Summary
Her en roman region av interesse for analyse basert på sortering best tilpasning ellipser tilordnet regioner i positivt signal i løpet av to-dimensjonale tid lapse bildesekvenser blir demonstrert. Denne algoritmen kan mulig etterforskere til omfattende analysere fysiologiske Ca 2 +-signaler med minimal brukerundersøkelser og skjevhet.
Abstract
Intracellulær Ca 2 +-signaler blir ofte studert med fluorescerende Ca 2 + indikatorfargestoffer og mikroskopi teknikker. Imidlertid er kvantitativ analyse av Ca 2 +-avbildningsdatatidskrevende og utsatt for skjevhet. Automatiserte signalanalysealgoritmer basert på området av interesse (ROI) detektering har blitt implementert for endimensjonal linje scan målinger, men det er ingen nåværende algoritme som integrerer optimalisert identifisering og analyse av ROIs i todimensjonale bildesekvenser. Her en algoritme for rask innsamling og analyse av ROIs i billedsekvenser, er beskrevet. Det benytter ellipser passer til støy filtrerte signaler for å bestemme optimal avkastning plassering, og beregner Ca 2 + signal parametere av amplitude, varighet og romlig spredning. Denne algoritmen ble gjennomført som en fritt tilgjengelig plugin for ImageJ (NIH) programvare. Sammen med analyse prosedyrer som er skrevet for åpen kildekode statistisk bearbeiding programvare R,denne tilnærmingen gir en høy kapasitet for rørledningen for å utføre rask statistisk analyse av forsøks utgang. Forfatterne foreslår at bruk av denne analysen protokollen vil føre til en mer komplett og objektiv karakterisering av fysiologiske Ca 2 + signalering.
Introduction
Ca 2 + er en allestedsnærværende andre messenger signalmolekyl og cytosoliske Ca 2 + nivåer er sterkt regulert. Intracellulær Ca 2 +-signaler er komplekse og inkluderer isolerte transienter, svingninger, og formeringsmateriale bølger 1-4. Romlig og tidsmessig kontroll av Ca 2 + er tenkt å ligge til grunn fysiologiske signal spesifisitet, og derfor analysen av Ca 2 + signalmønstre er av betydelig interesse for etterforskerne i flere felt fem.
Ca 2 +-stoffer som Fluo-4 og Fura-2 er vanligvis benyttes til å måle intracellulære Ca 2 +-signaler med fluorescens mikros 5-12. Vanligvis er time Ca 2 +-signaler vurderes som tidsavhengige endringer i gjennomsnittlig fluorescens innenfor en brukerdefinert område, eller region av interesse (ROI) 5,6,13 - 16. Foreløpig er manuell avkastningsanalyse både tidkrevende og arbeidskraft itende fordi det krever at brukerne å identifisere mange ROIs og utføre repetitive beregninger 17 - 19. Disse teknikkene kan også være gjenstand for betydelig brukerfeil, herunder innføring av kunstige signalmoduser og utelukkelse av lav amplitude eller diffuse signaler 18,20.
Automatiserte ROI algoritmer har tidligere blitt implementert ved hjelp av en rekke statistiske metoder for å bestemme optimal ROI plassering, men de har stort sett vært begrenset til analyse av linje scan eller pseudo-linje scan bilder, som begrenser analyse til en enkelt romlig dimensjon i tid 17 19 - 22. I tillegg er mange eksisterende algoritmer er ikke tilstrekkelig til å omfatte et mangfold av Ca 2 + utgivelsen hendelser som spenner fra periodiske, lokaliserte transienter å spre bølger 23,24. Omfattende vurdering av fysiologisk Ca 2 +-signaler blir ofte ytterligere komplisert ved nærvær av sterk bilde Artifopptre som forundrer signal til støy diskriminering i mange eksperimentelle systemer.
Tidligere, en automatisert ROI algoritme løsning til Ca 2 + signal forbigående deteksjon, implementert som en plugin for NIH ImageJ programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD), ble utviklet og validert 25,26. Denne algoritmen, kalt LC_Pro, er designet til å identifisere og analysere ROIs omfatter Ca 2 + signal transienter på to-dimensjonale tid forfalle bildesekvenser. Her en praktisk eksperimentelle protokoll og representative demonstrasjon av en anvendelse av algoritmen i porcin koronar endotel er forsynt, med ytterligere etterbehandling ved hjelp av den åpne kilde statistisk prosessering programvare R for å generere bruk grafiske utgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Vessel Dissection og bildebehandling
- Høste vev fra innenlandske unge griser som beskrevet i Martens et al 27. Plasser høstet svin høyre ventrikkel inn en polydimethylsiloxane (PDMS) nederst disseksjon skål inneholder HEPES bufret fysiologisk saltvann (PSS).
- Ved hjelp av et stereomikroskop, dissekere og fjerne et segment av den venstre anteriore nedstigende arterie (~ 8 mm lengde, 0,5 mm i diameter) fra det omgivende vev ved hjelp av tenger og fjær saks ved å fjerne segmentet fartøyet fra de omkringliggende hjerte vevslag. MERK: Pass på å ikke punktere åreveggen.
- Plasser en PDMS blokk (1 x 0,5 x 0,5 cm) inn i disseksjon fatet, og bruke en nål for å feste den til bunns. Skjær en ca 40 mikrometer i diameter wolfram ledningen inn tolv ~ segmenter 0,3 cm lengde, forming micropins, og plassere disse i fatet. Ved hjelp av pinsetter, feste en ende av segmentet fartøyet til blokken med en micropin.
- Sett forsiktig små fjær saksen i fartøyet lumen, og kuttet i lengderetningen nedover den ene siden av fartøyet til å åpne det fullstendig. Orientere åpnet fartøy segmentet med endotelet opp.
- Bruk de rester micropins å sikre grensene for åpnet fartøy segmentet å blokkere slik at fartøyet danner et flatt rektangel. MERK: Micropin plater skal være bøyd til 90 ° og settes til i flukt med blokkoverflaten. Forsiktighet bør utvises for å strekke fartøyet forberedelse uten overstrekking; endelige bredden bør være ~ 1,5 ganger den starter unstretched bredde.
- Forbered et lite volum (~ 1 ml) av Fluo-4 AM lasting løsning ved å blande Fluo-4 AM (10 mM) oppløst i DMSO med Pluronic (0,03%) i en HEPES-bufret PSS (inneholdende i mM: 134 NaCl, 6 KCl , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 glukose), og sett hele blokken inn i laste-løsning i ca 40 min ved romtemperatur i mørke.
- Etter lasting, vaske blokken i HEPES bufretPSS for 5-10 min.
- Monter blokk på 50 til 100 mikrometer tykke avstandsstykker i et dekkglass bunnkammer inneholdende HEPES-bufret PSS. MERK: Metallpinner kan brukes som avstandsstykker og sikre segmentet fartøyet er vendt nedover og ikke berøre avstandsstykker.
- Plasser kammeret i fasen av et invertert mikroskop utstyrt for konfokal avbildning, og fokusere på endotelial cellelaget.
- Capture time lapse bildesekvenser av basal relativ fluorescens for ~ 3 min på 20X forstørrelse og en bildefrekvens på ~ 8 bilder per sekund ved hjelp confocal bildesekvens oppkjøpet programvare.
- Etter ~ 3 min med å samle inn basal fluorescens, erstatte HEPES bufret PSS løsning med samme volum (~ 1 ml) av substans P (100 pM) oppløst i HEPES bufret PSS, og rekord for en tredjepart 3 min.
2. Automatisert analyse
- Gjengi bildesekvens (r) av fluorescerende kalsium aktivitet fra confocal oppkjøpet programvare som 8 bit, grayscale '. tif' format filer uten skala informasjon.
- Åpen ImageJ, klikk "åpne" i filmenyen, og velg riktig bildesekvensen i explorer vinduet for å se bildesekvensen (r) i ImageJ.
- Bestem en passende ROI diameter ved hjelp av den rektangulære ROI verktøy for å beregne de øvre og nedre grenser av den romlige spredningen av aktivitet i bildesekvensen (e). MERK: Gjennomsnittlig rektangulær diameter er et passende valg for ROI diameter.
- Opprett en ny mappe på harddisken, og legge til bildesekvensen (e) inn i mappen katalogen.
- I ImageJ, klikk på 'plugins' vinduet, og klikk deretter på 'LC_Pro' for å starte analysen.
- Oppgi ROI diameter verdi og velg filteret terskelverdi (enten 0,05 eller 0,01).
- Klikk på 'behandling' boksen og angi tidspunktet verdier umiddelbart før og etter at stoffet ble lagt inn (i sekunder).
- Klikk "OK", oggå inn i bildesekvensen katalogen til filutforskeren vinduet.
Tre. Grafisk Output
- Last ned R versjon 3.0.2 fra http://www.r-project.org/ .
- Åpne 32 bit versjon av R.
- Klikk på "File", deretter "open script 'og velg' traceplot.R 'R script for generering av grafiske eksperimentelle rapporter.
- Installer kalibrerings, og gplots pakker ved å velge 'pakker', 'installere pakker ", og velge de appropirate pakker.
- Klikk "Fil" og deretter "endre katalogen 'kommando, og bruker explorer vinduet for å velge katalogen som tilsvarer LC_Pro analyse utgang.
- Klikk på manuset vinduet og deretter på 'kjøre all-kommandoen for å kjøre skriptet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tilpasset algoritme, LC_Pro, ble utviklet og implementert for å utføre automatisert analyse av Ca 2 + dynamikken på confocal bildesekvenser. Som vist i figur 1, benytter algoritmen sekvensiell behandling av moduler som A) gjenkjenner og sporområdene av dynamisk Ca 2 + endre ovenfor statistisk (p <0,01) støy, B) å definere regioner av interesse (ROI) automatisk ved aktive sete-sentre, og C) beregne gjennomsnittlig fluorescensintensiteter på Rois å bestemme spesifikke hendelses parametere. En grafisk oversikt over algoritmen er vist ved hjelp av datagenererte Gaussian pulser av kjente intensitet og plassering (figur 2). Signalpulser (Tall 2A og B) ble konvertert til binær bruke z-score for en standard normalfordeling, og best tilpasning ellipser ble tildelt pixel loci ovenfor signal terskel (figur 2C). En ellipse sortering algoritme ble brukt til fastsettelsenne optimal avkastning plassering (figur 2D). ROI mener intensitet versus tid ble så målt og signal parametere av amplitude, varighet og romlig spredning ble beregnet (figur 2E). Denne analysen tilnærming ble brukt for å vurdere cellular Ca 2 + dynamikken i intakt blodåreendotelets. Nærmere bestemt ble konfokal avbildning utført i åpnet svin koronare arterier som beskrevet i figur 3, og algoritmen ble anvendt frakoblet for å kvantifisere distinkte Ca 2 +-parametere. For disse forsøk ble det gjort kontinuerlige opptak før og etter tilsetning av endotelial stimulus, substans P (SP, 100 pM), og LC_Pro analyse ble deretter utført. For å skalere signalet innenfor hver ROI, ble grunnlinjene avledet som lineære regresjoner av ROI intensitet over eksperimentelle utdanning (figur 4). Mean signalintensitetsverdier ble beregnet for hver ROI (Figur 4A), og verdier over gjennomsnittet var trunc rerte til middelverdien, og en lineær regresjon ble utført på nøyaktig signallinjen (figur 4B). Til slutt ble det rå intensitetsverdier dividert med verdien av regresjonslinjen for å konvertere verdier for folde endring over grunnlinjen (fig. 4C). Figur 5 viser et representativt eksperiment, inkludert bilder av Ca 2 +-avhengige fluorescens i endotelet (figur 5A), akkumulere binære masker av total Ca 2 + signal oppdages innenfor samplet feltet (Figur 5B), og opptak av gjennomsnittlig fluorescens ved hver ROI (figur 5C) før og etter SP behandling. Etterfølgende parameter-analyse ble utført ved hjelp av R-programvare. Resulterende histogrammer som viser det forsterkende effekten av SP på hendelses amplitude, varighet og romlig spredning (figur 6).
560/51560fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Signalflytdiagrammer av algoritmen prosesser (dette tallet ble hentet med tillatelse fra Francis et al.) 24. Algoritmen ble organisert i tre seksjoner: Bildebehandling, event behandling, og region av interesse (ROI) behandling. Bildesekvenser er innspill til flyten kjeden, og hendelsesstatistikk genereres som endelige resultatet. Den bildebehandling (A) subrutine av algoritmen konverterer input bildesekvensen i en liste over best tilpasning ellipser av terskelverdier, ved hjelp av z-score for en standard normalfordeling og ImageJ partikkel analyse. Hendelse behandling (B) er en sorteringsrutine som brukes for å bestemme optimal ROI posisjon ved å organisere ellipse steder i hendelses "sites" av gangen. Etter bety intensitet målinger er tatt på hver ROI, er statistiske parametre for hver hendelse og området beregnes av ROI Bearbeidelsesrutinen (C </ Strong>) til å generere det endelige resultatet. Bkgd, bakgrunn; AVG, gjennomsnittlig. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Demonstrasjon av automatiserte ROI oppkjøp og signaldeteksjon ved hjelp av en datagenerert Gaussian puls (dette tallet ble tilpasset med tillatelse fra Francis et al.) 24. En enkelt datamaskin-genererte signalpuls (A) er innleiret i tilfeldig bakgrunnsstøy. Den grå skala bildesekvens ble filtrert for å fjerne statiske bakgrunnsbildeelementverdier (B) og omdannet til binære hjelp terskelpikselintensitetsverdier av P <0,05 beregnes ved standard stillingen (C). ImageJ partikkel analyse algorithms ble deretter brukt til bildesekvensen for å tildele med best tilpasning ellipser til piksel loci innenfor hver ramme. En roman algoritme ble brukt til å gruppere ellipser i diskrete timelige "hendelser" og finne den optimale posisjonen for hver ROI basert på gjennomsnittlig ellipse sentrum (D). En avkastning av brukerdefinerte radius blir deretter plassert på hver posisjon (stiplet sirkel). Midlere intensitet verdier i en ROI blir beregnet for hver ramme og skalert ved hjelp av en lineær baseline tilnærming. Peak amplitude er identifisert som lokale maksima ovenfor P <0,05 som definert av standard score for en tilsvarende avkastning sporing (E). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Porci ne koronar disseksjon protokollen. Omtrent 0,5 mm diameter x 8 mm lengde grener av venstre fremre nedstigende arterie (første bilde, stiplet sirkel) ble dissekert fra den omkringliggende hjertemuskelen. Fartøyssegmenter ble trimmet av omkringliggende adventitial vev og skåret på langs med liten saks (andre bilde). Deretter ble de åpnede fartøyer festet flatt til en PDMS blokk hjelp av gode wolfram ledninger (tredje bilde). Montert kar-segmenter ble lastet med Fluo-4 Ca 2 + indikatorfargestoff, vasket, og deretter plassert i et dekkglass bunnet avbildning kammeret. Bilder ble samlet på 20X forstørrelse (488 ex., 510 em.) På 8,0 bilder per sekund ved hjelp av en invertert konfokal mikroskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
0/51560fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4. ROI bety intensitet baseline tilnærming. Etter gjennomsnittlig intensitet kontra tidsmålinger (heltrukne linjer) for hver ROI, er de rå intensitetsverdier skalert til F/F0 hjelp av følgende baseline tilnærming metoden. Den midlere signalintensitet under kontrollperioden (stiplet linje) blir beregnet fra brukerdefinert kontroll-og behandlingsintervallverdier (A). Den tidsavhengige signalintensitetskurven blir deretter avkuttes over den midlere styre intensiteten til det midlere styre intensitet til å filtrere aktivitet fra baseline approksimasjon, og en lineær regresjon utføres på den resulterende kurve (stiplede linjer) (B). Endelig er de rå intensitetsverdier skalert til den beregnede lineære baseline (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Representative resultater fra LC_Pro analyse av basal og stimulert Ca 2 +-dynamikk. Tidsforløp bilder av et inngangsbildesekvens for basal samplingsintervall (A, venstre panel), etterfulgt av en substans P-stimulert samplingsintervall (A, høyre panel ) er vist i gråtoner. Time Lapse bildesekvenser av beste fit ellipser for basal og stimulert intervaller (B) ble gjengitt av LC_pro. Til slutt, er tidsavhengige skalerte intensitetskurver fra hver automatisk posisjonert region av interesse (ROI) vist (C).
Figur 6. Histogramsparameter utdelinger fra et representativt eksperiment (Figur 4). Histogrammer fra parametere av peak amplitude (F/F0), varighet på ½ max (sek), og maksimal romlig spredning (mikrometer 2) for både kontroll (venstre kolonne) og substans P-stimulert (høyre kolonne) hendelser fra et representativt eksperiment var gjengitt ved hjelp av R til grafisk behandle produksjonen fra LC_pro. Spesielt, Substans P stimulering utvidet antall hendelser, og forårsaket en betydelig høyre shift i median amplitude og varighet av Mann-Whitney U-test (p <0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dekoding komplekse Ca 2 +-signaler på celle og flercellet nivå vil kreve strenge eksperimentelle og analytiske tilnærminger. Her er en tilnærming som er beskrevet i denne tiden løst confocal bildesekvenser av Ca 2 + avhengig fluorescens utsettes for en automatisert analyse som identifiserer og kvantifiserer statistisk relevante Ca 2 +-signaler innenfor intakte cellulære felt I den konkrete saken som presenteres, en arterie segmentet var isolert fra gris hjerte, låste åpnet for å utsette endotelet, lastet med Ca 2 + indikator Fluo-4 AM, utsatt for confocal bildebehandling, og evalueres med tilpassede algoritme LC_Pro. Denne algoritmen er utformet for å 1) oppdage og sporområdene av dynamisk Ca 2 + endre ovenfor statistisk (p <0,01) støy, 2) definere områder av interesse (ROI) automatisk ved aktive sete-sentre, og 3) analysere gjennomsnittlig fluorescensintensiteter på Rois å bestemme spesifikke hendelses parametere. Tilnærmingenseirer store begrensninger av biologisk signale forskning ved å redusere brukerfeil og bias, noe som reduserer offline analyse tid, og gi en komplett indeks av signaler over et felt å skjelne representative profiler eller mønstre. Utgang fra LC_Pro videreforedles gjennom R skript, gi full parameter rapporter for enkelte eksperimenter, blant annet høy kvalitet grafisk produksjon.
Flere trinn er viktig for riktig utførelse av den beskrevne teknikk. Vevet disseksjon prosedyre (trinn 1.1.1) må utføres omhyggelig for å unngå denudation eller skade av endotelial cellelaget. I tillegg må bildesekvenser være i riktig format (trinn 2,1) for den automatiserte regionen av interesse algoritme for å fungere korrekt. For eksempel, hvis det er skala informasjon tilknyttet filen, regioner av interesse blir feilaktig plassert i henhold piksel steder, i stedet for den skalerte enhets steder. Også velge en passende region av interesse diameter er kritisk for å utføre fullstendig automatisert analyse av det fluoriserende aktivitet i en bildesekvens. For liten diameter verdi kan resultere i redundante målinger, mens en for stor diameter vil resultere i utelukkelse av små signaler.
Potensielle fallgruver ved denne teknikken først og fremst knyttet til følsomheten av automatisert analyse til xy skift i innspilte bildesekvenser og å signalisere metning og / eller bleking, noe som kan resultere i falske positive eller falske negative resultater. Dimensjonale fonner eller skift kan rettes direkte gjennom bruk av stabelen registrering programvare og nøyaktig angivelse av intervaller hvor forstyrrelsene er innført. Gråtoner og ROI diameter parametere kan også være optimalisert for en gitt forberedelse i forkant av datainnsamling for å standard rå datasett.
Fordi det fungerer som en standard tilnærming for noen dynamisk fluorescens signal, analysen beskrevet here er egnet for en mangfoldig kropp av applikasjoner. I blodkar, er denne metoden som brukes for å definere karakteristisk fysiologiske og patofysiologiske signal modaliteter i flere vaskulær senger under basal og stimulert forhold 25,26. Det blir også brukt i den automatiserte sporing av Ca 2 +-bølger. Til syvende og sist, vil en slik global automatisert analyse være en avgjørende krumtappen i å tyde romlig og tidsmessig komplekse bio-signaler og i å etablere ny celle og multi-cellemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535, og MOP-93676.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| Stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| Forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| Pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| Metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| Cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| Spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| ImageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
References
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).
- Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
- Hayashi, H., Miyata, H.
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
- Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5 (3), (2010).
- Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).
- Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).
- Paredes, R. M., et al.
- Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).
- Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
- Gaspers, L. D., Thomas, A. P.
- Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).
- Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).
- Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).
- Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).
- Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).
- Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).
- Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).
- Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).
- Abramoff, M. D., et al.
- Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).
- Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).
- Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
- Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).
