Abstract
Lo studio del sistema nervoso centrale (CNS) maturazione si basa su di targeting genetica delle popolazioni neuronali. Tuttavia, il compito di limitare l'espressione di geni di interesse per specifici sottotipi neuronali si è dimostrato straordinariamente difficile a causa della relativa scarsità di specifici elementi promotori. Interneuroni GABAergici costituiscono una popolazione neuronale con una vasta diversità genetica e morfologica. Infatti, più di 11 differenti sottotipi di interneuroni GABAergici sono stati caratterizzati nella corteccia mouse 1. Qui vi presentiamo un protocollo adatto per il targeting selettivo delle popolazioni GABAergici. Abbiamo raggiunto sottotipo selettivi mirati interneuroni GABAergici utilizzando l'elemento enhancer della trascrizione homeobox fattori Dlx5 e Dlx6, omologhi del distale-less (Dll) gene Drosophila 2,3, per guidare l'espressione di geni specifici mediante elettroporazione in utero.
Introduction
La maggior parte delle corticali interneuroni GABAergici provengono da due strutture embrionali transitori denominate le eminenze gangliari mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente) 4. Parvalbumina e somatostatina esprimere interneuroni sono originari del MGE, mentre Calretinin (Cr), Vasointestinal peptide (VIP) e Reelin (Re) che esprime interneuroni provengono dalla CGE. Questi sottotipi di interneuroni possono essere distinte dalle loro date di nascita. MGE sottotipi derivati sono nati tra il giorno embrionale 9.5 (E9.5) e e16.5 5,6. Al contrario, gli interneuroni CGE derivati nascono da E12.5 attraverso e18.5 con il loro picco produttivo di E15.5 6. L'orientamento genetico di questa popolazione tardi nato, tuttavia, rimane sfuggente.
Le distale-meno (Dlx) geni murini sono espressi esclusivamente in via di sviluppo proencefalo ventrale 3. Interneuroni GABAergici e neuroni striatali di proiezione, ma cellule piramidali corticali non esprimono Dlx1, 2,5, e 6 geni nelle prime fasi di sviluppo 3. Infatti, i geni Dlx sono espressi in zona MGE e CGE subventricolare (SVZ) in tutti i progenitori GABAergici. L'espressione di questi geni si restringe per selezionare sottotipi nelle fasi post-mitotici 7-9. Evidenza sperimentale precedente ha mostrato che l'elemento Dlx5 / 6 enhancer permette di targeting selettivo di lignaggi GABAergici in modelli di topi transgenici 2. Abbiamo testato l'uso di uno di questi elementi enhancer nel contesto di espressione episomiale nel cervello di topo in via di sviluppo. Abbiamo sub clonato l'elemento Dlx5 / 6 enhancer insieme ad un promotore minimo e la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) in un Bluescript (BS) backbone plasmide (Figura 1). Abbiamo introdotto il plasmide mediante elettroporazione in utero a E15.5 di mirare selettivamente Cr, VIP e Re- sottotipi 3,8,10. La nostra tecnica permette di elettroporazione sparse, che facilitala ricostruzione delle caratteristiche morfologiche delle cellule singe. Inoltre, eccezionalmente alti livelli di espressione genica in neuroni corticali GABAergici permette di studi funzionali. Abbiamo effettuato perdita e guadagno di studi di funzione utilizzando diversi wild type e geni dominanti negativi 11.
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Protocol
Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con i regolamenti e le linee guida del Care and Use Committee animali istituzionale della Scuola di Medicina di NYU.
Mouse Ceppi
Swiss Webster topi femmina forniti da TACONIC sono stati utilizzati per questi esperimenti. Al fine di indirizzare specificamente interneuroni superficiali di livello, sono stati utilizzati embrioni E15.5.
Nota: Il plasmide utilizzato in questo lavoro (Dlx5 / 6.eGFP plasmide 3 mg / mL) è stato generato utilizzando tecniche di clonazione standard. Il eGFP cDNA è stato clonato in un Dlx5 / 6-Pmin-polyA plasmide. Questo plasmide è disponibile su richiesta (demarn02@nyumc.org).
1 Preparazione di Microiniezione Pipettes
- Impostare l'estrattore di calore # 2-860.
- Posizionare e fissare il capillare di vetro in prossimità del filamento. Controllare che il diametro esterno (OD) della pipetta è di circa 30 micron.
- Premere il tasto "tirare".
- Rimuovere con cautela il capillare. La parte inferiore è l'ago. Eliminare la parte superiore.
2 Anestesia Procedura
- Preparare una camera contenente isoflurano. Nota: isoflurano è l'anestetico preferito per la sua rapidità d'azione e la bassa incidenza di effetti collaterali. Pentobarbital è un'altra opzione; Tuttavia, la tolleranza di questo farmaco è variabile e può portare ad un tasso di mortalità superiore rispetto isoflurano.
- Impostare il flusso di isoflurano al 4-5% in 0,5-1 L / min O 2.
- Assicurarsi che la valvola per la camera è aperta, mentre la valvola per l'adattatore testa è chiusa.
- Posizionare il mouse incinta in camera.
- Lasciare il mouse per andare sotto l'effetto dell'anestesia. Questo richiederà circa 2-3 min. Controllare la frequenza respiratoria. Se il mouse ha inizio iperventilazione, ridurre la dose di isoflurano.
- Dopo che il mouse è anestetizzato, prontamente alla rimozione dalla camera. Posizionarlo lato ventrale sul riscaldamento pad e insert la testa nella maschera che continuerà a fornire isoflurano durante l'intervento chirurgico. Assicurarsi di cambiare il flusso di isoflurano dalla camera al tubo che collega il pezzo adattatore testa. Mettere una goccia di lubrificante occhio in ogni occhio e chiudere gli occhi.
- Impostare il pad di riscaldamento a 36 ° C gradi per ridurre al minimo l'ipotermia.
- Verificare l'assenza di piede e di coda riflessi pizzicando le zampe posteriori e la coda.
3. Chirurgia
- Detergere la pelle che ricopre l'addome con il 70% di etanolo.
- Usare pinze per tirare la pelle verso l'alto. Dopo ogni intervento chirurgico, lavare tutti gli strumenti con acqua e detergente, e sterilizzata a 72 ° CO / N.
- Fai una piccola incisione verticale (circa 2 cm) lungo la linea mediana iniziando a metà strada tra il terzo e quarto paia di ghiandole mammarie. Usare le forbici chirurgia sottili. Fare attenzione a non danneggiare la parete addominale.
- Separare delicatamente la pelle dal peritoneo.
- Visualizza le arteriee vene sulla parete addominale. Fare un altro due centimetri incisione verticale attraverso il peritoneo (evitando i vasi) per esporre la cavità addominale.
- Fissare la pelle e la parete addominale su ogni lato evitando il bloccaggio delle arterie. Nota: Se le arterie vengono accidentalmente perforati, sacrificare l'animale immediatamente eseguendo dislocazione cervicale o overdose isoflurano.
- Pre riscaldare la sterile PBS a 37 ° C. Coprire i morsetti con PBS umide Kim salviette.
- Idratare la cavità addominale esposta con PBS. Ripetere questa operazione più volte durante l'esecuzione della chirurgia.
- Utilizzando pinze rotonde, tirare delicatamente la catena embrionale (E15.5) lontano dalla cavità. Lasciare riposare catena sulle salviettine umidificate. Inizia esponendo una metà dell'utero prima. Una volta che gli embrioni in esso sono elettroporati, riportarlo dentro, poi lavorare sulla seconda metà.
4. elettroporazione
- Continuare a utilizzare pinze rotonde per manipolare gli embrioni.
- Visualize ventricoli laterali. I ventricoli laterali corrono lungo la linea mediana (Figura 1b).
- Aggiungi Veloce Verde (magazzino: 10% w / v) per la soluzione di DNA per una miscela 01:20 di visualizzare durante l'iniezione. Preparare la soluzione di DNA sciogliendo il pellet ottenuto da un protocollo di purificazione maxi-prep serie in acqua distillata.
- Utilizzare micropipette pre tirati con uno stantuffo per iniettare 1 ml di soluzione di DNA (Dlx5 / 6-eGFP, 3 mg / mL) con Fast verde. Tagliare la punta della micropipetta con un bel forcep # 5 (Dumont) lasciare 6 mm di lunghezza dall'inizio della spalla alla fine della punta dell'ago prima di caricare la pipetta. Tenere la testa di un embrione con una pinzetta rotonde. Immettere il cervello con la pipetta ad un angolo di 45 ° puntando il ventricolo laterale si trova vicino alla linea mediana. Se l'ago penetra attraverso il ventricolo, ritirare lentamente la pipetta come si usa lo stantuffo per iniettare il DNA. Il ventricolo dovrebbe diventare verde quando ilsoluzione comincia a riempirlo. A questo punto, fermano la pipetta e iniettare 1 ml di DNA. Delicatamente, ritirare la pipetta.
- Impostare il elettroporatore CUY21 a cinque 45V impulsi di 50 msec intervallate da 950 msec.
- Utilizzare 5 millimetri elettrodi pagaia per gli embrioni E15.5. Immergere gli elettrodi in PBS per assicurare la trasmissione di corrente efficace.
- Posizionare le piastre degli elettrodi intorno alla testa dell'embrione con la pagaia positivo sul ventricolo contenente la soluzione di DNA. Leggermente abbassare la paletta positivo rispetto del negativo per creare una corrente ventrale attraverso eminenze gangliari. Questa manipolazione ridurrà espressione ectopica in cellule piramidali.
- Dopo aver posizionato gli elettrodi, fornire un impulso premendo il pedale una volta.
- Rimuovere gli elettrodi e pulire puliti. Ripetere i passaggi 4,6-4,9 con ogni embrione.
- Dopo electroporating tutti gli embrioni, versare 3 ml di PBS nella cavità addominale e restituirli alla cavità addominale.
- Prima sutura della parete addominale con un ago curvo e 5-0 sutura di seta e poi la pelle. Applicare lidocaina (4%) sulla ferita. Somministrare 120 mg / kg di Aspirina intra peritoneo per l'analgesia.
Nota: L'intera procedura deve essere eseguita in 20 minuti o meno. E 'consigliabile che i principianti elettroporazione solo pochi embrioni per mantenere il tempo di funzionamento breve. Interventi chirurgici prolungati diminuirà il tasso di sopravvivenza degli embrioni. - Rimuovere l'animale dal tubo dell'anestesia e consentire il recupero sul pad di riscaldamento su una carta pulire.
- Animale Ritorna alla gabbia, tenerlo sulla rampa di riscaldamento a 37 ° C e monitorare lo stato di salute. Gli animali in genere tollerano l'intervento chirurgico bene e cominciano a muoversi lentamente subito dopo vengono rimossi dal tubo dell'anestesia. Se si osserva un eccessivo sanguinamento o letargia, sacrificare immediatamente l'animale eseguendo IACUC approvato le procedure di eutanasia come la dislocazione cervicale o overdose anestesia.
- Gabbia Ritorna alla vivarium. Le femmine saranno partorire naturalmente.
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Representative Results
Abbiamo adattato la tecnica di elettroporazione in utero per raggiungere tipo cellulare specifico orientamento dei neuroni in scadenza. Per guidare l'espressione di eGFP in interneuroni CGE-derivati, abbiamo utilizzato l'elemento enhancer Dlx5 / 6 e limitati i nostri iniezioni per E15.5, la fase in cui la maggior parte degli interneuroni CGE-derivati vengono generati. Abbiamo effettuato l'analisi a P8 e P15 11 (figure 1 e 2). Abbiamo confermato l'origine ventrale dei neuroni elettroporate da co electroporating un CAG-mCherry e un DLX5 / 6-eGFP plasmidi a concentrazioni equimolari a E15.5. In questo esperimento, abbiamo osservato che solo i progenitori ventrali situati nella zona subventricolare (SVZ) co espresse entrambe le proteine 11. Questa espressione temporale spazio di proteine fluorescenti coincide con la normale espressione evolutiva della Dlx5 e 6 geni, che non sono espressi nel ventricolo ma subventrZona icular 4. Inoltre, abbiamo valutato l'identità di interneuroni GABAergici Dlx5 / 6-mCherry elettroporate in una linea di topi Knockin GAD67-eGFP. Abbiamo scoperto che la stragrande maggioranza dei neuroni elettroporate espresso GAD67, un enzima espresso da tutte le cellule GABAergici 11. Inoltre, abbiamo determinato l'identità sottotipo di interneuroni elettroporate effettuando immunoistochimica e analisi elettrofisiologica a P15. Il pattern di espressione di marcatori specifici sottotipo è stata rivelata mediante immunofluorescenza in sezioni al criostato 11 (Figura 2). Abbiamo trovato che interneuroni elettroporate a E15.5 esprimono quasi esclusivamente NPY, Reelin, VIP e Cr, precedentemente descritto marcatori interneuroni CGE-derivati 6. Inoltre, le proprietà elettrofisiologiche intrinseche di questi neuroni sono in accordo con quello precedentemente descritto negli studi di mappatura destino 6,11. Tutti insieme, questi risultati indicano che electroporazione con l'elemento enhancer Dlx5 / 6 a E15.5 selettivamente bersaglio sottotipi di interneuroni CGE-derivati.
Figura 1 Rappresentazione schematica degli esperimenti di elettroporazione. a) subcloning strategia per la Dlx5 / 6-eGFP plasmide. b) Diagramma che indica la strategia sperimentale.
Figura 2 elettroporati interneuroni sono delineati mediante l'espressione di marcatori sottotipo CGE-derivati. A) interneuroni EGC-derivato elettroporati con Dlx5 / 6-eGFP plasmide. Nota: l'elettroporazione sparse di diversi sottotipi EGC. B) A interneuroni-VIP esprimono a P8. espressione eGFP delinea ilintero albero dendritiche e assonali pergolato di singoli neuroni. C) Un interneuroni-NPY esprimono a P8. Espressione di NPY delinea cellule neurogliaform. D) degli interneuroni-NPY esprimono a P15. Barra di scala A, 100 mm; BD 50 mm
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Discussion
LIMITI DELLA TECNICA
Mentre questa tecnica permette di cella di analisi autonoma di processi cellulari, non è adatto per l'analisi di popolazione. I electroporations sono molto scarse, con meno di un migliaio di cellule elettroporate al cervello. Di conseguenza, la tecnica non può essere utilizzata per valutare conseguenze comportamentali dovute alla manipolazione genetica degli interneuroni CGE-derivati.
Mentre electroporations effettuate ai sottotipi bersaglio E13.5-E14.5 MGE-derivati, l'efficienza è bassa 10. Noi ipotizziamo che la Dlx5 / 6 enhancer è meno attivo in sottotipi MGE postmitotiche almeno nel contesto dell'espressione episomiale.
Significative in relazione a metodi esistenti
La tecnica rappresenta il passaggio dalla modalità precedentemente elettroporazione 12,13 per lo studio degli interneuroni. A causa della loro scarsità relativa e ventrale dell'embrioneorigine nic, questa popolazione di neuroni è dimostrato difficile da colpire. La nostra tecnica fornisce i mezzi per effettuare analisi cellula-autonoma di interneuroni CGE-derivati. Gli alti livelli di espressione eGFP consentono la visualizzazione e l'analisi dei singoli interneuroni.
Applicazioni future
Combinando l'uso di plasmidi specifici e linee di topi geneticamente modificati è possibile ottenere un controllo temporale e spaziale nella espressione di geni di interesse. Ad esempio, abbiamo usato un Dlx5 / 6-Tta plasmide per attivare l'espressione dei transgeni Teto inducibili. In questi esperimenti, siamo stati in grado di mettere a tacere l'espressione del transgene da amministrare Doxycycline 8. Attualmente stiamo sviluppando un protocollo per utilizzare la tecnica in combinazione con il sistema creer.
Fasi critiche all'interno del protocollo
Per raggiungere l'elettroporazione e la sopravvivenza efficiente, cercare di evitare excesSIVE manipolazione degli embrioni e / o organi. Inoltre, evitare di pizzicare le arterie e le vene. Il mouse diventerà rapidamente ipovolemico in caso di sanguinamento. Dopo l'elettroporazione è completata, posizionare gli embrioni e gli organi nelle stesse posizioni in cui li avete trovato per evitare pieghe di creare che potrebbero causare ipossia. Obiettivo per 20 minuti o meno tempo chirurgico. Idratare la cavità addominale con PBS numerose volte durante l'intervento chirurgico. Durante l'elettroporazione, cercare di forare il ventricolo solo una volta con l'ago capillare. Puntura ripetitivo diminuirà il tasso di sopravvivenza. Dopo il periodo di formazione, il tasso di sopravvivenza dovrebbe essere 80% o superiore.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati a Lihong Yin per l'assistenza tecnica. NVD è destinatario di un NARSAD Young Investigator Award ed è anche sostenuto da sovvenzioni dal NIH (5 K99 MH095825-02). La ricerca in laboratorio Fishell è sostenuto dal National Institute of Health, Istituto Nazionale di Salute Mentale (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Istituto nazionale dei disordini neurologici e Stroke (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) e la Fondazione Simons.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
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