromde naald en 5-0 zijden hechtdraad en de huid. Solliciteer lidocaïne (4%) op de wond. Dien 120 mg / kg van Aspirine intra buikvlies voor pijnstilling.
Opmerking: De hele procedure moet in 20 minuten of minder worden uitgevoerd. Het is raadzaam dat beginners alleen electroporate een paar embryo's om de werking tijd kort te houden. Langdurig operaties wordt het overlevingspercentage van de embryo's te verminderen. - Haal het dier uit de narcose slangen en terug te kunnen halen op de verwarming pad op een papieren doekje.
- Terug dier naar de kooi, houd het op de verwarming pad bij 37 ° C en het toezicht op de gezondheidstoestand. De dieren gewoonlijk ook de operatie goed en beginnen langzaam kort nadat zij uit de anesthesie slang. Als overmatig bloeden of lethargie wordt waargenomen, offeren het dier onmiddellijk door het uitvoeren IACUC goedgekeurde euthanasie procedures zoals cervicale dislocatie of verdoving overdosis.
- Keer terug naar de kooi vivarium. De vrouwtjes zullen geboorte van nature geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We passen de in utero elektroporatie techniek om celtype specifieke targeting van rijpen neuronen bereiken. Om de expressie van eGFP in CGE-afgeleide interneuronen rijden, gebruikten we de Dlx5 / 6 versterkend element en beperkt onze injecties om E15.5, de fase waarin de meerderheid van de CGE-afgeleide interneuronen worden gegenereerd. We voerden de analyse op P8 en P15 11 (figuren 1 en 2). We bevestigden de ventrale oorsprong van geëlectroporeerd neuronen door co electroporating een CAG-mCherry en een Dlx5 / 6-eGFP plasmiden bij equimolaire concentraties op E15.5. In dit experiment werd waargenomen dat alleen ventrale voorlopers in de subventriculaire zone (SVZ) gecoëxpresseerde beide eiwitten 11. Deze spatio temporele expressie van fluorescerende eiwitten samenvalt met de normale ontwikkelingsexpressie van de Dlx5 en 6 genen niet opgesteld in het ventriculaire maar subventricular zone 4. Verder hebben we de GABAergic identiteit van Dlx5 / 6-mCherry geëlectroporeerd interneuronen in een GAD67-eGFP Knockin muis lijn. We vonden dat de meeste geëlektroporeerd neuronen tot expressie GAD67, een enzym alle GABAerge cellen 11 expressie. Daarnaast hebben we het subtype identiteit van geëlektroporeerd interneuronen bepaald door het uitvoeren van immunohistochemie en elektrofysiologische analyse op P15. Het expressiepatroon van subtype specifieke markers werd onthuld door immunofluorescentie in cryostaat secties 11 (figuur 2). We vonden dat interneuronen geëlectroporeerd op E15.5 bijna uitsluitend uitdrukken NPY, Reelin, VIP en Cr, eerder beschreven CGE-afgeleide interneuron 6 markers. Bovendien is de intrinsieke elektrofysiologische eigenschappen van deze neuronen zijn in overeenstemming met de eerder beschreven in het lot mapping studies 6,11. Alles bij elkaar geven deze resultaten aan dat electropowerking met de Dlx5 / 6 enhancer element op E15.5 selectieve wijze CGE-afgeleide interneuron subtypes.
Figuur 1 Schematische weergave van de elektroporatie-experimenten. a) Subklonering strategie voor de Dlx5 / 6-eGFP plasmide. b) Schematische weergave van de experimentele strategie.
Figuur 2 Geëlektroporeerde interneuronen afgebakend door de expressie van CGE-afgeleide subtype markers. A)-CGE afgeleid interneuronen geëlectroporeerd met een Dlx5 / 6-eGFP plasmide. Let op de schaarse elektroporatie van diverse CGE subtypes. B) A-VIP uiten interneuron op P8. eGFP uitdrukking schetst degehele dendritische boom en axonale prieel van enkele neuronen. C) Een-NPY uiten interneuron op P8. NPY expressie bakent neurogliaform cellen. D) Een-NPY uiten interneuron op P15. Schaalbalk A, 100 mm; BD, 50 mm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beperkingen van de Techniek
Hoewel deze techniek maakt cell autonome analyse van celprocessen, is het niet geschikt voor populatie-analyse. De electroporations zijn erg schraal minder dan duizend cellen geëlektroporeerd per hersenen. Bijgevolg kan de techniek niet worden gebruikt om gedragsconsequenties gevolg van de genetische manipulatie van CGE-afgeleide interneuronen beoordelen.
Terwijl electroporations uitgevoerd op E13.5-E14.5 doel MGE-afgeleide subtypen, het rendement is laag 10. We speculeren dat de Dlx5 / 6 enhancer minder actief in postmitotische MGE subtypes althans in de context van episomale expressie.
Belang met betrekking tot bestaande methoden
De techniek staat overgang van eerder elektroporatie 12,13 methoden voor de studie van interneuronen. Door hun relatieve schaarste en ventrale embryonic oorsprong, deze populatie van neuronen is moeilijk te richten bewezen. Onze techniek biedt de middelen voor het uitvoeren van cel-autonome analyse van CGE-afgeleide interneuronen. De hoge niveaus van eGFP expressie mogelijk maken de visualisatie en analyse van afzonderlijke interneuronen.
Toekomstige toepassingen
Door het gebruik van specifieke plasmiden en genetisch gemodificeerde muizen lijnen is het mogelijk om tijdelijke en ruimtelijke controle in de expressie van genen van belang te bereiken. Bij voorbeeld gebruikten we een Dlx5 / 6-tTA plasmide inschakelen van de expressie van induceerbare tetO transgenen. In deze experimenten konden we de transgenexpressie zwijgen opleggen toedienen Doxycycline 8. We zijn bezig met het ontwikkelen van een protocol om de techniek te gebruiken in combinatie met de Creer systeem.
Kritische stappen in het protocol
Om efficiënt elektroporatie en overleving te bereiken, proberen te voorkomen dat excessive manipulatie van het embryo en / of organen. Bovendien voorkomen knijpen slagaders en aders. De muis zal snel hypovolemische worden als bloeden optreedt. Na de elektroporatie is voltooid, plaatst u de embryo's en organen in dezelfde posities waar je ze gevonden te creëren knikken dat hypoxie kunnen veroorzaken. Doel voor 20 min of minder operatie tijd. Bevochtig de buikholte met PBS meerdere keren tijdens de operatie. Tijdens de elektroporatie, probeer het ventrikel prikken maar een keer met de capillaire naald. Repetitieve doorprikken zal de overlevingskans verlagen. Na de stage moet de overlevingskans 80% of hoger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor Lihong Yin voor technische ondersteuning. NVD is een ontvanger van een NARSAD Young Investigator Award en wordt ook ondersteund door subsidies van de NIH (5 K99 MH095825-02). Onderzoek in de Fishell lab wordt ondersteund door het National Institute of Health, National Institute of Mental Health (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) en de Simons Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
