Summary
Här en ny region av intresse analysprotokoll baserat på sortering bäst-fit ellipser tilldelats regioner i positiv signal inom tvådimensionell time lapse bildsekvenser visas. Denna algoritm kan göra det möjligt för utredarna att övergripande analysera fysiologiska Ca 2 +-signaler med minimal användarinmatning och partiskhet.
Abstract
Intracellulär Ca 2 +-signaler är vanligen studeras med fluorescenta Ca2 +-indikator-färgämnen och mikroskopi tekniker. Emellertid är kvantitativ analys av Ca2 + avbildningsdata tidskrävande och föremål för bias. Automatiserade signalanalys algoritmer baserade på regionen av intresse (ROI) upptäckt har genomförts för endimensionell linje scan mätningar, men det finns ingen aktuell algoritm som integrerar optimerad identifiering och analys av ROI i tvådimensionella bildsekvenser. Här en algoritm för snabb insamling och analys av ROI i bildsekvenser beskrivs. Den utnyttjar ellipser passa till buller filtrerade signalerna för att bestämma optimal investering placering, och beräknar Ca 2 +-signalparametrar för amplitud, varaktighet och spatial spridning. Denna algoritm genomfördes som en fritt tillgänglig plugin för ImageJ (NIH) programvara. Tillsammans med analys skript skrivna för öppen källkod statistisk programvara för R,denna metod ger en pipeline med hög kapacitet för att utföra snabb statistisk analys av experimentella utgång. Författarna föreslår att användningen av denna analysprotokoll kommer att leda till en mer fullständig och opartisk karakterisering av fysiologiska Ca2 +-signalering.
Introduction
Ca2 + är en allestädes närvarande andra budbärare signalmolekyl och cytosoliska Ca 2 +-nivåer är starkt reglerade. Intracellulär Ca 2 +-signaler är komplexa och innefattar isolerade transienter, oscillationer, och föröknings vågor 1 - 4. Rumslig och tidsmässig styrning av Ca2 + tros ligga bakom fysiologisk signal specificitet, och därmed analysen av Ca 2 + signalmönster är av stort intresse för forskare inom flera fält 5.
Ca2 +-indikatorfärgämnen såsom Fluo-4 och Fura-2 används allmänt för att mäta intracellulära Ca 2 +-signaler med fluorescensmikroskopi 5-12. Normalt är tids Ca 2 +-signaler utvärderas som tidsberoende förändringar i medelvärdet fluorescens inom ett användardefinierat område eller region av intresse (ROI) 5,6,13 - 16. För närvarande är manuella ROI-analys, både tidsödande och arbets ifattande eftersom det kräver användarna att identifiera många ROI och utföra repetitiva beräkningar 17-19. Dessa tekniker kan också vara föremål för betydande användarfel, däribland införandet av artificiella signallägen och uteslutande av låg amplitud eller diffusa signaler 18,20.
Automatiserade ROI detekteringsalgoritmer har tidigare genomförts med användning av olika statistiska tillvägagångssätt för att bestämma optimal investering placering, men de har i allmänhet varit begränsad till analys av linjeavsökning eller pseudo-line skanna bilder, vilket begränsar analysen till en enda rumsdimension i tiden 17, 19 - 22. Dessutom har många befintliga algoritmer inte är tillräckliga för att omfatta den mångfald av Ca2 +-frisättning händelser som sträcker sig från periodiska, lokaliserade transienter att föröknings vågor 23,24. Omfattande utvärdering av fysiologiska Ca 2 +-signaler är ofta kompliceras ytterligare av att det finns betydande bild artifagera som förvirrar signal till diskriminering brus i många experimentella system.
Tidigare har en automatiserad ROI upptäckt algoritm lösning på Ca2 + signal gående upptäckt, genomförs som en plugin för NIH ImageJ programvara (National Institutes of Health, Bethesda, MD), utvecklades och validerades 25,26. Denna algoritm, kallad LC_Pro, har utformats för att identifiera och analysera ROI omfattar Ca 2 + signaltransienter i tvådimensionella tidsförlopp bildsekvenser. Här en praktisk försöksprotokoll och representativ demonstration av en tillämpning av algoritmen i griskranskärls endotel tillhandahålls, med ytterligare efterbehandling med hjälp av öppen källkod statistisk programvara för R för att generera användbar grafiska produktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fartyg Dissection och bildbehandling
- Harvest vävnad från inhemska unga grisar som beskrivs i Martens et al 27. Placera skördade svin höger kammare i en polydimetylsiloxan (PDMS) botten dissektion maträtt som innehåller HEPES buffrad fysiologisk saltlösning (PSS).
- Med hjälp av ett stereomikroskop, dissekera och avlägsna ett segment av den vänstra främre nedåtgående kransartären (~ 8 mm längd, 0,5 mm i diameter) från omgivande vävnad med hjälp av pincett och sax våren genom att avlägsna kärlsegmentet från de omgivande hjärtvävnadsskikten. OBS: Var noga med att inte punktera kärlväggen.
- Placera en PDMS-block (1 x 0,5 x 0,5 cm) i dissektion skålen, och använda en nål för att fästa den på undersidan. Skär ett ca 40 nm i diameter volfram tråd i tolv ~ 0,3 cm längd segment, som bildar micropins, och placera dem i skålen. Använd pincett, säkra ena änden av kärlet segmentet till blocket med en micropin.
- Försiktigt in små våren sax i kärllumen, och skär på längden längs ena sidan av fartyget för att öppna den helt. Orientera öppnade fartygssegment med endotelet upp.
- Använd de återstående micropins att säkra gränserna för den öppnade kärlsegment till blocket, så att kärlet bildar en platt rektangel. Anmärkning Micropin toppar bör böjas till 90 ° och sattes in tills jämnhöjd med blockets yta. Försiktighet bör vidtas för att sträcka beredningen fartyg utan översträckning; slutlig bredd bör ~ 1,5 gånger utgångs osträckta bredd.
- Bered en liten volym (~ 1 ml) av Fluo-04:00 laddningslösningen genom blandning av Fluo-4 AM (10 pM) löst i DMSO med pluronic (0,03%) i en HEPES-buffrad PSS (innehållande i mM: 134 NaCl, 6 KCl , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 glukos), och sätt in hela blocket i laddningslösning för cirka 40 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Efter laddning tvättas blocket i HEPES-buffradPSS för 5-10 min.
- Montera blocket på 50-100 ìm tjocka distanser i en coverglass nedre kammare som innehåller HEPES buffrad PSS. OBS: Metall stift kan användas som distanser och se till att fartyget segmentet är vänd nedåt och inte röra distanserna.
- Placera kammare på scenen av ett inverterat mikroskop utrustat för konfokal avbildning, och fokusera på den endoteliala cellskiktet.
- Capture intervallbildsekvenser av basal relativ fluorescens för ~ 3 min vid 20X förstoring och en bildfrekvens på ~ 8 bilder per sekund med hjälp av konfokal bildsekvens förvärv programvara.
- Efter ~ 3 min av inspelning basal fluorescens, ersätta HEPES-buffrad PSS-lösning med samma volym (~ 1 ml) av substans P (100 pM) löst i HEPES-buffrad PSS och rekord för ett tilläggs 3 min.
2. Automatiserad analys
- Render bildsekvens (er) av fluorescerande kalcium aktivitet från konfokala förvärv programvara som 8 bitar, grayscale ". TIF-format utan skalinformation.
- Öppna ImageJ, klicka "öppna" i Arkiv-menyn, och välj lämpligt bildsekvensen i Explorer-fönster för att visa bildsekvensen (er) i ImageJ.
- Bestäm en lämplig ROI diameter med hjälp av rektangulära ROI verktyg för att uppskatta de övre och nedre gränserna av den rumsliga utbredningen av verksamhet i den bildsekvens (er). OBS: Den genomsnittliga rektangulära diametern är ett lämpligt val för ROI diameter.
- Skapa en ny mapp på datorns hårddisk, och lägga till bildsekvens (er) till mappen katalogen.
- I ImageJ, klicka på "plugins" fönstret, klicka sedan på "LC_Pro" för att starta analysen.
- Ange värde ROI diameter och välj filtertröskelvärdet (antingen 0,05 eller 0,01).
- Klicka på "drogbehandling" kryssrutan och anger tidspunktsvärden omedelbart före och efter drogen tillsattes (i sekunder).
- Klicka på "OK", ochange bildsekvensen katalog i utforskaren fönstret.
3. Grafisk Utgång
- Ladda ner R version 3.0.2 från http://www.r-project.org/ .
- Öppna 32 bitars versionen av R.
- Klicka på "file" och sedan "öppna script" och välj "traceplot.R" R-skript för att generera grafiska experimentella rapporter.
- Montera kalibrera och gplots paket genom att välja "paket", "installera paket", och välja tillämpliga best paket.
- Klicka på "Arkiv" och sedan "byt katalog"-kommandot, och använda Explorer-fönster för att välja den katalog som motsvarar LC_Pro analysutgången.
- Klicka på skriptfönstret och sedan på "kör alla" kommandot för att köra skriptet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En anpassad algoritm, LC_Pro, utvecklades och genomförs för att utföra automatiserad analys av Ca 2 + dynamik på konfokala bildsekvenser. Som visas i figur 1, utnyttjar algoritmen sekventiella processmoduler som A) upptäcka och spåra platser av dynamisk Ca2 + förändras över statistisk (p <0,01) buller, B) definiera områden av intresse (ROI) automatiskt vid aktiva site centra, och C) beräkna genomsnittliga fluorescensintensiteter på ROI för att bestämma specifika parametrar händelse. En grafisk översikt av algoritmen visas med hjälp av datorgenererade Gaussian pulser med känd intensitet och placering (figur 2). Signalpulser (figur 2A och B) omvandlades till binära använda z-poäng för en standardiserad normalfördelning, och bäst-fit ellipser delades pixel loci över signaltröskel (figur 2C). En ellips sorteringsalgoritm användes för bestämningne optimal ROI placering (figur 2D). ROI menar intensitet som funktion av tiden mättes sedan och signalparametrar för amplitud, varaktighet och rumslig spridning beräknades (Figur 2E). Denna analys metod tillämpades för att bedöma cellulära Ca 2 + dynamik i intakt vaskulär endotel. Specifikt konfokal avbildning utförs i öppnade svinkransartärer såsom beskrivs i figur 3, och algoritmen användes offline för att kvantifiera distinkta Ca 2 +-parametrar. För dessa experiment var kontinuerliga inspelningar gjordes före och efter tillsats av den endoteliala stimulus, substans P (SP, 100 pM) och LC_Pro analys därefter utförs. För skalning signal inom varje ROI, var baslinjer härledas som linjära regressioner ROI intensitet under den experimentella tidsförloppet (Figur 4). Mean signalintensitetsvärdena beräknades för varje ROI (Figur 4A), och värden över medelvärdet var AVKORTA ated till medelvärdet och en linjär regression utfördes för att approximera signal baslinjen (Figur 4B). Slutligen tillsattes råa intensitetsvärdena divideras med det värde på regressionslinjen för att konvertera värdena till fold change över baslinjen (figur 4C). Figur 5 visar ett representativt experiment, inklusive bilder av Ca 2 +-beroende fluorescens i endotelet (figur 5A), ackumuleras binära masker av totalt Ca2 +-signal detekteras inom den samplade fält (Figur 5B), och inspelningar av genomsnittlig fluorescens vid varje ROI (figur 5C) före och efter SP behandling. Efterföljande parameter analys utfördes med hjälp av R-programvara. Resulte histogram visar den förstärkande effekten av SP på händelse amplitud, varaktighet och rumslig spridning (Figur 6).
560/51560fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Signalflödesscheman av algoritmen processer (denna siffra har erhållits med tillstånd från Francis et al.) 24. Algoritmen organiserades i tre delar: Bildbehandling, händelsehantering, och regionen av intresse (ROI) behandling. Bildsekvenser matas in i flödeskedjan samt statistik händelse genereras som slutliga kvaliteten. Bildbehandlings (A) subrutin av algoritmen omvandlar ingångsbildsekvensen till en lista över mest fit ellipser med tröskling, med hjälp av z-score för en standardiserad normalfördelning och ImageJ partikelanalys. Händelsehantering (B) är en sorterings subrutin används för att bestämma optimal ROI läge genom att organisera ellips platser i event "platser" av tiden. Efter betyda intensitet mätningar görs vid varje ROI, är statistiska parametrar för varje händelse och plats beräknas av ROI bearbetnings subrutin (C </ Strong>) för att generera den slutliga kvaliteten. BKGD, bakgrund; AVG, i genomsnitt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Demonstration av automatisk ROI förvärv och signaldetektering med hjälp av en datorgenererad Gaussian puls (denna siffra har anpassats med tillstånd från Francis et al.) 24. En enda datorgenererad signalpulsen (A) var inbäddad i slumpmässig bakgrundsljud. Gråskalan bildsekvens filtrerades för att avlägsna statiska bakgrundspixelvärden (B) och omvandlas till binära använder tröskelpixelintensitetsvärden för P <0,05 som beräknats av standard poäng (C). ImageJ partikelanalys algorithms applicerades sedan på bildsekvensen för att tilldela best-fit ellipser till pixel loci inom varje ram. En ny algoritm användes för att gruppera ellipser i diskreta tidsmässiga "händelser" och bestämma den optimala positionen för varje ROI baserat på medelvärdet ellipsens centrum (D). En ROI för användardefinierade radie placeras sedan på varje position (streckad cirkel). Medelintensitet värden inom en ROI beräknas för varje ram och skalas med användning av en linjär approximation baslinjen. Peak amplitud identifieras som lokala maxima över P <0,05 som definieras i standarden poäng för en motsvarande ROI spårning (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Porci ne kranskärls dissektion protokoll. Approximativt 0,5 mm diameter x 8 mm längd grenar av den vänstra främre nedåtgående kransartären (1. Bild, streckad cirkel) dissekerades från den omgivande hjärtmuskeln. Fartygssegment trimmades av omgivande adventitial vävnad och skär på längden med en liten sax (2: a bild). Därefter fick de öppnade fartyg nålas lägenhet till en PDMS-block med fina volframtrådar (3: e bild). Monterade fartygssegmenten laddades med Fluo-4 Ca 2 +-indikator-färgämne, tvättades och placerades därefter i en coverglass bottnad avbildningskammaren. Bilder samlades in vid 20X förstoring (488 ex., 510 em.) På 8.0 bilder per sekund med hjälp av ett inverterat konfokalmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
0/51560fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4. ROI innebär intensitet baslinjen approximation. Efter medelintensitet kontra tidsmätningar (heldragna linjer) för varje ROI, är råintensitetsvärden skalas till f/f0 med följande baslinjen approximationsmetod. Den genomsnittliga signalintensiteten (streckad linje) under kontrollperioden beräknas ur användardefinierade kontroll-och behandlingsintervallvärdena (A). Den tidsberoende signalintensitetskurva trunkeras över medelkontrollnivån till medelvärdet kontroll intensitet att filtrera aktivitet från baslinjen approximation, och en linjär regression utförs på den resulterande kurvan (streckade linjer) (B). Slutligen är de råa intensitetsvärden skalas till det beräknade linjära baslinjen (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Representativa resultat från LC_Pro analys av basal och stimulerad Ca 2 +-dynamik. Time lapse bilder av en ingångsbildsekvens av en basal samplingsintervall (A, vänster panel) följt av en substans P-stimulerad samplingsintervall (A, högra panelen ) visas i gråskala. Time lapse bildsekvenser för bästa passform ellipser för basal och stimulerad intervall (B) var utförda av LC_pro. Slutligen är tidsberoende skalade intensitetskurvor från varje automatiskt placerade regionen av intresse (ROI) som visas (C).
Figur 6. Histogramav parameterfördelningar från ett representativt experiment (Figur 4). Histogram från parametrar för maximal amplitud (f/f0), varaktighet vid ½ max (s), och maximal spatial spridning (ìm 2) för både kontroll (vänstra kolumnen) och substans P-stimulerad (höger kolumn) händelser från ett representativt experiment var återges med hjälp av R att grafiskt bearbeta utdata från LC_pro. Notably expanderad substans P stimulering antalet händelser, och orsakade en signifikant högerskift i median amplitud och varaktighet genom Mann-Whitney U-test (p <0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avkodning komplexa Ca 2 +-signaler på cellulär och flercelliga nivå kräver rigorösa experimentella och analytiska metoder. Här är en metod som beskrivs i vilken tid beslutade konfokala bildsekvenser av Ca2 + beroende fluorescens utsätts för en automatiserad analys som identifierar och kvantifierar statistiskt relevanta Ca 2 +-signaler inom intakta cellulära fält I det specifika fallet som presenteras, en artär segment isolerades från gris hjärta, nålas öppnas för att exponera endotel, lastad med Ca 2 + indikator Fluo-04:00, utsattes för konfokal avbildning, och utvärderas med den anpassade algoritmen LC_Pro. Denna algoritm är designad för att 1) upptäcka och spåra platser för dynamisk Ca2 + förändras över statistisk (p <0,01) buller, 2) definiera områden av intresse (ROI) automatiskt vid aktiva site centra, och 3) analysera genomsnittliga fluorescensintensiteter på ROI att bestämma specifika parametrar händelsehanterare. Det tillvägagångssättvinner stora begränsningar av forskning biologisk signalering genom att minska användarfel och fördomar, vilket kraftigt minskar offline analys tid, och ger en komplett index för signaler över ett fält för att urskilja representativa profiler eller mönster. Utgång från LC_Pro vidareförädlas genom R-skript, tillhandahålla fullständiga parameterrapporter för enskilda experiment, bland annat högkvalitativa grafiska produktionen.
Flera steg är viktiga för korrekt utförande av den beskrivna tekniken. Vävnads dissektion förfarande (steg 1.1.1) måste utföras noggrant för att undvika denudation eller skada på endotelceller lagret. Dessutom måste bildsekvenser vara i rätt format (steg 2.1) för automatisk regionen av intresse algoritm för att fungera korrekt. Till exempel, om det finns skal information i samband med filen, områden av intresse kommer att felaktigt placerade enligt pixel platser, snarare än de skalade enhetsplatser. Dessutom, att välja en lämplig region av intresse diameter är kritiskt för att korrekt utföra automatisk analys av den fluorescerande aktivitet inom en bildsekvens. För liten ett diametervärde kan resultera i redundanta mätningar, medan en alltför stor diameter resulterar i uteslutning av subtila signaler.
Potentiella fallgropar av denna teknik avser i huvudsak känslighet för automatiserad analys att xy förskjutningar i inspelade bildsekvenser och att signalera mättnad och / eller blekning, vilket kan resultera i falskt positiva eller falskt negativa resultat. Mått drivor eller skift kan riktas direkt genom användning av stack registrering programvara och korrekt benämning av intervaller där störningar införs. Gråskalenivåer och parametrar ROI diameter kan också optimeras för en viss förberedelse före datainsamling i syfte att standardisera rådatamängder.
Eftersom det fungerar som en standardmetod för någon dynamisk fluorescenssignal, beskrev analysen here är lämplig för en skiftande kropp av tillämpningar. I kärlsystemet är denna metod som används för att definiera karakteristiska fysiologiska och patofysiologiska signalformer i flera kärlbäddar inom basal och stimulerad villkor 25,26. Det är också tillämpas i det automatiska spårning av Ca2 +-vågorna. I slutändan kommer en sådan global automatiserad analys vara en viktig grundbult i dechiffrera rumsligt och tidsmässigt komplexa biologiska signaler och att etablera nya cell-och multi-cellmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health bidrag HL-085.887, HL-092.992, S10RR027535 och MOP-93.676.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| Stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| Forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| Pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| Metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| Cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| Spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| ImageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
References
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).
- Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
- Hayashi, H., Miyata, H.
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
- Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5 (3), (2010).
- Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).
- Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).
- Paredes, R. M., et al.
- Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).
- Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
- Gaspers, L. D., Thomas, A. P.
- Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).
- Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).
- Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).
- Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).
- Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).
- Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).
- Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).
- Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).
- Abramoff, M. D., et al.
- Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).
- Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).
- Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
- Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).
