Summary
Technologie HaloTag est une technologie multifonctionnelle qui a remporté un succès important dans l'isolement de petits et de grands complexes de protéines à partir de cellules de mammifères. Ici, nous mettons en évidence les avantages de cette technologie par rapport aux alternatives existantes et de démontrer son utilité pour étudier de nombreux aspects de la fonction des protéines dans les cellules eucaryotes.
Abstract
Recherche en protéomique a explosé ces dernières années avec les progrès dans les capacités de spectrométrie de masse qui ont conduit à la caractérisation de nombreux protéomes, y compris ceux contre les virus, les bactéries et la levure. En comparaison, l'analyse du protéome humain est à la traîne, en partie à cause du grand nombre de protéines qui doivent être étudiés, mais aussi la complexité des réseaux et les interactions de ces présents. Pour répondre spécifiquement aux défis de la compréhension du protéome humain, nous avons développé une technologie HaloTag pour l'isolement des protéines, particulièrement forte pour l'isolement de complexes multiprotéiques et permettant la capture plus efficace des interactions et / ou de protéines faibles ou transitoires de faible abondance. HaloTag est une étiquette codée génétiquement protéine de fusion, conçu pour covalente, spécifique, et l'immobilisation rapide ou marquage des protéines avec différents ligands. S'appuyant sur ces propriétés, de nombreuses applications pour les cellules de mammifères ont été développés pour caractèreiser la fonction des protéines et ici nous présentons les méthodes, y compris: protéines listes déroulantes utilisées pour la découverte de nouvelles interactions ou des tests fonctionnels et la localisation cellulaire. On trouve des avantages significatifs de la vitesse, la spécificité et la capture covalente de protéines de fusion à des surfaces pour l'analyse protéomique par rapport aux autres approches traditionnelles non covalentes. Nous démontrons ci et la grande utilité de la technologie utilisant deux protéines épigénétiques importantes à titre d'exemples, la protéine humaine bromodomain BRD4, et l'histone déacétylase HDAC1. Ces exemples démontrent la puissance de cette technologie pour permettre la découverte de nouvelles interactions et caractérisant la localisation cellulaire chez les eucaryotes, qui, ensemble, une meilleure compréhension des droits de la protéomique fonctionnelle.
Introduction
Compréhension de la fonction cellulaire, réponse à des stimuli, et des changements dans le développement et / ou des états pathologiques est intimement liée à dé-convolution du protéome tout au long de ces différents états dynamiques 1,2. Beaucoup a été fait pour comprendre le protéome des organismes inférieurs, cependant, étant donné le nombre de protéines et toutes les interactions possibles, cela a été très difficile dans la lutte contre le protéome humain 1,3-7. Les progrès de la spectrométrie de masse ont largement permis à la capacité d'entreprendre ces études, et ici nous présenter un avancement supplémentaire et significative avec le développement de la technologie HaloTag à la fois la capture efficace des complexes de protéines et la caractérisation fonctionnelle des protéines humaines à partir de cellules de mammifères 8-10. Cette technologie a récemment été montré dans plusieurs études pour être un facteur critique pour la découverte des interactions importantes, ce qui permet de mieux comprendre la fonction de la protéine nouvelle et understandide la maladie de 11 à 13 ng.
La protéine de fusion HaloTag a été initialement développé pour répondre à plusieurs défis de marqueurs d'affinité traditionnels et des anticorps comme connexes à la capture de la protéine, la purification et l'étiquetage 8-10. De la quasi-totalité des procédés pour la capture et la purification des protéines, il existe une étape d'interaction non covalente, qui est utilisé pour l'enrichissement d'une protéine particulière 14. Au cours de cette étape, la protéine et / ou complexe peuvent dissocier due à la diffusion, en particulier si le procédé nécessite heures au lieu de minutes. Pour répondre à cette préoccupation, la protéine de fusion a été spécifiquement conçu pour interagir rapidement et irréversiblement avec ses ligands, qui peuvent être soit des particules, des surfaces ou des fluorophores 9. Par conséquent, une fois qu'il est lié à son ligand, il reste lié, qui est l'un des facteurs les plus différentiation par rapport à d'autres marqueurs d'affinité. Également démontré ici, est la capacitépour traiter différentes questions biologiques avec un seul produit d'assemblage, ce qui est possible par des ligands 9 (figure 1) en alternance. Par exemple, pour interroger les interactions ou la fonction des protéines, des ligands de surface sont utilisés pour la capture des protéines ou des complexes (figure 1). Dans une expérience séparée, la même protéine de fusion peut être marqué par fluorescence pour étudier la localisation cellulaire, le trafic, ou le renouvellement des protéines (Figure 1). Il est important de se rappeler, cependant, que, une fois un ligand est lié, qu'il s'agisse d'une surface ou d'un fluorophore, il est irréversible, et donc d'autres ligands ne peut pas alors être lié par la suite dans la même expérience.
Analyse des technologies existantes pour cartographier les interactions entre protéines révèle la difficulté d'isoler efficacement les interactions spécifiques, y compris ceux qui sont plus transitoire ou sont en faible abondance 1,6,7,14,15. En outre, les travaux récents de nombreux groupes représente la préoccupation que, dans des méthodes d'isolement classiques, en particulier dans le domaine de la protéomique humaines, il existe un nombre significatif de contaminants protéiques qui peuvent masquer des signaux provenant de vraies interacteurs dans l'analyse par spectrométrie de masse 16. Les propriétés développées pour la protéine HaloTag et son adresse de résine co-développé bien ces préoccupations. Dans le protocole de pulldowns complexes (figure 1), la liaison de complexes peut être réalisée en 15 min, à la fois complexe et la promotion de la capture de la réduction des niveaux de liaison non-spécifique 8. En outre, la liaison irréversible permet une capture efficace des protéines de faible abondance et permet l'utilisation de beaucoup moins de cellules, ce qui réduit encore le fond 8. Une fois la capture de complexes est établi, le protocole comprend des conditions de lavage doux pour préserver l'intégrité complexe. Élution des complexes capturés peut être effectuée par deux méthodes et choix de la méthode est dicté par l'objectif de l'anus avallyse. Si l'on souhaite analyser ou découvrir des protéines qui interagissent par transfert de Western ou par spectrométrie de masse, il est alors recommandé, pour éluer des complexes avec des agents dénaturants tels que le SDS ou de l'urée (figure 1). Ceci est particulièrement avantageux pour la spectrométrie de masse comme la protéine fusionnée à l'origine HaloTag, appelée la protéine appât, restera en arrière lié à la résine et ne sera donc pas dominer la population de peptides détectés dans la spectrométrie de masse. Cela signifie aussi, cependant, que la protéine appât ne sera probablement pas être visible dans l'analyse par transfert de Western, une différence significative par rapport à d'autres purifications d'affinité non covalentes ou des co-immunoprécipitations. Si le but est de purifier une intact complexes pour être utilisées pour des études fonctionnelles, l'élution peut être réalisée en utilisant TEV (Tobacco Etch Virus) protéase, qui reconnaît la séquence de clivage apparenté codé entre la protéine de fusion et la protéine appât (figure 1). Tes échantillons pourraient aussi être analysés par spectrométrie de masse, mais comme montré plus tard, ils contiennent une quantité significative de protéine appât qui peut empêcher la détection de faible abondance, interacteurs spécifiques.
Nous présentons ici les protocoles déroulants et d'imagerie appliquées à deux protéines thérapeutiques importants, la protéine bromodomain BRD4 et une histone déacétylase, HDAC1 17. Nous avons montré avec ces exemples, l'interaction avec les partenaires attendus tel que déterminé par spectrométrie de masse, l'activité enzymatique après isolement complexe pour HDAC1, et la localisation cellulaire correcte pour les deux. Ensemble, ces résultats démontrent le caractère multifonctionnel et la force de la technologie pour la caractérisation des interactions des protéines eucaryotes et fonction.
Protocol
Remarque: Le protocole suivant peut être utilisé avec n'importe quel HaloTag fusion et dans toute lignée cellulaire de choix de manière stable ou transfectée de manière transitoire. Pour ces exemples, nous donnerons des protocoles de transfection transitoire de fusions Halotag dans les cellules HeLa ou HEK293T. Pour toutes les expériences, nous vous recommandons d'utiliser le seul contrôle de la protéine.
1. Fusion Protein Expression test
- Obtenir la protéine de fusion construction:
- Obtenir pré-faites vecteur HaloTag de fusion ou de construire en utilisant des vecteurs existants. Pour plus d'informations sur les constructions disponibles, s'il vous plaît voir le tableau des réactifs spécifiques.
- Si vous faites tout clone, il est recommandé de vérifier la séquence de l'ADN.
- Test de l'expression de protéines et de contrôle fusion:
- Pour chaque échantillon, préparer 250 pi de SDS 1X colorant de charge tampon (60 mM Tris HCL pH 6,8, 0,75 mM bleu de bromophénol, 12,5% de glycérol, dithiothréitol 100 mM, SDS 0,5%).
- Pour chaque protéine de fusionet le contrôle, la plaque 0,5 ml de HEK293T ou cellules HeLa dans leur support approprié à une densité de 2-4 x 10 5 cellules / ml dans une plaque à la norme 24.
- Incuber pendant 18-24 h à 37 ° C et 5% de CO 2, puis transfecter comme recommandé.
- 24 heures après la transfection, ajouter 0,5 pi de 5 mM rhodamine tétra-méthyle (TMR) ligand aux médias de chaque bien et doucement plaque mélanger.
- Incuber les cellules transfectées contenant ligand pendant 15 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Aspirer le milieu hors ligand contenant et laver chaque puits de cellules doucement avec 1 ml de PBS RT.
- Aspirer le PBS et effectuer un second lavage avec 1 ml de PBS RT.
- Retirer du PBS et ajouter 200 ul de tampon 1X SDS Chargement de colorant directement aux cellules.
- Pipette lysat de plaque en tube de 1,5 ml Eppendorf.
- Faire bouillir lysat pendant 5 min à 95 ° C.
- Retirer 5-10 ul de la réaction et de la charge sur un gel SDS-PAGE.
- Utiliser un scanner de détection fluorescent(TMR excitation: 555 nm, émission: 585 nm) pour détecter des bandes. Utiliser des marqueurs de protéines fluorescentes comme standards.
- Si un scanner de détection fluorescent n'est pas disponible, effectuer des transferts Western en utilisant des anticorps contre l'une ou l'autre de la protéine de fusion ou d'une protéine appât balise pour détecter l'expression de la protéine de fusion.
2. Tirages de protéines
- Préparation de cellules transfectées de manière transitoire:
- Pour chaque fusion ou de contrôle préparer un plat de 15 cm avec 30 ml de cellules de 3-4 x 10 5 cellules / ml ou de 1 à 1,2 x 10 7 cellules par construction totale.
- Incuber pendant 18-24 h à 37 ° C et 5% de CO 2, puis transfecter construire comme recommandé.
- Après 24-48 heures après la transfection, retirez le support et laver délicatement la couche de cellules avec 20-25 ml de PBS glacé.
- Retirer du PBS lavage, puis ajouter 25-30 ml de 4 ° C réfrigérés PBS et gratter délicatement les cellules de la plaque.
- Prélever des cellules dans des tubes et centrifuge coniquesfuge pendant 5-10 min à 2000 xg et 4 ° C.
- Rejeter le surnageant et le placer culot cellulaire à -80 ° C pendant au moins 30 minutes, ou au maximum 6 mois.
- L'équilibrage de la résine HaloLink:
- Pour chaque échantillon de fusion ou de contrôle, préparer 12 ml de tampon de résine équilibrage / Wash (100 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, et 0,005% IGEPAL CA-630). Remarque: Il est très important de réaliser et d'utiliser la résine tampon d'équilibration dans les 12 heures comme dilué IGEPAL CA-630 n'est pas stable ou efficace au-delà de ce laps de temps.
- Secouer doucement ou mélanger la résine pour obtenir une suspension uniforme.
- Pour chaque expérience déroulant, distribuer 200 pi de résine dans un 1,5 ml microtubes.
- Centrifuger pendant 1 min à 800 xg (par exemple, 3000 tours par minute dans une micro), puis retirez soigneusement et jeter le surnageant (éthanol) sans perturber résine au fond du tube.
- Ajouter 800 ul de résine équilibrage / Wash tampon et mélanger en inversant le tube plusieurs fois.
- Centrifuger pendant 2 min à 800 xg, puis retirez soigneusement et jeter le surnageant.
- Répétez les étapes 2.2.5 et 2.2.6 deux fois de plus pour un total de 3 lavages.
- Ne retirez pas le lavage final ou surnageant jusqu'à prêt à ajouter des lysats cellulaires décrites ci-dessous (étape 2.3.8) pour empêcher la résine de se dessécher.
- Reliure et le lavage des complexes de fusion:
- Pour chaque échantillon, préparer 500 ul de tampon de lyse de mammifères (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 0,1% de désoxycholate de Na) et 1 ml de tampon TBS 1X (100 mM Tris-HCl pH 7,5 et NaCl 150 mM).
- Décongeler les culots de cellules et remettre en suspension dans 300 ul de tampon de lyse mammifères par aspiration et refoulement ou brièvement au vortex.
- Ajouter 6 pi de 50X inhibiteur de protéase Cocktail (800 ug / ml benzamidine HCl, 500 pg / ml phénanthroline, 500 pg / ml d'aprotinine, 500 ug / ml de leupeptine, 500 & #. 181; g / ml de pepstatine A, 50 mM PMSF) Note: cocktails protéase qui comprennent AEBSF ne peuvent pas être utilisés car ils interfèrent avec la liaison aux protéines fusion tag.
- Ajouter 3 pi RQ1 DNase et inverser pendant 10 min à température ambiante.
- DOUNCE avec un verre d'homogénéisation 2,0 ml taille; 25-30. Coups sur la glace, ou passer les cellules à travers une aiguille G 25 ou 27 5-10 fois pour terminer la lyse Remarque: Le traitement par ultrasons n'est pas recommandée comme complexes peuvent s'effondrer et la surchauffe peuvent affecter la balise activité de la protéine de fusion.
- Centrifuger à 14 000 g pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer le lysat.
- Transfert lysat clair, environ 300 pi volume total, dans un nouveau tube et le placer sur la glace.
- Ajouter à effacer un lysat 700 pi supplémentaires de tampon 1X SCT et bien mélanger par pipetage de haut en bas.
- Prendre des tubes de résine équilibrée préparés à l'étape 2.2.8 et retirer finale de lavage / surnageant de résine sans perturber la résine au fond du tube.
- Ajouter à chaque tuêtre de la résine, de 1 ml de lysat dilué.
- Incuber avec le mélange sur un agitateur de tube (ou mélangeur doux) pendant 15 min à 22 ° C. Note: La décantation de la résine pendant ce temps réduit l'efficacité de liaison. Si la liaison à 4 ° C est souhaitée, faire en mélangeant pendant 1 heure.
- tubes de résine de centrifuger 2 min à 800 xg et éliminer le surnageant.
- Ajouter 1 ml de tampon d'équilibration résine / Wash faites à l'étape 2.2.1 et bien mélanger en inversant le tube de résine à la main à plusieurs reprises.
- tubes de résine de centrifuger 2 min à 800 xg et jeter le lavage.
- Répétez les étapes 2.3.12 suivie 2.3.14 trois fois supplémentaires.
- Ajouter 1 ml de tampon d'équilibration Résine / Wash et incuber à 22 ° C pendant 5 minutes avec rotation constante.
- tubes de résine de centrifuger 2 min à 800 xg et jeter le lavage.
- Selon la demande de fin (voir l'introduction pour plus d'explications), passez à la section soit 2.4 ou 2.5.
- SDS élution de gels dénaturants, transferts Western, ou la spectrométrie de masse:
- Remettre en suspension la résine à partir de chaque échantillon dans 50 ul de tampon d'élution SDS (1% de SDS et 50 mM Tris-HCl pH 7,5)
- Agiter les tubes à température ambiante pendant 30 min.
- Centrifuger 2 min à 800 xg et transfert éluats à de nouveaux tubes pour l'analyse.
- Pour western blot ou gel de coloration à l'argent, charge 5-10 pi sur un gel dénaturant SDS.
- Pour la spectrométrie de masse, à l'exception de 40 ul de chaque échantillon à -20 ° C.
- TEV protéase élution pour des analyses fonctionnelles, transferts Western, ou la spectrométrie de masse:
- Après avoir retiré le dernier lavage, remettre en suspension la résine dans 50 ul ProTEV tampon de clivage et 30 unités de TEV enzyme.
- Incuber à 25 ° C avec agitation par secousses pendant 1 h.
- Centrifuger 2 min à 800 x g.
- Transfert éluat de nouveaux tubes.
- échantillon de magasin à 4 ° C pour une utilisation immédiate dans des essais fonctionnels.
3.Imagerie cellulaire par fluorescence labellisés protéines de fusion utilisant un cytoplasmique et nucléaire perméable ligand
- Transfecter, étiquette, et les cellules de l'image:
- Dans une lamelle 8 bien chambré pour chaque protéine ou le contrôle fusion, plaque 400 ul de cellules HeLa dans leur support approprié dans chaque puits à une densité de 1-2 x 10 5 cellules / ml.
- Incuber pendant 18-24 h à 37 ° C et 5% de CO 2, puis transfecter comme recommandé.
- 18-24 heures après la transfection, diluer TMR ligand 1:200 dans les médias cellulaires appropriés, puis ajouter 100 ul de cette solution dans chaque puits et mélanger doucement.
- Incuber les cellules transfectées contenant ligand pendant 15 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Médias Aspirer contenant ligand et le remplacer par 500 pi de milieu approprié manquant protéine fusion tag ligand, qui a été préchauffé à 37 ° C.
- Répéter deux fois pour un total de trois lavages.
- Mettez les cellules de nouveau dans l'incubateur (376, C et 5% CO2) pendant 30 min.
- Aspirer les médias et les remplacer par 500 pi de médias appropriés, qui a été pré-chauffé à 37 ° C.
- Image sur un microscope en utilisant les paramètres d'acquisition appropriées (TMR d'excitation: 555 nm, émission: 585 nm).
Representative Results
Lorsque l'on travaille avec toute nouvelle protéine de fusion, il est important de premier test pour l'expression de cette protéine après transfection et également de valider qu'une protéine de poids moléculaire approprié est produit. Comme les protéines de fusion peuvent être Halotag par fluorescence et de manière covalente, de ligands marqués avec perméables ou imperméables en fonction de la localisation, il est possible de déterminer rapidement expression en appliquant les lysats cellulaires à une électrophorèse sur gel dénaturant suivie d'une analyse sur un Fluorimager. Selon le protocole décrit dans la section 1.2, l'expression de Halo-BRD4 (189 kDa) et le contrôle seul HaloTag (Ctrl) est observée (34 kDa, figure 2A). Comme mentionné dans le protocole, l'expression de protéines de fusion peut également être détectée en utilisant des transferts Western traditionnels avec des anticorps anti-Halotag, ou si elles sont disponibles, les anticorps à la protéine appât. Si possible, il est recommandé d'utiliser le ligand fluorescent à la place car il est plus précis, plus rapide et plus facile tdétection des anticorps han, et aussi quantitative 10.
Après expression de la protéine de fusion pleine longueur correcte est vérifiée, pulldowns de protéines peuvent être effectuées. Présentés dans la figure 2B sont les gels colorés argent de répétitions biologiques de Halo-Brd4 et Ctrl pulldowns élues par SDS (Protocole section 2.4) qui démontrent une grande reproductibilité. Les gels de teinture d'argent présentent un grand nombre de protéines se trouvent à interagir avec la protéine BRD4 et très faible bruit de fond dans le témoin (figure 2B). Comme mentionné dans l'introduction, dans ce processus d'élution, le Halo-BRD4 ne sera pas élue de la résine qu'il reste lié de façon covalente. Par conséquent, il n'est pas un groupe significatif à ce poids moléculaire étant détectée dans la coloration à l'argent (Figure 2B) ou transfert de type Western (données non présentées). Pour déterminer si ces protéines sont spécifiques à BRD4, liquide spectrométrie de masse par Chromatographie (LC-MS/MS) a été effectuée sur le cmélange omplex obtenu après élution SDS. Présentés dans la figure 2C sont des chiffres spectrales et normalisée facteur spectral de l'abondance (NSAF) des valeurs pour interacteurs connus de BRD4 18-20 trouvés dans le Halo-BRD4 analyse par spectrométrie de masse. L'abondance élevée de composants de pTEFb 18,20 et aussi la protéine BRD9 19 confirmer la capture spécifique de complexes Brd4. Comme prévu par les taches d'argent gels (figure 2B), de nombreuses autres protéines ont également été identifiés comme interacteurs potentiels de BRD4 qui n'avaient pas été observés dans le contrôle (données non présentées). Comme ceux-ci sont jusque-là inconnu, ils doivent être vérifiées indépendamment par d'autres méthodes pour confirmer si la protéine est un vrai interacteur, et si oui, si elle est directement ou indirectement associée à BRD4.
Complexes isolés peuvent également être étudiés pour l'activité; il est recommandé d'éluer complexes en utilisant la protéase TEV (Protocole section 2.5), de sorte qu'ils maintiennent functionalité. Sur la figure 3A, un gel de coloration à l'argent des complexes de pulldown Halo-HDAC1 libérés de la résine en utilisant la protéase TEV est représenté. Comme la protéase TEV clive dans une région de liaison entre la balise protéine de fusion et son partenaire de fusion, d'importantes quantités de la protéine appât, dans ce cas HDAC1, on observe (figure 3A). Pour déterminer si cette fraction contenait une activité de HDAC1, des échantillons de TEV éluées ont été testés dans un dosage luminescent de HDAC, HDAC-Glo 21. Comme le montre la figure 3B, les échantillons HDAC1 déroulants ont montré des niveaux élevés d'activité de HDAC1 (colonne 1), qui a été spécifiquement inhibée par un inhibiteur de HDAC connus, SAHA 22 (colonne 2). Comme contrôles pour démontrer la spécificité de plus, aucune inhibition de HDAC a été observée avec un inhibiteur de la famille sirtuines connexe, EX-527 22 (colonne 3) et aucun signal n'a été détecté en utilisant un tampon seul, sans l'échantillon HDAC1 déroulant ajoutée (colonne 4).
Une composante importante de la fonctionprotéomique et al compréhension complexes, est aussi de comprendre la localisation et / ou le trafic des protéines. Comme ces constructions de fusion peuvent même être marquées par fluorescence dans les cellules, nous avons surveillé leur localisation en utilisant l'imagerie confocale. Après le protocole à la section 3, les cellules HeLa transfectées de façon transitoire avec Halo-BRD4 (figure 4A) et Halo-HDAC1 (figure 4B) ont été marquées par fluorescence avec le ligand TMR et imagés. Comme représenté sur les figures 4A et 4B, les deux localisées dans le noyau 17 comme on s'y attendait. Ces données démontrent que la présence du mot-clé n'a pas modifié la localisation cellulaire physiologique de ses partenaires de fusion.
Figure 1. Schéma de menu déroulant de la protéine et des applications d'imagerie confocale. Utilisation en tant que Ingle construire plusieurs applications à la compréhension de la fonction des protéines dans les cellules de mammifères sont possibles. Pour tous, une construction de fusion Halo est soit stable ou transitoire exprimé dans des cellules de mammifères adhérentes ou en suspension. Pour protéines pulldowns complexes, les cellules sont ensuite lysées, complexes sont capturés de façon covalente à la résine, et élues soit par SDS élution (voie de gauche) ou TEV clivage (voie de droite). SDS élution est recommandé pour procéder à une analyse par spectrométrie de masse, tandis que TEV clivage est optimale pour réaliser une analyse fonctionnelle. Pour caractériser l'expression, la localisation cellulaire, les événements de trafic, ou le renouvellement des protéines, des cellules vivantes exprimant des protéines de fusion sont marqués par fluorescence et une analyse plus approfondie sur des gels SDS PAGE ou en utilisant l'imagerie confocale. Les deux ligands fluorescents cellulaires perméables ou imperméables sont disponibles en fonction de la localisation ou de la présentation de la protéine de fusion dans la cellule.
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Figure 2. Expression Halo-BRD4 protéine, déroulant, et l'analyse par spectrométrie de masse. Gels (A) SDS PAGE montrant l'expression de Halo-BRD4 protéine de fusion, 189 kD, et Halo tag protéine de fusion seul, 34 kD, contrôle (Ctrl) dans un lysat cellulaire HEK293T marqué avec TMR ligand (Protocole section 2.1). Les gels ont été scannés avec Fluorimager pour la détection et un marqueur fluorescent de poids moléculaire ont été utilisées. (B) des gels d'argent de teinture de répétitions biologiques pour pulldowns d'échantillons Halo-Brd4 et Ctrl élue avec SDS. Tailles de poids moléculaire sont indiqués pour le gel. (C) chiffres spectrales (panneau de gauche) et normalisées facteurs d'abondance spectrales (NSAF) valeurs (panneau de droite), qui représentent la protéine de poids moléculaire de protéines identifiées dans la masse une analyse par spectrométrie de répétitions biologiques de Halo- BRD4 et Ctrl. Montré sont des protéines connues pour interagir avecith BRD4, y compris les composants de pTEFb (CDK9 et la cycline T) 18,20, ainsi que BRD9 19. Pas de peptides de ces protéines ont été identifiées dans le Ctrl.
Figure 3. Halo-HDAC1 isolement complexe et analyse de l'activité. (A) des gels Argent tache montrant l'isolement de complexes Halo-HDAC1 et fond de la (Protocole section 2.5) Ctrl après TEV clivage. La bande proéminente de HDAC1 (55 kDa) et la bande de protéase TEV sont étiquetés. La HDAC1 libre est générée par TEV clivage au sein d'un groupe de liaison optimisé entre la séquence de fusion HaloTag et HDAC1 après la capture de la résine (figure 1). (B) Graphique montrant l'activité de la HDAC1 isolations complexes échantillons dans un dosage de l'histone déacétylase luminescent, HDAC- Glo 21. Colonne 1 du graphique montre une grande levels de l'activité des HDAC contenus avec les échantillons déroulants Halo-HDAC1 (HDAC1). La colonne 2 montre cette activité peut être diminuée en particulier par addition de l'inhibiteur de HDAC, 22 SAHA, aux échantillons de pulldown de HDAC1. Comme témoins, colonne 3 montre un inhibiteur de désacétylases spécifique à la famille des sirtuines, mais pas HDAC, EX-527 22, n'inhibe pas l'activité de HDAC1 et la colonne 4 montre aucune activité n'est observée à l'aide du tampon seul.
Figure 4. Halo-BRD4 et Halo-HDAC1 imagerie confocale. Vivez cellule imagerie confocale de cellules HeLa transfectées avec Halo-BRD4 (A) ou Halo-HDAC1 (B) marqué par fluorescence avec le ligand TMR. (A) l'expression de Halo-BRD4 est limitée vers le noyau et (B) l'expression halo-HDAC1 est principalement nucLear. Le côté gauche de panneaux est le canal fluorescent et le côté droit est une superposition du canal de fluorescence avec le canal DIC pour chacun. Les images ont été acquises sur un microscope confocal équipé d'un + CO 2 chambre environnementale 37 ° C en utilisant des filtres appropriés. Barres d'échelle = 20 um.
Discussion
Présentés ici sont deux protéines de fusion, Halo et Halo BRD4-HDAC1, caractérisé en cellules de mammifères pour l'expression eucaryotes, les protéines et l'isolement activité complexe, et la localisation cellulaire. En travaillant à travers ces différents protocoles, il ya plusieurs étapes importantes pour la réussite de chaque expérience. Comme c'est le cas avec n'importe quelle protéine de fusion, le niveau d'expression et le placement de l'étiquette elle-même peut être critique pour le maintien de la physiologie. Il est donc important de considérer que les fusions C-terminal N-et / ou devront être conçus si la connaissance préalable ou de travailler avec une autre étiquette n'a pas été démontrée pour la protéine particulière de choix. En ce qui concerne l'expression, si le niveau est trop élevé, la dilution de l'ADN peut être effectuée au cours de la transfection ou l'utilisation de vecteurs avec des promoteurs plus faibles sont possibles pour atteindre le niveau qui est approprié. Des travaux antérieurs ont été réalisées montrant l'isolement efficace des complexes macromoléculaires endogène levels d'expression 8, permettant le travail à de très faibles niveaux d'expression. Si possible, les études de localisation cellulaire seraient également en mesure de donner un aperçu quant à la position optimale de l'étiquette de placement ainsi que le niveau d'expression relatif nécessaire pour la physiologie appropriée.
Une fois que les protéines de fusion sont prêts pour des expériences déroulants, pour obtenir le maximum de succès avec le protocole, il est très important de suivre les délais recommandés dans la lyse, la reliure et sections de lavage, comme l'un des plus grands avantages est la vitesse de l'isolement complexe processus. Si l'une de ces étapes sont allongés dans le temps, comme est nécessaire pour une méthode de capture à base d'anticorps, il existe un risque de dissociation complexe ou non spécifique augmentation de la liaison 8. Même si les temps sont raccourcis lors de la lyse cellulaire ou de liaison, les cellules ne peuvent pas être complètement lysées ou efficacement capturés respectivement. Si le nombre de lavages est dim.assouplissement ou un bon mélange de la résine ne se produit pas au cours des lavages de liaison ou, alors les niveaux de protéines non spécifiques fond seront augmentés. En outre, les moyens de lyse est très importante par rapport aux l'efficacité de liaison à la résine. Les tentatives de Soniquer les échantillons, éliminer le détergent recommandé, ajouter SDS ou autre détergent puissant, et / ou comprendre AEBSF inhibiteur de la protéase se traduira par la réduction ou la perte de la liaison de protéines de fusion et de leurs complexes de la résine.
Les méthodes existantes pour l'isolement complexe de cellules de mammifères et protéomique lutte de l'analyse humaine avec le défi de la réduction fond dans l'analyse par spectrométrie de masse 16. Cela a été tellement importante que un dépôt de protéines contaminantes a été créé par de nombreux groupes de spectrométrie de masse 16. Fond dans les échantillons spectrométrie de masse déroulants peut être définie comme tout ce qui empêche l'identification devéritables interacteurs de la protéine appât. En tant que telle, le fond peut provenir de protéines contaminantes non spécifiques ou aussi de fortes concentrations de protéine appât ou anticorps utilisés pour précipiter les protéines d'appât. Un travail important a été fait pour optimiser à la fois le protocole d'excursion basse présentée ici, ainsi que la résine pour minimiser le niveau des protéines contaminantes non-spécifiques dans le processus de pulldown. Ceci est évident dans les gels de coloration d'argent et une analyse par spectrométrie de masse de la commande (figure 2). Pour faire face aux niveaux élevés de protéine appât ou des anticorps qui peuvent être tout aussi préjudiciable que les contaminants et à laquelle d'autres méthodes de lutte, le menu déroulant avec SDS élution est recommandé (Protocole section 2.4). En raison de la fixation covalente à la résine, ce procédé laisse la majorité de la protéine de fusion de départ lié de manière covalente à la résine. Un faible pourcentage d'appât est observé dans l'analyse par spectrométrie de masse, qui est censéde se produire par hydrolyse, mais il ne présente pas un problème pour la détection d'autres interactions faibles ou transitoires 8.
Comme mentionné dans l'introduction, des avancées significatives dans la protéomique ont été permis par des avancées significatives dans la spectrométrie de masse 1,7. Par conséquent, il est important de mettre en évidence les paramètres importants du choix de l'analyse de spectrométrie de masse pour déconvoluer le mélange de protéines obtenues dans les pulldowns. Instrumentation doit être robuste et capable de routine et de manière efficace l'analyse d'échantillons contenant une petite quantité de protéines, souvent inférieure à <1 pg. Chromatographie échelle nanométrique impliquant 50-75 um internes colonnes diamètre HPLC avec des débits de l'ordre de 100-300 nl / min est typiquement utilisé pour la compatibilité avec les petites tailles d'échantillon et de maximiser la sensibilité du spectromètre de masse. Afin de maximiser l'information acquise dans une analyse unique état of les spectromètres de masse de pointe capables d'acquérir des spectres de masse à haute résolution sur une échelle de temps compatible avec les séparations à l'échelle nanométrique précités, ≥ 10 Hz, sont généralement employés. Ces instruments ont des niveaux de sensibilité et de attomolar peuvent acquérir régulièrement des données avec les sous précurseur ppm et d'ions produit tolérances d'erreur de masse. Ces performances permettent d'augmenter le rendement du nombre de protéines identifiées et la confiance associée à ces identifications.
Avec ces données, nous démontrons localisation physiologique cellulaire, la protéine adéquate: les interactions entre protéines ainsi que le potentiel pour la découverte de nouvelles interactions, et l'isolement de complexes actifs tout en utilisant une seule construction. En effet, les technologies alternatives peuvent être utilisées pour chacun de ces différents aspects, mais probablement pas pour autant 23,24. Grâce à la technologie HaloTag, une approche polyvalente peut être utilisée, en avançant protéomiqueics études et l'obtention d'une compréhension plus complète de la fonction des protéines dans des cellules de mammifères.
Disclosures
Frais de publication de cet article sont parrainés par Promega Corporation. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy et Marjeta Urh sont des employés de Promega Corporation, le propriétaire du commerce de la cession de brevets de la technologie HaloTag et ses applications. Michael Ford, Richard Jones, Ravi Amunugama, et David Allen sont des employés de MSBioworks, qui fournit des services de spectrométrie de masse décrites dans ce manuscrit.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Martin Rosenberg, Gary Tarpley, et le Dr Keith Wood pour le soutien de ce travail, et le Dr James Cali pour la lecture critique du manuscrit. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, et MU sont des employés de Promega Corporation. MF, RJ, RA, et DA sont des employés de MS Bioworks, LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
| HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
| Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
| PBS - tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
| HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
| HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
| HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
| HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
| HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
| HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
| HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
| HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
| ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
| HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
| PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
| 4% paraformaldehyde/0.2 M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
| Ethanol | |||
| Tissue culture vessels and dishes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
| Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-27 G needle could also be used |
| Microcentrifuge | |||
| Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
| Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
| Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
| Fluorescent Microscrope (555 nm Ex/585 nm Em) | For optional imaging |
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