Summary
Décrit ici est un protocole d'imagerie semi-automatisé de la fluorescence spécifique de tissu d'embryons de poisson zèbre.
Abstract
Embryons de poisson zèbre constituent un outil puissant pour le dépistage à grande échelle de petites molécules. Poisson-zèbre transgénique qui exprime des protéines rapporteurs fluorescents sont fréquemment utilisés pour identifier des produits chimiques qui modulent l'expression des gènes. écrans chimiques qui essai de fluorescence chez le poisson zèbre en direct s'appuient souvent sur des équipements coûteux, spécialisé pour le criblage à haut contenu. Nous décrivons une procédure à l'aide d'un microscope à épifluorescence standard avec une platine motorisée à automatiquement l'image des embryons de poisson zèbre et de détecter la fluorescence spécifique de tissu. Utilisation de poisson-zèbre transgénique pour signaler que l'activité du récepteur des oestrogènes via l'expression de la GFP, nous avons développé une procédure semi-automatique pour cribler des ligands du récepteur de l'œstrogène qui activent le rapporteur d'une manière tissu-spécifique. Dans cette vidéo, nous décrivons les procédures pour rangeant embryons de poisson zèbre à 24-48 heures après la fécondation (HPF) dans une plaque de 96 puits et ajouter de petites molécules qui se lient les récepteurs des œstrogènes. À 72-96 HPF, des images de chaque puits dela totalité de la plaque sont collectées automatiquement et manuellement pour inspecter fluorescence spécifique d'un tissu. Ce protocole démontre la capacité de détecter les oestrogènes qui activent les récepteurs dans les valves cardiaques, mais pas dans le foie.
Introduction
Poisson-zèbre transgénique ont été développés qui permettent la visualisation directe de l'activité dans les voies, telles que les facteurs de croissance des fibroblastes 1, l'acide rétinoïque et les œstrogènes 2 3, dans embryons vivants signalisation. De tels outils permettent le dépistage de substances qui perturbent les voies de signalisation (dosée comme changement de l'intensité de fluorescence) ou à des composés chimiques qui modulent la signalisation d'une manière spécifique d'un tissu (changement de fluorescence localisation) 4. Capture d'image automatisé augmente le débit d'écrans chimiques considérablement 5,6. Écrans fluorescence dosage automatiquement chez le poisson zèbre en direct s'appuient souvent sur des équipements coûteux, spécialisé. Soi-disant criblage à haut contenu offre l'avantage de la haute résolution, l'imagerie quantitative, mais au prix de l'utilisation de lecteurs de plaques spécialisées équipées pour la microscopie confocale 7,8. Le but de cette méthode est d'automatiquement fluorescence spécifique des tissus essai dans embryons de poissons zèbresdans une plaque à 96 puits en utilisant un microscope à épifluorescence standard. Fluorescence spécifique d'un tissu peut être distingué en utilisant cette technique et peut-être une approche raisonnable pour les laboratoires qui n'ont pas accès aux lecteurs de plaques spécialisées ou de l'équipement de haute teneur dépistage.
Dans ce protocole, nous utilisons l'imagerie automatisée pour détecter récepteur des oestrogènes tissu-spécifique (ER) des agonistes chez le poisson zèbre en direct à 3 jours après la fécondation (DPF). La lignée transgénique Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contient 5 tandem réponse aux œstrogènes séquences d'ADN d'éléments (ERE) en amont de la protéine fluorescente verte (GFP) 3. En l'absence de ligand, RÉ sont normalement inactifs. La liaison du ligand déclenche un changement de conformation, ce qui permet de lier les récepteurs ERE ADN et régulent la transcription 9. 5xERE: poissons GFP peuvent être utilisés pour cribler des bibliothèques chimiques pour modulateurs ER et peuvent être utilisés pour cribler des échantillons d'eau de l'environnement pour les contaminants oestrogéniques.
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Protocol
NOTE: Ce protocole a été approuvé par l'Université de l'Alabama à comité de protection et d'utilisation des animaux Birmingham.
1. Élevage de poisson zèbre et collections d'œufs
- Trois jours avant le début de l'exposition aux produits chimiques, assembler bassins d'élevage avec séparateurs à mâles et femelles séparés. Remplir chaque mi-chemin du réservoir avec de l'eau du système de l'aquaculture. L'utilisation d'un filet, transférer Tg (5xERE: GFP) poissons c262/c262 de bassins d'élevage, en plaçant 2 mâles et 3 femelles dans chaque réservoir séparé par un diviseur. Placez un couvercle sur chaque réservoir et l'étiquette avec la date et les souches à franchir.
- Le lendemain matin, enlever tous les obstacles et de l'inclinaison des déflecteurs pour créer une zone peu profonde à une extrémité de l'aquarium de reproduction. Laisser le poisson zèbre pour s'accoupler, la collecte des embryons à des intervalles de 10 min pour assurer la mise en scène de développement précis. Œufs propres par rinçage à travers une passoire à thé en utilisant un milieu E3B et rincer délicatement les embryons dans des boîtes de Pétri. Retour de poissons adultes à permanenteles réservoirs.
- En utilisant un microscope de dissection, trier, compter, et enlever les embryons non fécondés, anormales ou endommagées. La place des embryons dans des boîtes de Pétri en milieu E3B et maison à 28,5 ° C avec une lumière 14h10: cycle d'obscurité. densité de l'embryon peut affecter le développement. Ne placez pas plus de 100 embryons dans une boîte de 100 mm x 35 et pas plus de 50 embryons dans une boîte de 60 mm x 15.
- En 24 HPF, remplacer le support avec E3B contenant 200 uM 1-phényl 2-thiourée (PTU). PTU empêche la formation de pigment et conserve les embryons de poisson zèbre et de larves transparentes pour une clarté d'image. ATTENTION: concentré PTU boursier est dangereux; porter des gants lors de la solution E3B + PTU.
- A après la fécondation 1 jour (DPF), supprimer manuellement le chorion de l'embryon à l'aide de pinces fines. Le chorion ne semble pas affecter la pénétration des oestrogènes, mais la suppression améliore la clarté d'image. Il n'est pas nécessaire de retirer chorions des médias. NOTE: Comme alternative à dechorionation manuel, des lots d'embryons peuvent être Chemiquement dechorionated en utilisant 1 mg / ml de pronase traitement, comme décrit précédemment 11.
2. Traitement chimique des embryons
- Le jour avant le traitement, la préparation des solutions mères de chaque produit chimique à une concentration 1000 fois dans du DMSO (ou solvant approprié). Par exemple, pour exposer les embryons à 10 uM bisphénol A (BPA), préparer une solution stock mM BPA de 10 à 100% de DMSO. Ceci assure la concentration de DMSO dans chaque traitement uniforme et permet une non-toxique 1:1000 dilution de DMSO pour servir de contrôle du véhicule. Solutions magasin de stock à -20 ° C. Pour ce protocole, les embryons seront exposés à 1 pM et 10 pM BPA, 18,5 nM et 1,85 uM génistéine, 367 nM d'estradiol (contrôle positif) et véhicule (0,1% de DMSO, témoin négatif).
ATTENTION: Les produits chimiques comme le BPA et l'estradiol sont dangereux et peuvent avoir des effets néfastes sur le fœtus humain. Poignée perturbateurs endocriniens avec soin et toujours utiliser un équipement de protection individuelle approprié. - Le jour du traitement, d'dégel préparé des solutions chimiques. Diluer 1:1000 par pipetage 1 ml E3B + PTU dans un tube de 1,5 ml et en ajoutant 1 pl de solution stock chimique. Vortex vigoureusement. Diluer DMSO 1:1000 dans E3B + PTU comme un contrôle de véhicule. Utilisez 1 ml E3B + PTU dans un tube de centrifugation de 1,5 ml comme un témoin non traité.
- En utilisant un grand pipette de transfert en plastique de l'alésage, de transfert d'embryons à partir des boîtes de Pétri dans chaque puits d'une plaque à 96 puits, 3 embryons par puits, 3 puits par condition. Pour éviter l'évaporation au cours du traitement prolongé, omettre embryons de lignes extérieures et les colonnes de la plaque (lignes A et E, les colonnes 1 et 12). Puits extérieurs peuvent être remplis avec 300 pl de E3B + PTU. Etiqueter le couvercle de la plaque de manière appropriée.
- Retirez le support de chaque puits avec une fine pointe de transfert en plastique pipette. Travaillez rapidement pour éviter le dessèchement des embryons.
- Ajouter 200 ul de solution de traitement dans le puits correspondant. Placer le couvercle underneath la plaque en tant que guide pour assurer l'addition de traitements dans les puits appropriés. Vortex chaque tube avant pipetage pour distribuer le produit chimique en solution. Confirmer visuellement chaque embryon est dans la solution de traitement. Si les embryons sont sur le côté du puits, utiliser une pipette de transfert propre à les laver dans le puits avec la solution de traitement.
- Placer la plaque dans l'incubateur à 28,5 ° C. Les embryons seront analysés pour la fluorescence à 72 HPF.
3. Automated Imaging des embryons en plaques à 96 puits
- Anesthésier les embryons en ajoutant 10 ul de 4 mg / ml de tricaïne à chaque puits.
REMARQUE: Anesthetize embryons avant l'imagerie. À 24-96 HPF, le poisson-zèbre exposer mouvement spontané et une réaction de sursaut à la source de lumière changeante pendant la capture d'image. Anesthésier embryons réduit le mouvement lors de l'imagerie. - Placer la plaque de 96 puits dans la platine motorisée et calibrer la scène. Utilisation Zeiss Zen Bleu de 2011 logiciels pour la microscopie automatiquementsur et de contrôle, sélectionnez l'option de support de l'échantillon et de sélectionner multipuits 96. Sélectionnez étalonnage. Suivez les instructions pas à pas pour calibrer la scène.
NOTE: Ne pas décocher le bouton tuiles après cette étape. Si le bouton de tuiles n'est pas cochée, les paramètres d'étalonnage peuvent être perdues et la plaque de 96 puits devront être recalibré. - L'utilisation d'un objectif 10x et le fond clair (BF) fixant, identifier un embryon de contrôle positif et définir les paramètres d'exposition appropriée pour BF et canaux de GFP, faire en sorte que le signal de fluorescence est pas saturer la caméra. Focus sur un seul embryon et programmer le microscope pour acquérir 3 total Z-sections, une image 50 um ci-dessus et un 50 um ci-dessous le plan focal actuel.
NOTE: En raison de différents tissus occupent différents plans focaux, ce qui garantira que pour chacune des images de poisson zèbre sont capturées avec le coeur et le foie au point. - Définissez les paramètres du logiciel à acquérir une image en mosaïque utilisant la GFP et BF Channels. Sous l'onglet d'acquisition, sélectionnez la configuration avancée. Certaines régions de tuiles, puis les tuiles. Choisissez l'option cercle bien.
REMARQUE: Carrelage est utilisé pour créer une image composite de chaque puits. Un champ de vision unique ne saisit qu'une petite partie de chaque bien. La fonction de carrelage peut capturer automatiquement multiples adjacent de chaque puits des champs de vue, la création d'une image composite de l'ensemble du bien. Il est donc possible de capturer automatiquement des images composites 96 par plaque, où chaque image composite contient plusieurs dizaines d'images individuelles à partir d'un seul bien. - Sélectionnez transporteur et le facteur de remplissage de 90%. La sélection d'un facteur de remplissage de 90% sera capturer plusieurs images des puits choisis de telle sorte que 90% de la surface de chaque puits est visible dans l'image composite.
Remarque: Lors de la sélection facteur de remplissage, un diagramme est affiché représentant la zone à imager. Sélectionnez un pourcentage qui comprendra la zone du puitsqui est appropriée pour l'expérience. - Sous Options, sélectionnez la quantité de chevauchement souhaité.
NOTE: Lorsque la couture de tuiles pour une seule image représentant, un chevauchement de 5-10% permet une couture lisse entre les images. Toutefois, si l'assemblage des images n'est pas nécessaire, en utilisant un recouvrement de 0% sera de réduire le temps d'imagerie. Utilisation de 90% facteur de remplissage et 5% de chevauchement, une image composite d'un seul puits est constitué de 59 images individuelles. - Lancer imagerie. Le microscope va acquérir automatiquement les images.
- Inspecter manuellement images composites de chaque puits pour la fluorescence spécifique du tissu (figure 1).
- NOTE: Il est préférable de commencer avec le contrôle positif à confirmer que l'exposition chimique travaillé avant à l'observation des puits de traitement expérimental.
4. L'image saisie manuelle des embryons en plaque de 96 puits
REMARQUE: Pour confirmer les résultats, utilisez un objectif 20x à longue distance de travail à acQuire des images plus détaillées manuellement (Figure 2).
- L'utilisation d'un objectif 20x et le fond clair (BF) fixant, identifier un embryon de contrôle positif et définir les paramètres d'exposition pour les canaux BF et GFP de manière appropriée, en veillant à ce que le signal de fluorescence est pas saturer la caméra.
- Identifier les embryons individuels et de capturer des images manuellement.
NOTE: Une fois les paramètres d'exposition ont été sélectionnés pour l'embryon de contrôle positif, ne pas modifier les réglages. Ceci permet une comparaison de l'intensité de fluorescence en tant que chaque image est capturée dans des conditions uniformes.
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Representative Results
La figure 1 montre des images composites à partir de puits individuels d'une plaque à 96 puits. Chaque image composite est composé de 59 images individuelles avec 5% d'image de chevauchement. Notez que le poisson zèbre en direct sont orientés de façon aléatoire au sein de chaque bien, mais nous sommes en mesure de distinguer la fluorescence dans le coeur du foie. Images en fond clair sont utiles comme références pour évaluer l'orientation du poisson zèbre et de visualiser les anomalies morphologiques (Figures 1A et 1C). Imagerie automatisée en utilisant un objectif 10x est utilisé pour cribler des produits chimiques et déterminer qui garantit l'évaluation manuelle à un plus fort grossissement. Figure 2 montre des images prises avec un objectif 20x à longue distance de travail pour une analyse plus détaillée. Ces images ont été prises immédiatement après le balayage automatisé illustré sur la figure 1, sans enlever la plaque de la platine du microscope. L'utilisation d'un objectif 20x, la fluorescence dans le cœur peut être localisé précisément à cœur valves (figures 2C-2F). Parfois, l'orientation des embryons peut être sous-optimale pour capturer des images et peut conduire à des résultats ambigus. Placer le poisson zèbre 3 par puits et effectuer chaque traitement en trois exemplaires (protocole étape 2.3) offre de multiples possibilités pour visualiser la fluorescence précision.
. Figure 1 Automated Imaging composite révèle une fluorescence spécifique des tissus dans les valves cardiaques et le foie fond clair (A, C) et fluorescente (B, DH) images de Tg (5xERE: GFP). Embryons c262/c262 traités avec des produits chimiques indiqués à 2 jours après fertilisation (DPF) et imagée à 3 dpf. Chaque panneau présente une image composite d'un seul bien (composé de 59 images individuelles avec 5%chevauchement) à partir d'une plaque de 96 puits. A et B, embryons incubés dans 0,1% de DMSO (contrôle du véhicule) sont GFP-négatif. CH, embryons incubés avec 100 ng / ml 17β-estradiol (E2), 1,85 uM génistéine (gen) , ou 10 uM BPA exposition fluorescence dans les valves cardiaques (flèches) et le foie (pointes de flèches), les embryons traités avec 18,5 nM gen ou 1 uM BPA exposition fluorescence dans les valves cardiaques, mais pas le foie. B ', image numériquement agrandie d'une seule larve de la région encadrée dans la partie B. D', l'image agrandie numériquement de la région de boîte de panneau D, et ainsi de suite. Barre d'échelle = 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode simple pour automatiquement fluorescence spécifique des tissus image embryons de poisson zèbre. Le protocole a été développé en utilisant un Zeiss Axio Observer. Z1 avec Zen logiciel Blue 2011, cependant la technique peut être adaptée en utilisant n'importe quel microscope inversé avec une platine motorisée et un logiciel de contrôle de microscope qui peut effectuer carrelage pour créer des images composites. L'équipement d'un microscope inversé avec une platine motorisée peut fournir une alternative pratique, moins coûteux à l'achat d'équipement spécialisé pour le criblage à haut contenu. Platines motorisées varient de quelques milliers à des dizaines de milliers de dollars américains, selon la marque et le modèle du microscope et de la qualité de la scène.
Il ya plusieurs étapes critiques dans le protocole. Certains produits chimiques sont sensibles à la lumière, donc il peut être bénéfique pour incuber les embryons dans l'obscurité pendant le traitement. Embryons de poisson zèbre sont sensibles à la dessiccation. Par conséquent, pour chimicocal exposition de plus d'une journée, il est essentiel de remplir les puits le long des bords de la plaque de 96 puits avec les médias pour limiter l'évaporation (protocole étape 2.3).
Il est également important de veiller à ce que l'étage est calibré attentivement (protocole étape 3.2). Une erreur commune est de placer la plaque sur la scène sans fixer la plaque complètement. Dans ce cas, la position de la plaque sur la scène peut changer quand la scène se déplace, ce qui pourrait causer des puits à imager partiellement ou pas du tout. Lorsque plusieurs plaques d'imagerie en succession, il n'est pas absolument nécessaire de réétalonner le stade pour chaque plaque, aussi longtemps que les plaques sont du même fabricant et sont tous placés dans l'étape dans des orientations identiques.
Lors du réglage des paramètres de carrelage d'image automatiques (protocole d'étape 3.5), veiller à ce que la majorité de chaque puits sera imagée. A 3 dpf et plus, larves de poisson zèbre ont tendance à se positionner à proximité des bords de la well, par conséquent, un facteur de remplissage de 90% est recommandé de veiller à ce que les bords de chaque puits seront visualisés. Cependant, plus le facteur de remplissage le plus long, le temps d'acquisition d'images.
Il est possible d'effectuer un algorithme de couture sur des images composites pour améliorer la résolution. Si un algorithme de couture doit être exécutée, puis définir les paramètres de carrelage à inclure une image chevauchement de 5-10% (protocole de l'étape 3.6). Plus le chevauchement, meilleure est la performance de l'algorithme de la couture. Dans certains cas, un recouvrement de 10% peut permettre la couture pour produire une image pour l'analyse d'information qui ne nécessite pas en outre la visualisation en utilisant un objectif à grossissement plus élevé. Cependant, plus le chevauchement de l'acquisition d'image plus aura, comme d'autres images seront capturées par puits. Un chevauchement de 0% peut être utilisé pour réduire le temps d'acquisition d'image et de réduire l'exposition de la lumière fluorescente et photoblanchiment. Dans ce cas, capturer des images plus détaillées de certains puits en utilisant un objecti 20xve (Figure 2).
Temps de capture d'image pour ce protocole va dépendre des paramètres expérimentaux. acquisition de l'image en utilisant les paramètres de ce protocole (90% facteur de remplissage, 5% de chevauchement, trois profilés en Z par image capturée et un temps d'exposition de 50 ms pour le canal de la GFP et 1 ms pour le canal de fond clair) prend trois minutes et 50 secondes par puits. Par conséquent, il est possible de cribler 60 des puits en trois heures et 50 minutes. Il est possible de cribler les 180 puits par jour, soit 60 des composés uniques, en triple exemplaire.
Ce protocole permet d'imagerie automatisé pour la fluorescence spécifique de tissu, mais a plusieurs limites. Widefield imagerie de fluorescence n'a pas la résolution de l'imagerie confocale utilisés dans de nombreuses techniques de criblage à haut contenu. En outre, quantification de la fluorescence est difficile en raison de la grande variabilité dans l'orientation de chaque poisson zèbre dans un puits. Cela pourrait être évité par l'imagerie poisson zèbre sous uniformeconditions d'orientation, par exemple en utilisant des moules ou des microplaques avec des puits qui forcent les embryons de poisson zèbre en orientations uniformes 5,10. Le temps d'acquisition d'image limite le nombre de puits qui peuvent être criblés par jour à 180. Screening 180 puits par jour est une amélioration significative sur l'imagerie manuel. Cependant, les méthodes à haut débit typiques peuvent dépister une moyenne de 10 000 puits par jour, mais nécessitent des postes de travail complexes et coûteux.
Ce protocole représente une alternative pratique, moins cher pour le criblage à haut contenu qui peut être facilement adapté par les laboratoires avec un microscope de fluorescence à champ large inversé. Procédé de formation d'image décrit ici permet l'analyse de la fluorescence spécifique de tissu d'embryons qui n'ont pas été orienté ou monté avec soin, ce qui améliore considérablement la rapidité et la facilité de préparation de l'échantillon. Les images composites peuvent être archivées pour référence. Ce protocole a été développé pour permettre criblage à haut débit of ligands des récepteurs aux œstrogènes spécifiques d'un tissu à partir de bibliothèques chimiques et des échantillons d'eau de l'environnement. En variante, ce protocole d'imagerie peut être utilisé pour cribler une quelconque rapporteur fluorescent pour l'activité spécifique d'un tissu.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions Susan Farmer et le personnel du centre de recherche de poisson zèbre UAB pour les soins du poisson zèbre. Le financement fourni par les fonds de démarrage du Département de pharmacologie et de toxicologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35 mm plates | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60 mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl - 17.2 grams KCl - 0.76 grams CaCl2-2H2O - 2.9 grams MgSO4-7H2O - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150 ml 2% methylene blue 100 μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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