Abstract
Studiet av sentralnervesystemet (CNS) modning er avhengig av genetisk målretting av nevronale populasjoner. Imidlertid har den oppgave å begrense ekspresjonen av gener som er av interesse for spesifikke nevronale subtyper vist seg bemerkelsesverdig utfordrende på grunn av den relative mangelen på spesifikke promoter elementer. Gabaergic interneurons utgjør en neuronal befolkning med omfattende genetisk og morfologisk mangfold. Faktisk har mer enn 11 forskjellige undertyper av gabaergic interneurons vært preget i musen cortex en. Her presenterer vi en tilpasset protokoll for selektive mål som gabaergic populasjoner. Vi oppnådde subtype selektiv målretting av gabaergic interneurons ved å bruke forsterkerelementet av homeobox transkripsjonsfaktorene Dlx5 og Dlx6, homologer av Drosophila distal løse (DLL) genet 2,3, å kjøre uttrykket av spesifikke gener gjennom in utero electroporation.
Introduction
Hovedtyngden av kortikale gabaergic interneurons stammer fra to forbigående embryonale strukturer kalt mediale og caudal ganglieblokkere eminenser (henholdsvis MGE og CGE) 4. Parvalbumin og somatostatin uttrykke interneurons opprinnelse i MGE mens calretinin (Cr), Vasointestinal peptid (VIP) og Reelin (Re) uttrykker interneurons stammer fra CGE. Disse Interneuron subtyper kan være preget av deres fødselsdager. MGE avledet subtyper er født mellom embryonale dag 9,5 (e9.5) og e16.5 5,6. I kontrast er CGE avledet interneurons født fra E12.5 gjennom e18.5 med sin produksjon topp på e15.5 seks. Den genetiske målretting av dette sent fødte befolkningen imidlertid fortsatt ukjent.
De murine distal løse (Dlx) gener er utelukkende uttrykt i utviklings ventral forhjerne tre. Gabaergic interneurons og striatum-projeksjon nevroner, men ikke kortikale pyramidale celler uttrykker Dlx1, 2,5, og 6 gener på tidlige utviklingsstadier tre. Faktisk er de Dlx gener uttrykt i MGE og CGE subventricular sone (SVZ) på alle gabaergic stamfedre. Uttrykk av disse genene blir begrenset til å velge subtyper på postmitotic stadier 7-9. Forrige eksperimentelle bevis viste at Dlx5 / 6 forsterkerelement gir mulighet for selektiv målretting av gabaergic linjene i transgene musemodeller to. Vi testet ved bruk av en av disse forsterkerelementer i forbindelse med episomal ekspresjon i den tredje musehjerne. Vi sub klonet Dlx5 / 6 forsterkerelement sammen med en minimal promoter og den forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) i en Bluescript (BS) ryggrad plasmid (figur 1). Vi introduserte plasmidet ved hjelp av in utero electroporation på e15.5 å selektivt målet Cr-, VIP og re subtyper 3,8,10. Vår teknikk gjør det mulig for sparsom elektroporering, noe som lettergjenoppbygging av morfologiske trekk ved svi celler. I tillegg er de usedvanlig høye nivåer av genekspresjon i kortikale neuroner gabaergic åpner for funksjonelle studier. Vi gjennomførte tap og gevinst på funksjons studier med flere villtype og dominerende negative gener 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrene ble behandlet i henhold til forskrift og retningslinjer fra Institutional Animal Care og bruk komité ved NYU School of Medicine.
Musestammer
Sveitsiske Webster hunnmus levert av Taconic ble brukt for disse eksperimentene. For spesifikt mot overfladiske laget interneurons ble e15.5 embryoer brukt.
Merk: plasmid brukes i dette arbeidet (Dlx5 / 6.eGFP plasmid 3 mikrogram / mL) ble generert ved hjelp av standard kloningsteknikker. Den EGFP cDNA ble klonet inn i en Dlx5 / 6-Pmin-polyA plasmid. Dette plasmidet er tilgjengelig på forespørsel (demarn02@nyumc.org).
1. Utarbeidelse av Mikroinjeksjon Pipettes
- Sett avtrekker Heat # 2-860.
- Plasser og sikre glasset kapillær nær glødetråden. Kontroller at den ytre diameter (OD) av pipetten er omtrent 30 mikrometer.
- Trykk på "pull"-knappen.
- Fjern forsiktig kapillær. Den nederste delen er nålen. Kast den øverste delen.
2. Anestesi Prosedyre
- Forbered en isofluran inneholder kammer. Merk: Isofluran er den foretrukne bedøvelse på grunn av sin raske aksjon, og lav forekomst av bivirkninger. Pentobarbital er et annet alternativ; derimot, er toleranse for dette stoffet variabel og kan føre til en høyere dødelighet enn isofluran.
- Sett strømmen av isofluran til 4-5% i 0,5-1 l / min O 2.
- Kontroller at ventilen for kammeret er åpen mens ventilen for hodet adapteren er lukket.
- Plasser den gravide mus i kammeret.
- Tillat musen til å gå under påvirkning av anestetika. Dette vil ta ca 2-3 min. Kontroller pustefrekvens. Hvis musen begynner å hyperventilere, redusere dosen av isofluran.
- Etter at musen er bedøvet, umiddelbart fjerne det fra kammeret. Plasser den ventral siden opp på varmeputen og jegnsert hodet i maske som vil fortsette å levere isofluran hele operasjonen. Sørg for å slå strømmen av isofluran fra kammeret til slangen som forbinder hodet adapter stykke. Ta en dråpe øye smøremiddel i hvert øye og lukk øynene.
- Sett varmeputen til 36 ° C grader for å minimere hypotermi.
- Sjekk for fraværet av foten og halen reflekser ved å knipe de bakre poter og hale.
3. Kirurgi
- Renser huden som dekker magen med 70% etanol.
- Bruk pinsett til å dra huden oppover. Etter hver operasjon, vaske alle instrumenter med såpe og vann, og steriliseres ved 72 ° CO / N.
- Lag en liten loddrett snitt (ca. 2 cm) langs midtlinjen begynner midtveis mellom den tredje og fjerde par av brystkjertlene. Bruk tynne kirurgi saks. Vær nøye med å ikke skade bukveggen.
- Forsiktig skille huden fra bukhinnen.
- Visualisere arterieneog vener på bukveggen. Lag en annen 2 cm vertikalt snitt gjennom bukhinnen (unngå fartøyene) å eksponere bukhulen.
- Klem huden og bukveggen på hver side unngå klem arteriene. Merk: Hvis arteriene er et uhell punktert, ofre dyret umiddelbart ved å utføre halshugging eller isofluran overdose.
- Pre varm steril PBS til 37 ° C. Dekk klemmer med PBS fuktige Kim våtservietter.
- Fukte den eksponerte bukhulen med PBS. Gjenta dette trinnet flere ganger mens du utfører operasjonen.
- Bruke runde tang, trekker forsiktig den embryonale kjeden (e15.5) bort fra hulrommet. La kjeden resten på våtservietter. Start ved å utsette en halvdel av livmoren først. Når embryoene i det er electroporated, bringe den tilbake inne, deretter arbeide på den andre halvdelen.
4. Electroporation
- Fortsett å bruke runde pinsett til å manipulere embryoene.
- Visualize sideventriklene. Sideventriklene går langs midtlinjen (Figur 1b).
- Legg Fast Grønn (lager: 10% w / v) til DNA-løsningen for en 01:20 blanding for å visualisere det under injeksjonen. Klargjør DNA-løsning ved å oppløse pelleten oppnådd fra en standard maksi-prep rensing protokollen i destillert vann.
- Bruk pre trukket mikropipetter med stempelet for å injisere en ml av DNA-løsningen (Dlx5 / 6-EGFP, 3 mikrogram / mL) med Fast Green. Skjær spissen av mikropipette med en fin forcep # 5 (Dumont) å la 6 mm lengde fra begynnelsen av skulderen til enden av spissen av nålen før lasting av pipetten. Hold hodet av embryoet med runde pinsett. Inn i hjernen med pipetten i 45 ° vinkel sikter til den laterale ventrikkel ligger i nærheten av midtlinjen. Hvis nålen trenger gjennom ventrikkel, sakte trekke pipette som du bruker stempelet for å injisere DNA. Ventrikkelen skal bli grønn nårLøsningen begynner å fylle den. På dette punktet, slutter å bevege pipette og injisere en ml av DNA. Forsiktig, trekke pipetten.
- Sett CUY21 electroporator til fem 45V pulser av 50 msek linjeavstand ved 950 msek.
- Bruk 5 mm padle elektroder for e15.5 embryoer. Dypp elektrodene i PBS for å sikre effektiv dagens sending.
- Plasser elektrode skovlene rundt embryoet hode med den positive padle på ventrikkelen inneholdende DNA-løsningen. Litt lavere positiv padle med hensyn til negativt å skape en ventral strøm gjennom ganglieblokkere eminences. Dette manipulasjon vil minimere ektopisk uttrykk i pyramidale celler.
- Etter plassering av elektrodene, leverer en puls ved hjelp av fotpedalen gang.
- Fjern elektrodene og tørk dem rene. Gjenta trinn 04.06 til 04.09 med hver embryo.
- Etter electroporating alle embryoer, hell 3 ml PBS inn i bukhulen og returnere dem til bukhulen.
- Først sutur bukveggen med en buet nål og 5-0 silke sutur og deretter huden. Påfør Lidokain (4%) på såret. Administrer 120 mg / kg av Aspirin intra peritoneum for smertelindring.
Merk: Hele prosedyren skal utføres i 20 min eller mindre. Det anbefales at nybegynnere bare electroporate noen embryoer for å holde driftstiden kort. Langvarig operasjoner vil redusere overlevelsen av embryoene. - Fjern dyret fra anestesi slangen og tillater utvinning av varmeputen på en papir-serviett.
- Returnere dyr til buret, holde den på varmeputen ved 37 ° C og overvåke helsetilstanden. Dyrene bryter vanligvis tolerere operasjonen godt og begynner å bevege seg sakte snart etter at de er fjernet fra anestesi slangen. Hvis overdreven blødning eller apati er observert, ofre dyret umiddelbart ved å utføre IACUC godkjent eutanasi prosedyrer som for eksempel halshugging eller anestesi overdose.
- Returnere bur til vivarium. Hunnene vil føde naturlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tilpasset in utero electroporation teknikk for å oppnå celletype spesifikk målretting av forfalte nevroner. For å drive uttrykk for EGFP i CGE-avledet interneurons, brukte vi Dlx5 / 6 forsterkerelement og begrenset våre injeksjoner til e15.5, scenen når flertallet av CGE-avledet interneurons genereres. Vi har gjennomført analysen på P8 og P15 11 (figur 1 og 2). Vi bekreftet ventral opprinnelsen electroporated nevroner av co electroporating en CAG-mCherry og en Dlx5 / 6-EGFP plasmider ved ekvimolare konsentrasjoner på e15.5. I dette forsøket ble det observert at bare ventrale progenitorer som ligger i subventricular sone (SVZ) co uttrykte begge proteiner 11. Denne spatio temporal ekspresjon av fluorescerende proteiner faller sammen med den normale utviklingsmessige ekspresjon av Dlx5 og 6 gener som ikke er uttrykt i den ventrikulære men subventricular sone fire. Videre har vi vurdert GABAergic identiteten Dlx5 / 6-mCherry electroporated interneurons i en GAD67-EGFP knockin mus linje. Vi fant at det store flertallet av electroporated nevroner uttrykt GAD67, et enzym uttrykt av alle gabaergic celler 11. I tillegg har vi bestemt subtype identiteten electroporated interneurons ved å utføre immunhistokjemi og elektrofysiologisk analyse på P15. Mønsteret av uttrykk av subtype spesifikke markører ble avslørt av immunfluorescens i Kryostat avsnitt 11 (figur 2). Vi fant ut at interneurons electroporated på e15.5 nesten utelukkende uttrykke NPY, Reelin, VIP og Cr, tidligere beskrevet CGE-avledet Interneuron markører seks. Videre den iboende elektrofysiologiske egenskapene til disse nevronene er i samsvar med den som tidligere beskrevet i skjebne kartleggingsstudier 6,11. Alle sammen, disse resultatene tyder på at electroporasjon med Dlx5 / 6 forsterkerelement på e15.5 selektivt målet CGE-avledet Interneuron subtyper.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av electroporation eksperimenter. a) Subkloning strategi for Dlx5 / 6-EGFP-plasmidet. b) Diagram som illustrerer den eksperimentelle strategi.
Figur 2. electroporated interneurons er avgrenset av uttrykket av CGE-avledet subtype markører. A) CGE-avledet interneurons electroporated med en Dlx5 / 6-EGFP plasmid. Legg merke til den sparsomme electroporation av ulike CGE subtyper. B) En VIP-uttrykke interneuron på P8. EGFP uttrykk beskriver detHele dentritic treet og aksonal arbor av enkeltnerveceller. C) En NPY-uttrykke interneuron på P8. NPY uttrykk avtegner neurogliaform celler. D) Et NPY-uttrykke interneuron på P15. Scale bar A, 100 mm; BD, 50 mm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Begrensninger av teknikken
Selv om denne teknikken gjør det mulig for celle autonom analyse av celleprosesser, er det ikke egnet for analyse populasjon. De electroporations er svært sparsommelig med mindre enn tusen celler electroporated per hjernen. Som en konsekvens, kan teknikken ikke benyttes til å vurdere atferdsmessige konsekvenser som følge av den genetiske manipulering av CGE-avledet interneuroner.
Mens electroporations utført ved e13.5-E14.5 target MGE-avledet subtyper, er effektiviteten lav 10. Vi spekulerer i at Dlx5 / 6 Enhancer er mindre aktive i postmitotic MGE subtyper minst i sammenheng med episomal uttrykk.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Teknikken representerer avansement fra tidligere electroporation metoder 12,13 for studiet av interneurons. På grunn av sin relative knapphet og ventral embryonic opprinnelse, har denne populasjonen av nevroner vist seg vanskelig å målrette. Vår teknikk gir mulighet til å utføre celle-autonome analyse av CGE-avledet interneuroner. De høye nivåene av EGFP uttrykk tillate for visualisering og analyse av enkelt interneurons.
Fremtidige søknader
Ved å kombinere bruk av spesifikke plasmider og genetisk modifiserte mus linjer er det mulig å oppnå temporal og spatial kontroll av ekspresjonen av gener som er av interesse. For eksempel brukte vi en Dlx5 / 6-Tta plasmid for å slå på uttrykk for Teto induserbare transgener. I disse eksperimentene, var vi i stand til å slå av transgene uttrykk ved å administrere Doxycycline åtte. Vi utvikler for tiden en protokoll for å bruke teknikken i kombinasjon med Creer system.
Kritiske trinn i protokollen
For å oppnå effektiv elektroporering og overlevelse, prøv å unngå excestende manipulering av embryoer og / eller organer. I tillegg, unngå å klemme arterier og vener. Musen vil raskt bli hypovolemisk hvis blødningen oppstår. Etter elektroporering er ferdig, plasserer embryoene og organer i samme posisjoner der du fant dem til å unngå å skape knekk som kan forårsake hypoksi. Sikt på 20 min eller mindre kirurgi tid. Fukte bukhulen med PBS mange ganger i løpet av operasjonen. Under electroporation, prøv å punktere ventrikkelen bare én gang med kapillær nål. Repetitive punktering vil redusere overlevelsen. Etter opplæringsperioden, bør overlevelsen være 80% eller høyere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Lihong Yin for teknisk assistanse. NVD er en mottaker av en NARSAD Young Investigator Award, og er også støttet med tilskudd fra NIH (5 K99 MH095825-02). Forskning i Fishell lab er støttet av National Institute of Health, National Institute of Mental Health (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Nasjonalt institutt for nevrologiske lidelser og hjerneslag (fem R01 NS081297-02, en P01 NS074972 -01A1) og Simons Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
