Summary
Болезнетворных мутаций в актина может изменить цитоскелета функцию. Цитоскелета динамика количественно через визуализации флуоресцентно меченых белков с использованием полного внутреннего флуоресцентной микроскопии. Например, белок цитоскелета, Aip1p, изменила локализацию и движение в клетках, экспрессирующих мутантный актина изоформы, R256H.
Abstract
Мутации в актина вызвать целый ряд заболеваний человека из-за специфических молекулярных изменений, которые часто изменяют цитоскелета функцию. В этом исследовании, визуализация флюоресцентно отмеченных белков с использованием полного внутреннего флуоресценции (TIRF) микроскопия используется для визуализации и количественной оценки изменений в динамике цитоскелета. TIRF микроскопии и использование флуоресцентных меток также позволяет для количественной оценки изменений в динамике цитоскелета, вызванных мутациями в актина. Используя эту технику, количественная оценка цитоскелета функции в живых клетках полноценно дополняет в пробирке исследования функции белка. В качестве примера, миссенс мутации, влияющие на актин остаток R256 были выявлены в трех человеческих актина изоформ предлагая эта аминокислота играет важную роль в регуляторных взаимодействий. Последствия актина мутаций R256H на цитоскелета движений изучались с использованием модели дрожжей. Белок, Aip1, который, как известно, чтобы помочь в кофилин актина деполимеризации, былотмеченных зеленым флуоресцентным белком (GFP) в N-конца и отслеживаются в естественных условиях с использованием TIRF микроскопии. Скорость движения Aip1p и в дикого типа и мутантных штаммов количественно. В клетках, экспрессирующих мутантный R256H актин, Aip1p движение ограничено и скорость движения составляет почти половину скорости измеряется в клетках дикого типа (0,88 ± 0,30 мкм / сек в R256H клеток по сравнению с 1,60 ± 0,42 мкм / сек в клеток дикого типа, стр. <0,005).
Introduction
Актина является доминирующим белок, содержащий цитоскелета и участвует в важных клеточных процессов, включая деление клеток, движение органелл, подвижности клеток, сокращение, и сигнализации. За последние десять лет, болезнетворные мутации в актина были обнаружены в каждом из шести человеческих актина изоформ ведущих к целому ряду нарушений, от миопатиях ишемической болезни сердца 1-7. Процессы, с помощью которого актина мутации приводят к развитию заболеваний по-прежнему выяснены. Дрожжи модель остается золотым стандартом для изучения биохимических эффектов мутаций на функцию актина за счет преимуществ одной существенной актина изоформы, генной сговорчивости и высокой сохранения последовательности актина и функции. Исследования показывают, что отдельные мутации актина привести к молекулярным конкретных нарушений с доминирующими негативными последствиями 8. Например, глухота, вызывающих мутации в γ-не-мышечной актина, которые влияют на остаток Lys-118 изменить регулирование посвязывание актина белок Arp2 / 3 9. Исследования часто используют в лабораторных анализов белка: белковых взаимодействий. Исследования эффекта актина мутации в клеточной биологии и, в частности, актин связывающий белок локализации в клетке ограничены.
Исследования дрожжей цитоскелета в естественных условиях обычно полагаются на изображениях фиксированных клеток из перевернутой флуоресцентного микроскопа 10. Эти эксперименты поставляется основополагающие данные о морфологии цитоскелета. Исследования с включены трехмерную визуализацию конфокальной визуализировать сложную цитоскелета сеть 11, 12. Это томография позволяет количественно определить изобилия и относительного расположения актина и нитей. Тонкие разделе электронной томографии был использован для изображения морфология плотных нитевидных сетей относительно сохранившихся субклеточных структур 13. Переполненные сотовые сшагов с малым сечением могут быть рассмотрены в мелких деталях с этой техникой. Исследования по визуализации были распространены на живых клетках, используя промежуток времени флуоресцентной микроскопии. Когда фото отбеливание и фоновой флуоресценции можно модерируются, изображения промежуток времени позволяет исследования как с динамикой белков цитоскелета и ответ на условия окружающей среды 11, 14. Отдельно визуализация динамики актина в пробирке была выдвинута путем введения полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопия. По сравнению с широким микроскопии, TIRF имеет преимущество уменьшилось фоновой флуоресценции и повышенную контрастность для мониторинга отдельных нитей 15, 16. С этими качествами TIRF микроскопии была адаптирована клеточных биологов контролировать клеточные структуры в мембране плазмы 17, 18. Сотовые события, включая изменения в цитоскелета, можетбыть визуализированы в реальном времени с низким фототоксичности, максимальной контрастности и минимальной фоне расцвета 19.
Чтобы лучше понять влияние актина мутаций на передвижение, локализации и оборота белков цитоскелета в клетке, TIRF микроскопии и белка пометки были использованы. При этом методы для изучения влияния клинически значимых мутаций в актина на цитоскелета динамики в Saccharomyces Cerevisiae описаны. Частности, локализация и движение актина связывающего белка, Aip1p, визуализировали и количественно в клетках, экспрессирующих мутацию R256H в актина. Эти методы дополняют в пробирке биохимических исследований и позволяют большему пониманию белковых взаимодействий и функций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клонирование в PB1996 плазмиды
- Дизайн и заказать праймеры ДНК из олигонуклеотидным производства компании, которая фланг последовательность-мишень и содержат уникальные сайты рестрикции в выбранной родительской плазмиды. Примечание: В этом случае праймеры конструировали для амплификации 400 пар оснований на 5'-конце последовательности Aip1. Сайт ограничение XhoI была включена в состав грунтовки около 20 б.п. до окончания процедуры Aip1 и XmaI был включен около 20 б.п. после целевой Aip1 последовательности. Плазмида, которую используют для клонирования был PB1996, который содержит тег 3XGFP для флуоресценции, ген URA для выбора штамма дрожжей, и ген устойчивости к ампициллину для бактериальной селекции.
- Очищают геномной ДНК из Ура-дрожжевого гаплоидного штамма. Примечание: См. Рисунок 1 на диаграмме процесса клонирования.
- Запуск стандартной реакции ПЦР с использованием двух праймеров и дрожжевой геномной ДНК для амплификации гена Aip1p с рестрикционными сайтами по обеим ваннойг. Дайджест ПЦР-продукта и PB1996 плазмида с помощью рестрикционных ферментов в отдельных реакций в рекомендованы производителем протоколов. В этом случае XmaI и XhoI были использованы с сопровождающим буфере при 37 ° С в течение 1 часа.
- Запуск 0,8% агарозном гель-электрофорез, чтобы отделить переваренных фрагментов ДНК. В одну лунку, загрузить низкий ДНК массовой лестнице и, в отдельных скважинах, загрузить весь реакцию каждой варки. Запуск гель при 100 вольтах в течение приблизительно 1 ч, пока передний краситель не подходит к концу геля. Визуализация гель под УФ-светом и очистить из сегмент, соответствующий сегменту белка и сократить плазмиды.
- Лигируют усваивается сегмент Aip1 и PB1996 плазмиды. Преобразование продукта в DH5α клетках с использованием протоколов изготовитель (10 мкл ДНК с 100 мкл клеток в течение 30 мин на льду, теплового шока при 42 ° С в течение 2 мин, расти в средах SOC в течение 2 часов при 37 ° С) и пластины на культуральных планшетах которые включают антибиотик для выбора, в данном случае LB +Amp пластины. Выберите и расти один колонию в жидкой культуре. Очищают недавно разработанный плазмиды.
2. Мутант штамм дрожжей поколения
- Использование гаплоидный штамм дрожжей, в котором актин аллель была удалена, чтобы построить мутантного штамма дрожжей. Примечание: В этом случае родительский штамм был щедрым подарком от д-ра Питера Rubenstein (Университет штата Айова) и конструкция была описана Кук и др. 20 Этот штамм не имеет гена актина хромосомной и содержит плазмиду, кодирующую дикого типа дрожжей. актина и урацил.
- Используйте PRS кодирования плазмиды дикого типа дрожжей актин с Trp + выбора в качестве базовой плазмиды для мутагенеза 21.
- Выполните сайт-направленного мутагенеза на PRS плазмиды спроектировать миссенс мутации в актина.
- Для мутации R256H в актина, сделать грунтовку 5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3', чтобы изменить Arg 256 Его 256. Запустите стандартный мутагенезаРеакцию ПЦР с плазмиды со стадии 2.2.
- Transform мутантный актина плазмиды из ПЦР в DH5α клетках. Изолировать плазмидной ДНК и секвенирования гена актина для проверки мутации.
- Transform плазмиды, кодирующей мутантный дрожжей актин в гаплоидный штамм дрожжей со стадии 2.1.
- Культура трансформированные клетки по TRP-пластин, чтобы выбрать для дрожжей, содержащей ГТО +, содержащий мутантный дрожжи актина плазмиды.
- Отбора клеток отсутствует исходный плазмиду, кодирующую дикого типа актина и урацил (описано в 2.1) суб-культивирования клеток из Trp-пластин на пластины, которые содержат 5-Fluoroorotic кислоты (5-FOA). 5-FOA превращают в токсичную форму, 5-flurouracil, в поименный штаммы экспрессирующих функциональный ген URA3. Клетки, которые растут после ступенчатого отбора будет содержать только мутантный актина плазмиды.
- Очищают плазмидной ДНК из нового штамма дрожжей. Последовательность плазмиды для обеспечения мутантный ген актина присутствует. Используйте это стренироваться в дальнейших исследованиях. Этот процесс схематически на рисунке 2.
3. Преобразование плазмиды в клетках дрожжей
- Плазмиду гидролизуют в Aip1p-GFP с ферментом рестрикции, чтобы позволить интеграции в хромосомы дрожжей. ПРИМЕЧАНИЕ: Сайт ограничение должно быть вне блока последовательности, содержащей флуоресцентной метки, представляющий интерес ген, и селективный маркер. В этом случае используют 1 мкл рестриктазы HpaI с 8 мкл ДНК и 1 мкл 10х сопровождающего буфере в течение 1 часа при 37 ° С.
- Культура С. CEREVISIAE клетки (от этапа 2.5), которые не способны синтезировать урацил (Ура-деформированного) в течение ночи в 5 мл в YPD СМИ (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% декстрозы) на руле при 30 ° С Спином вниз 1 мл клеток в течение 5 мин при 1000 х г.
- Сделать PLATE смесь. Сделать 10XTE добавлением 5 мл 1 М Трис, рН 7,5 и 2 мл 250 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в 43 мл DDH 2 O. Добавить 00,204 г ацетата лития в 20 мл 1XTE, то 8 г полиэтиленгликоля (ПЭГ) (МВт ~ 3300) и фильтра стерилизации.
- Слейте супернатант из клеток, выделенных вниз на шаге 3.2 и ресуспендирования клеток в оставшейся жидкости. Для взвешенных клеток, добавляют 2 мкл 10 мг / мл семенников лосося ДНК-носителя. Добавить 10 мкл расщепленной плазмидной ДНК из стадии 3.1 и вихря. Добавить 0,5 мл пластины и вихря. Добавить 20 мкл 1 М DTT и вихря.
- Выдержите смесь в течение 6-8 ч при 25 ° С. Теплового шока клетки в водяной бане при 42 ° С в течение 10 мин. Пластинчатые 100 мкл клеток из нижней части трубки микроцентрифужных, где они поселились выходят на-Ура пластины. Инкубируют при 30 ° С в течение 2-3 дней или до колоний форме.
- Выбор отдельных колоний и серию выходят на-Ура пластины. ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки содержат плазмиду с геном Aip1-GFP и Ура интегрированной в хромосому, что позволяет для роста. Эти клетки затем будут использованы в microscoру.
4. Визуализация белка Движение Aip1p Использование полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии
- Вырастить культуру дрожжевых клеток с объединенной Aip1p-GFP в YPD ночь на руле при 30 ° С Субкультура 1 мл ночной культуры в 9 мл Ura-носителей. Расти клетки для дополнительного 3-4 ч на качалке при 30 ° С для того, чтобы они находятся в фазе роста журнала.
- Добавить 3 мкл клеток предметное стекло микроскопа и добавить покровное. Разрешить клетки оседают на слайде в течение 5 мин. Поместите слайд в кронштейне стадии пластины.
- Соблюдайте белок Aip1p-GFP с полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопа (488 нм) с использованием масла погружение 100X TIRF объективную и цифровой камеры CCD. Использование Slidebook программного обеспечения 5.0, получать изображения в течение 20 сек в размере 5 кадров / сек (отдельных кадров, полученных изображений представлены на рисунке 2А).
- Чтобы сосредоточиться на слоктей, программное обеспечение с открытым Slidebook 5.0 и нажмите кнопку Фокус Window на панели инструментов для доступа к элементам управления фокус. Выберите вкладку Область и выберите цели 100X-TIRF. Включите лампу и сдвиньте блок лампы до 15%. Измените настройки Bin 2 х 2. Измените фильтр для светлого поля.
- На микроскопом, используйте тонкую фокусировки для приведения клеток в центре внимания, как видно на экране компьютера.
- С помощью элементов управления в окно фокус, выключите лампу, заменить фильтр, чтобы жить, и нажмите кнопку TIRFM.
- На TIRFM осветитель, прикрепленной к правой стороне порта микроскопом, включить лазерное излучение Вкл.
- Выберите вкладку поток в окне Фокус, установите флажок рядом, чтобы начать запись, а затем нажмите кнопку светлое поле.
- На TIRFM осветителя, поверните микрометр для регулировки угла падения лазерного. Это используется для оптимизации флуоресцентное излучение от фокусов Aip1-GFP и свести к минимуму фоновой флуоресценции отклетки и слайд.
- Когда появится нужное изображение, нажмите кнопку Старт. После 20 секунд, нажмите Стоп. Сохраните изображения. На вкладке Файл на панели главного меню выберите Сохранить слайд как и введите расположение и имя файла.
- Использование программного обеспечения ImageJ чтобы анализировать изображения. Используйте макро плагин "Руководство Tracker", чтобы отслеживать перемещение и скорость флуоресцентного Aip1p очагов. Изменение часового параметр интервала до 0,2 сек.
- Используя выбор добавить трек, выбрать и отслеживать индивидуальный флуоресцентный белок через 7:56 соединительной кадров. Используйте команду конец дорожки и скорость движения белка между кадрами будет отображаться в окне результатов.
- Определить среднюю скорость между каждого кадра с помощью электронных таблиц Microsoft Excel. Используйте значения для вычисления средней скорости движения Aip1p для каждого клеточного штамма интересов. Примечание: точечный график скорости движения Aip1p и средней нелинейной скорости показана на FIGUповторно 2В.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Способ по изображению динамика белков цитоскелета в клетке представлена. Актин-связывающий белок, Aip1p, был с меткой GFP. Конструкция для плазмидой, кодирующей меткой продукт показан на рисунке 1. Эту плазмиду трансформировали в клетках дрожжей. Экспрессия флуоресцентно меченый Aip1p разрешено визуализацию поведения белка в клетке. Aip1p обычно локализуется в актина в местах эндоцитоза 22. Для количественной оценки движения Aip1p, более 50 люминесцентных Aip1p очаги отслеживались более чем в 10 клеток, как показано на рисунке 2А. Средняя скорость рассчитывали для каждой области флуоресцентного Aip1p (см. фиг.2В). В клеток дикого типа, движения Aip1p диапазоне через ячейку, а затем исчезает. Средняя скорость движения Aip1p в диких клеток типа 1,60 ± 0,42 мкм / сек. Клетки, экспрессирующие мутантный актин R256H, как известно, имеет ненормальное морфологию актина суtoskeleton 23, иметь фальсифицированную фенотип Aip1p. В мутантного штамма, движение Aip1p является ограниченным и медленнее. Средняя скорость движения Aip1p составляет 0,88 ± 0,30 мкм / сек (р <0,005). Миграция Aip1p ограничивается непосредственной близости, с фокусами кружили вокруг друг друга, а не пересекая клетку. Кроме того, Aip1p видна уже предполагая, медленный оборот Aip1 белка.
Рисунок 1. Схема конструкции плазмиды.) Aip1 фрагмент амплифицируют методом ПЦР показано на переваривается ферментами рестрикции (желтый болтов). Б) плазмида, PB1996, как расщепляли рестриктазами, чтобы удалить ген Abp140. С) переваривали Aip1 и PB1996 фрагмента лигируют то формируют. D плазмиды PB1996 Aip1) PB1996 Aip1 плазмиды линеаризуется и превращается в дрожжевых клетках, где ДНК интегрированных в хромосому.
Рисунок 2. Схема мутантной конструкции актин дрожжевого штамма. Плазмиду, кодирующую мутантный актина изоформы затем преобразуется в клеточной линии и выбирают на основе способности расти на средах без триптофана. Зеленые линии показывают хромосомной ДНК. Черный круг представляет собой плазмиду. Коричневый круг представляет дрожжевую клетку. Коробки каждый указать определенный ген: желтый является актин, оранжевый лейцин, коричневый урацил, и розовый триптофан. X над упаковку, означает, ген был удален из хромосомной ДНК. На этапах 2.3 и 2.4, черная звезда на генной актина Indicates мутацию R256H.
Рисунок 3. Движение Aip1p-GFP в живых дрожжевых клеток. A) изображения дикого типа и R256H клеток, экспрессирующих GFP с метками Aip1p показаны. Клетки в начале фазе роста журнала и изображения были получены все 0,2 сек на 15 сек. Стрелки отмечают положение индивидуального флуоресцентного внимания в течение долгого времени, синий для дикого типа и красный для мутантных штаммов актина. Последний кадр показывает путь фокусов Aip1 как зеленой линией. Шкала бар показано составляет 5 мкм. Б) Скорость движения Aip1p измеряли с помощью ImageJ. Точечная диаграмма график показывает скорость для индивидуального флуоресцентного очагов. Горизонтальная полоса показывает среднюю скорость для дикого типа (синий) и мутантного (красный) актина штаммов.Aip1p движется 1,60 ± 0,42 мкм / сек в клетках дикого типа по сравнению с 0,88 ± 0,30 мкм / сек для клеток, экспрессирующих R256H мутантный актин (р <0,005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эффективная стратегия для визуализации динамики цитоскелета и утилиты в исследованиях по патогенных мутаций было описано здесь. Расширенный методами визуализации создали новые возможности для понимания внутриклеточное движение белков около клеточной мембраны. Полное внутреннее отражение флуоресценции микроскопии (TIRF) является чувствительным методом для функциональных исследований в живых клетках. TIRF использует лазер угловой возбуждения, который создает мимолетную поле из-за разницы в преломления покровного стекла и водной среде. Энергия затухающих поле возбуждает флуорофоров но экспоненциально убывает с увеличением расстояния от поверхности раздела между покровным и воды. Это приводит к высокой сигнала к шуму и мощным разрешением от 50-250 нм над интерфейсом покровное / средней. Эти качества делают TIRF микроскопии мощный инструмент для визуализации белков цитоскелета на уровне одной молекулы в живых клетках с менеефототоксичность и усиливается контраст по сравнению с другими методами 24 - 26.
Цитоскелет включает в себя многочисленные белки, работающие совместно, чтобы адаптироваться к сотовой потребностей. Эффект сосудистой-болезнетворные мутации в актина по регулированию по кофилина недавно изучали нашей группы 27. Исходя из наших первоначальных выводов, Aip1p, актин связывающий белок, который способствует кофилин зависит от актина отделени, была исследована. В предварительных исследований, клетки, экспрессирующие актин мутация R256H растут плохо в отсутствие Aip1p, особенно в условиях стресса. Это говорит о том, что регулирование Aip1p мутантного цитоскелета меняется. Наши анализы движения и локализации Aip1p в штамме R256H использованием флуоресцентного тегов и TIRF микроскопии подтверждает аномальные динамику. В будущем, мы планируем, чтобы пометить дополнительные белки, такие как кофилина, с разными флуорофорами визуализировать движение нескольких белководновременно, чтобы лучше понять белок: белковых взаимодействий.
Есть некоторые ограничения генерации белка флуоресцентно меткой и некоторые случаи, когда техника не представляется возможным. Флуоресцентной метки может нарушить активность белка или изменить взаимодействие с партнерами по связыванию. Это была выявлена в попытках пометить кофилин, другой актин-связывающим белком. Выражение помеченного конструкции была неудачной в гаплоидного дрожжей из-за нарушенного функции кофилин. Кофилин является важным белка в дрожжах. Таким образом, удаление кофилина без сопутствующей реинтродукции смертельна; Запрет последующее введение в плазмиды. Один из способов избежать этого ограничения заключается в использовании диплоидный дрожжи. Один экземпляр гена кофилин был нокаутирован, отмеченных версия была экзогенно представила на плазмиды, а затем выбор для дочерних клеток, которые не имеют геномную кофилин но содержат плазмиды 22 Способность флюоресцентно пометить белок былполучили, добавив тег внутренних остатков в белке, которые ранее были показаны иметь незначительное влияние на его белок-белковых взаимодействий. N-или С-конца являются предпочтительными сайты, чтобы добавить тег, если регионы не известно, влияет соответствующую белок: белковых взаимодействий. Если это не дает функциональный белок, альтернативный конце или внутренние остатки можно попытаться.
Есть несколько важных шагов в реализации методов, описанных. Один заключается в определении подходящего места, чтобы отметить белок которая экономит функцию. Прочные элементы управления должны быть включены для проверки, что функция белка сохраняется. Во-вторых, слайд необходимо контролировать, чтобы обеспечить клетки не пересушивает во время съемки. Воск можно использовать по краям покровного стекла, чтобы предотвратить обезвоживание, если это необходимо. Эти шаги, чтобы обеспечить успех просты решений такой подход сговорчивым и выгодно изображения структур вблизи плазматической мембраны. Возможность кваntify локализации белка и движение в живых клетках может повысить понимание клеточных функций. Как мутации, затрагивающие белков цитоскелета выявляются, выражение флуоресцентно меченных белков и TIRF микроскопии может быть полезно исследовать патофизиологии основную человеческую болезнь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Питер Рубинштейн за полезные обсуждения и технических консультаций и Дэвид Pellman для оригинального PB1996 клона. Эта работа была поддержана грантом Марша Dimes и финансирования от езды для детей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
